Name: exogenous administration of microsomes-associated alpha-synuclein aggregates to primary neurons as a powerful cell model of fibrils formation
Uploaded: 2018-06-26T14:30:00
Duration: 9 min 16 s
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इस कार्य के लिए इतालवी विश्वविद्यालय और अनुसंधान मंत्रालय (MIUR) द्वारा कैरियर पुनर्एकीकरण अनुदान योजना (युवा शोधकर्ता के लिए RLM कार्यक्रम) और Scuola सामान्यीकृत िे के माध्यम से समर्थन दिया गया है. हम विश्वविद्यालय के मिनेसोटा, संयुक्त राज्य अमेरिका से प्रो माइकल ली धंयवाद, पीआरपी मानव A53T αS टीजी चूहों, जो समुच्चय से अलग कर रहे है प्रदान करने के लिए ।

WT और टीजी जानवरों के उपयोग को मंजूरी दी और प्रयोगशाला पशु कल्याण और प्रयोग के लिए राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय कानूनों द्वारा पूर्ण में अनुपालन किया गया था (EEC काउंसिल डायरेक्टर 86/609, 12 दिसंबर १९८७ और निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ, 22 सितंबर २०१०) । इस पत्र में वर्णित सभी प्रोटोकॉल हमारे संस्थान के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करते हैं ।
1. Microsomes का अलगाव-रोगग्रस्त A53T αS टीजी चूहों से जुड़े αS समुच्चय
<ol><li>homogenization बफर जो २५० मिमी सुक्रोज, 20 मिमी HEPES, 10 मिमी KCl, १.५ मिमी MgCl2, 2 मिमी EDTA, और 1x फॉस्फेट से बना है तैयार करें/ बर्फ पर बफर रखें ।</li>
	<li>Homogenize एक 1:10 में ताजा या जमे हुए ऊतक (डब्ल्यू/वी) बर्फ की मात्रा ठंडा homogenization बफर एक Teflon मूसल homogenizer का उपयोग कर, 10-15 स्ट्रोक के साथ ।</li>
	<li>स्थानांतरण प्रारंभिक homogenate (1-2 एमएल) एक microcentrifuge ट्यूब के लिए और १,००० × g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक प्रशीतित केंद्रापसारक का उपयोग करने में नाभिक और unअटूट कोशिकाओं के परिणामस्वरूप गोली (P1) में हटाने के लिए । P1 छोड़ें ।</li>
	<li>एक स्वच्छ microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatant (एस 1) स्थानांतरण और 4 ° c पर 20 मिनट के लिए १०,००० × जी में एस 2 के लिए एक प्रशीतित केंद्रापसारक का उपयोग करने के क्रम में दूसरा supernatant (S10) और गोली (P10) प्राप्त करने के लिए । नोट: P10 एक कच्चे झिल्ली की गोली है कि mitochondria और synaptosomes शामिल है । P10 छोड़ें ।</li>
	<li>स्थानांतरण supernatant (S10) करने के लिए एक पाली कार्बोनेट बोतल (> 1 एमएल) और १००,००० × g पर S10 के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए एक ultracentrifuge और एक निश्चित कोण रोटर (९० तिवारी) का उपयोग कर । नोट: supernatant शुद्ध cytosol अंश है, जबकि गोली, P100, microsomes जुड़े αS समुच्चय शामिल है ।</li>
	<li>homogenization बफर के ५०० µ एल के साथ P100 गोली reसस्पेंड । एक स्वच्छ microcentrifuge ट्यूब के लिए P100 स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १०,००० × जी में एक प्रशीतित केंद्रापसारक में केंद्रापसारक ।</li>
	<li>supernatant छोड़ें और homogenization बफ़र के १०० µ l के साथ P100 को पुनर्स्थगित करें । नोट: यह अंश microsomes-संबद्ध αS एग्रीगेट है ।</li>
	<li>बर्फ पर 2 एस के लिए Sonicate नमूने [सेट उत्पादन शक्ति 1 वाट (RMS)] । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।</li>
	<li>दिन के बाद, बीसीए विश्लेषण का उपयोग कर प्रोटीन राशि का निर्धारण ।</li>
</ol>2. वेस्टर्न ब्लाटर
नोट: microsomes-एसोसिएटेड αS समुच्चय के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन पश्चिमी दाग द्वारा मूल्यांकन किया जाता है ।
<ol><li>एक ढाल 4-20% एक ऊर्ध्वाधर ट्रो उपकरण पर Tris-glycine polyacrylamide जेल डाली ।</li>
	<li>microsomes-संबद्ध αS भिन्न, denaturing नमूना बफ़र में भंग की 1 µ g लोड करें ।</li>
	<li>एक अलग अच्छी तरह से, लोड प्रोटीन मानक मार्कर के 5 µ एल ।</li>
	<li>एक Tris/glycine/एसडीएस में १०० V पर जेल भागो बफर जब तक प्रोटीन मार्कर जेल के अंत तक पहुंचता है ।</li>
	<li>एक nitrocellulose झिल्ली एक बुनियादी कार्बोनेट बफर (10 मिमी नाको3, 3 मिमी NaHCO3, 20% मेथनॉल) O/N पर 4 ° c, २०० mA, पर स्थिर का उपयोग कर प्रोटीन स्थानांतरण ।</li>
	<li>पंजाब के साथ झिल्ली ब्लॉक-ईओण surfactant ०.०५% (पंजाबियों-टी) 5% गैर वसा शुष्क दूध के साथ 30 मिनट आरटी पर के लिए एक कक्षीय शेखर पर ।</li>
	<li>संक्षेप में, पंजाबियों के साथ झिल्ली कुल्ला टी ।</li>
	<li>Syn के साथ झिल्ली की मशीन-1 (1:5000) या pSer129-αS एंटीबॉडी (1:5, 000) में २.५% गैर-मोटे सूखे दूध में पंजाबियों-टी, ओ/एन 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर पर ।</li>
	<li>पंजाब के साथ आरटी में 10 मिनट के लिए झिल्ली धो एक कक्षीय शेखर पर टी ।</li>
	<li>विरोधी माउस या विरोधी खरगोश एचआरपी के साथ झिल्ली-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:3000) में २.५% गैर-वसा शुष्क दूध में 1 ज के लिए टी. आर.</li>
	<li>पंजाब के साथ आरटी में 10 मिनट के लिए झिल्ली धो एक कक्षीय शेखर पर टी । 3x दोहराएं ।</li>
	<li>नियमित रूप से chemiluminescence किट के माध्यम से संकेत प्राप्त करें ।</li>
</ol>3. प्राथमिक ंयूरॉंस संस्कृतियों
नोट: प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों WT नवजात (P0) माउस हिप्पोकैम्पस या प्रांतस्था से तैयार किया गया था (लाइन C57BL/ पूरी प्रक्रिया, शूंय से केंद्रापसारक कदम, एक सेल संस्कृति हूड के तहत किया जाता है, बाँझ परिस्थितियों में ।
<ol><li>coverslips इलाज (18 मिमी Ø) के साथ ६५% नाइट्रिक एसिड समाधान के लिए आरटी में कम से 12 ज</li>
	<li>नाइट्रिक एसिड निकालें । कुल्ला coverslips 10x और आसुत पानी के साथ कई बार के साथ दो बार ।</li>
	<li>24-अच्छी तरह से बर्तन में coverslips डालें और उन्हें पाली-डी-lysine के साथ कोट करें (०.१ मिलीग्राम/एमएल में बाँझ आसुत जल या पंजाब 1x) 1 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।</li>
	<li>पॉली-डी-lysine निकालें और coverslips को तीन बार आसुत जल से धोएं । जरूरत है जब तक उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।</li>
	<li>Euthanize ने माउस पिल्ले को decapitation और शवों से सिर अलग कर लिए. बर्तनों पर सिर रखें और धीरे से त्वचा को काटना ।</li>
	<li>ठीक कैंची का उपयोग करके, दिमाग के ठिकानों पर एक चीरा बनाकर खोपड़ी खोलें । खोपड़ी के दो हिस्सों को अलग करें और उन्हें सावधानीपूर्वक निकालें ।</li>
	<li>संदंश का उपयोग करके, कुर्सियां से दिमाग बंद चुटकी और प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस को अलग । उन्हें दो अलग व्यंजन में स्थानांतरित करना है हांक संतुलित नमक समाधान युक्त (HBSS) मध्यम से युक्त 1% पेनिसिलिन/streptomycin ।</li>
	<li>दोहराएं चरण ३.६ और ३.७ प्रत्येक जानवर के लिए । ध्यान रखें कि पूरी प्रक्रिया 30-45 मिनट से अधिक नहीं लेना चाहिए ।</li>
	<li>एकत्र ऊतकों कीमा और उंहें २ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में स्थानांतरण (हिप्पोकैम्पस के लिए एक और प्रांतस्था के लिए एक) Trypsin ०.१% युक्त HBSS माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए पानी स्नान में मशीन । नोट: कोई आंदोलन की आवश्यकता है ।</li>
	<li>homogenate गतिविधि ब्लॉक करने के लिए trypsin करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 10 µ जी/एमएल DNase युक्त DMEM की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।</li>
	<li>२०० × जी में एक केंद्रापसारक पर आरटी पर 5 मिनट के लिए और supernatant निकालने के परिणामस्वरूप असंबद्ध ऊतक केंद्रापसारक । नोट: गोली ऊतक से विच्छेदित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है ।</li>
	<li>चढ़ाना माध्यम में कोशिकाओं को reसस्पेंड, 2% B27, 2 मिमी glutamine, 6 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज, 10% FBS, १२.५ µ एम ग्लूटामेट और 10 µ जी/एमएल gentamicin युक्त ।</li>
	<li>प्लेट असंबद्ध न्यूरॉन्स पर पाली-डी-Lysine coverslips में 24 वेल प्लेट्स अनुपात के अनुसार: 1 प्रांतस्था/12 कुओं और 1 हिप्पोकैम्पस/6 कुओं, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 150000/200000 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में कोशिकाओं को बनाए रखने ।</li>
	<li>दिन के बाद ( इन विट्रो मेंदिन, DIV 1), चढ़ाना मध्यम से 2% B27, 10 µ g/एमएल gentamicin और 2 मिमी glutamine युक्त माध्यम से बदलें ।</li>
	<li>DIV 2 पर, मध्यम के 1/3 निकालें और glial संदूषण को कम करने के लिए ४८ एच के लिए २.५ µ एम cytosine arabinoside युक्त ताजा माध्यम के 1/3 जोड़ें ।</li>
	<li>३७ डिग्री सेल्सियस पर ंयूरॉंस बनाए रखने और मध्यम के आधे हर तीन दिन की जगह ।</li>
</ol>4. न्यूरॉन्स उपचार
नोट: उपचार DIV 7 पर प्रदर्शन किया गया है । सभी कदम बाँझ स्थितियों में एक सेल संस्कृति हुड के तहत पर किया जाता है । DIV 7 में cortical ंयूरॉन संस्कृति घनत्व का एक उदाहरण चित्रा 1में सचित्र है ।
<ol><li>पूल microsomes-जुड़े αS समुच्चय तीन अलग रोगग्रस्त टीजी चूहों के रीढ़ की हड्डी से प्राप्त क्रम में एक 1 µ जी/µ एल समाधान है, कमजोर पड़ने के लिए मूल homogenization बफर का उपयोग कर ।</li>
	<li>मध्यम के 1/3 निकालें और यह ताजा 2% B27, 1x gentamicin और 2 मिमी glutamine युक्त माध्यम के साथ धीरे से बदलें ।</li>
	<li>कक्ष मध्यम करने के लिए pooled microsomes-संबद्ध αS समुच्चय का 1 µ g जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में न्यूरॉन्स लौटें.</li>
	<li>1 सप्ताह के लिए हर 3 दिन, ताजा माध्यम के 1/3 जोड़ें । माध्यम की जगह नहीं है । बस इसे जोड़ें ।</li>
	<li>उपचार के 1 सप्ताह के बाद, मध्यम का 1/3 निकालें और इसे धीरे से 2% B27, 10 µ g/एमएल gentamicin और 2 मिमी glutamine युक्त ताजा माध्यम के साथ बदलें । हर 3 दिन दोहराएं ।</li>
	<li>फिक्स ंयूरॉंस उपचार के 2 सप्ताह के बाद (DIV 21) ।</li>
</ol>5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस
<ol><li>फिक्स ंयूरॉंस में 2% paraformaldehyde और 5% सुक्रोज समाधान के लिए आर टी सी पर 15 मिनट के लिए मिलाते बिना, एक रासायनिक धुएं हूड के तहत ।</li>
	<li>फिक्सिंग समाधान निकालें । संक्षेप में, पंजाबियों 1x, 3 बार के साथ धो लो । नोट: प्राथमिक न्यूरॉन्स पाली-lysine coverslips के लिए दृढ़ता से छड़ी नहीं है क्योंकि धीरे सभी धोने चरणों का प्रदर्शन.</li>
	<li>Permeabilize ंयूरॉंस में surfactant के ०.३% के साथ पंजाबियों 1x में 5 मिनट के लिए आरटी ।</li>
	<li>संक्षेप में, पंजाबियों 1x, 3 बार के साथ धो लो ।</li>
	<li>आर टी में 30 मिनट के लिए FBS में 3% के साथ ंयूरॉंस मशीन, विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक करने के लिए, एक कक्षीय शेखर पर ।</li>
	<li>एक कक्षीय शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस में पंजाब में 3% FBS में भंग उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन न्यूरॉन्स 1x, हे/ नोट: syn303 (1:1000), माउस αS (1:200), pser129-αS (1:1000) और ताऊ (1:10000) एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया ।</li>
	<li>एंटीबॉडी समाधान और धो, संक्षेप में, पंजाबियों 1x, 3 बार के साथ निकालें ।</li>
	<li>उचित फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी पंजाब में 3% FBS में भंग के साथ मशीन न्यूरॉन्स, एक कक्षीय शेखर पर अंधेरे में आरटी में 1 ज के लिए ।</li>
	<li>एंटीबॉडी समाधान और धो, संक्षेप में, पंजाबियों 1x, 3 बार के साथ निकालें ।</li>
	<li>DAPI समाधान के साथ दाग न्यूरॉन्स (०.१ µ g/mL में) 15 मिनट के लिए आर टी में एक कक्षीय शेखर पर अंधेरे में ।</li>
	<li>एंटीबॉडी समाधान और धो, संक्षेप में, पंजाबियों 1x, 3 बार के साथ निकालें ।</li>
	<li>माउंट antifade बढ़ते माध्यम का उपयोग कर एक स्लाइड पर coverslips ।</li>
</ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+exogenous+&#945;-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+&#945;-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates.">Addition of exogenous &#945;-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous &#945;-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nat. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity.">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+rAAV-&#945;-synuclein+and+the+fibril+&#945;-synuclein+models+advance+our+understanding+of+Parkinson's+disease.">How can rAAV-&#945;-synuclein and the fibril &#945;-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

हम मस्तिष्क में αS समावेशन के गठन को प्राप्त करने के लिए एक विधि वर्णित-WT चूहों से प्राथमिक ंयूरॉंस संस्कृतियों व्युत्पंन, शुद्ध microsomes से जुड़े αS समुच्चय αS टीजी पशु मॉडलों से अलग के अलावा के माध्यम से ।
इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम निंनलिखित हैं: microsomes के µ जी का अनुपात-संबद्ध αS समुच्चय/ंयूरॉंस और αS समुच्चय के स्रोत । के रूप में परिणाम सत्र में दिखाया गया है, यह microsomes के µ जी के अनुपात को अनुकूलित महत्वपूर्ण है-संबद्ध αS समुच्चय/उपइष्टतम स्थितियों में काम करने के बाद से न्यूरॉन्स की संख्या समय से पहले कोशिका मृत्यु या बहुत दुर्लभ intracellular एकत्रीकरण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (देखें प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग) । इस वजह से, यह बहुत DIV 7 में ंयूरॉन संस्कृति के घनत्व का आकलन महत्वपूर्ण है ( 1 चित्रामें दिखाया गया है) उपचार शुरू करने से पहले । इसके अतिरिक्त, αS समुच्चय को रोगग्रस्त αS टीजी चूहों से शुद्ध किया जाना है, यानी पशु मॉडल है कि पौंड phosphorylated और डिटर्जेंट अघुलनशील αS HMW तंतुओं द्वारा विशेषता शामिल किए जाने की तरह जमा से ।
इस प्रोटोकॉल के लिए संभावित संशोधनों के संबंध ऊतक, जमे हुए या ताजा, जिसमें से microsomes अलग किया जा सकता है और शुरू राशि । जब तक हम αS अघुलनशील समुच्चय की उच्च सामग्री की वजह से टीजी चूहों के SpC इस्तेमाल किया, प्रोटोकॉल किसी भी ऊतकों से microsomes-जुड़े समुच्चय को अलग करने के लिए उपयुक्त है, बशर्ते कि क्षेत्र αS समुच्चय में एक उच्च सामग्री है । जमे हुए नमूनों को भी इस्तेमाल किया जा सकता है ठंड के बाद से microsomes के शुद्धिकरण कदम-संबद्ध समुच्चय या प्रतिसे समुच्चय को प्रभावित नहीं करता है । जबकि ऊतकों के लिए अनुशंसित शुरू वजन के बारे में १००-१५० मिलीग्राम है, इस प्रोटोकॉल के रूप में कम से microsomes प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है ५० कच्चे माल की मिलीग्राम (कोई अधिकतम वजन सीमा) । १०० मिलीग्राम से कम राशि के मामले में, तथापि, उपयुक्त homogenization अनुपात 1:20 (डब्ल्यू/वी) किया जाएगा ताकि ultracentrifuge वर्षण के लिए पाली कार्बोनेट बोतल पर लोड करने के लिए supernatant S10 के कम से 1 मिलीलीटर है । वास्तव में, लोड हो रहा है संस्करणों से छोटे 1 मिलीलीटर ट्यूब और नमूना हानि के पतन में परिणाम हो सकता है. homogenization मात्रा में वृद्धि एक और अधिक पतला supernatant को बढ़ावा मिलेगा, लेकिन माइक्रोसोमल गोली की एकाग्रता अप्रभावित रहेगा ।
इस प्रोटोकॉल की कमी से αS समावेशन है कि हाल ही में मानव मूल के αS PFFs के मामले प्रशासन में सूचित किया गया है के गठन में अक्षम पार बोने की चिंताओं को murine के रूप में αS24PFFs माउस के लिए विरोध किया । murine संस्कृतियों को दी exogenous αS तंतुओं की मात्रा में वृद्धि के बाद से इस मुद्दे को बायपास कर सकते हैं, हम पतले microsomes की मात्रा की धुन की सिफारिश करने के लिए तंतुओं के प्रशासन के मामले में जुड़े समुच्चय अन्य αS वेरिएंट से या अलग से प्राप्त प्रजातियों क्या हम वर्णित से माउस ंयूरॉन संस्कृतियों के लिए ।
Exogenous αS समुच्चय संस्कृति मीडिया में जोड़ा विभिंन स्रोतों से हो सकता है । इन विट्रो में αS PFFs पहले सेल संस्कृतियों, प्राथमिक ंयूरॉंस में intracellular αS समुच्चय के टेंपलेट सीडिंग के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और पशु मॉडल3,7,8,15। हमारे विधि की तुलना में जहां microsomes-जुड़े αS समुच्चय कुछ ही घंटों में अलग किया जा सकता है, PFFs का गठन लंबा और श्रमसाध्य है, शुद्धिकरण के कई चरणों की आवश्यकता होती है, अतिरिक्त परख के बाद αS समुच्चय की जांच करने के लिए25 confomations . इसके अलावा, बैक्टीरियल व्यक्त मानव या माउस αS से प्राप्त किया जा रहा PFFs, यानी कमी posttranslational eukaryotes की विशिष्ट संशोधनों, अलग अनुरूप पेश कर सकते हैं, चयनात्मक बोने और रोगजनक गुणों के साथ, के अनुसार nucleation प्रोटोकॉल का पालन किया (अर्थात् रिबन तंतुओं बनाम)5,8 विभिंन परिणामों और निष्कर्षों के लिए अग्रणी । इसके बजाय, vivo शुद्ध αS समुच्चय में से एक प्रशासन और अधिक प्रामाणिक रोगजनक टेम्पलेट्स के संचरण की गारंटी देता है, बारीकी से पशु मॉडल और पीडी रोगियों में αS समावेशन के गठन की प्रक्रिया नकल उतार.
इस तकनीक के एक भविष्य के आवेदन के रूप में, हम इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक पीडी रोगियों या अन्य αS टीजी पशु मॉडल के मस्तिष्क से αS रोगजनक बीज को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विश्वास है, बशर्ते कि रोगग्रस्त क्षेत्र से जो microsomes अलग कर रहे हैं αS में अमीर हैं Inclusions.
हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली विधि है कि vivo पीडी मॉडल में से αS के देशी विषैले प्रजातियों की शुद्धि की अनुमति देता है प्राथमिक ंयूरॉंस में αS समावेशन के गठन को प्राप्त करने के लिए बोने टेंपलेट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
हम मानते है कि यह विधि अत्यंत बहुमुखी है और αS एकत्रीकरण के विभिंन पहलुओं और सेल pathophysiology पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक असाधारण सेल आधारित मॉडल प्रदान कर सकते हैं । क्योंकि αS शामिल किए जाने के गठन के एक जटिल प्रक्रिया है कि संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में दोहराने के लिए मुश्किल है प्रतिनिधित्व करते हैं, हम उंमीद कर रहे है कि इस मॉडल तीव्र रोगजनक तंत्र में महान अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा, कठिन पुरानी और अधिक विस्तृत में पहचान करने के लिए सिस्टम जैसे पशु मॉडल हैं ।

अल्फा के संचय-synuclein (αS) proteinaceous समावेशन पार्किंसंस रोग (पीडी) और अल्फा-synulceinopathies1की एक प्रमुख और महत्वपूर्ण विशेषता है । दुर्भाग्य से, जबकि पशु मॉडल एक पर्याप्त सेलुलर और जैव रासायनिक वातावरण प्रदान करने के लिए एकत्रीकरण प्रोटीन तंतुओं2के गठन के लिए आवश्यक कदम प्रेरित कर रहे हैं, जटिल Lewy शरीर (पौंड) के गठन की नकल-समुच्चय की तरह सेल संस्कृतियों में मुश्किल और चुनौतीपूर्ण है ।
यहां हम एक विधि का वर्णन करने के लिए αS समावेशीकरण, पशु मॉडल और पीडी रोगियों में प्राप्त प्रोटीन समुच्चय के समान के गठन के लिए प्रेरित, संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में, मस्तिष्क पृथक माउस प्राथमिक ंयूरॉंस का उपयोग कर । हमारे प्रोटोकॉल exogenous प्रशासन पर आधारित है microsomes-एसोसिएटेड αS αS रोगसूचक ट्रांसजेनिक (टीजी) चूहों से अलग माउस हिप्पोकैम्पस या cortical प्राथमिक ंयूरॉंस । इस विधि αS विषाक्त प्रजातियों के प्रसार और प्रसार की क्षमता का लाभ लेता है, जो एक बार संस्कृति माध्यम में जोड़ा, आंतरिक बनने के लिए सक्षम हैं, और परिपक्व αS के गठन प्रेरित-सकारात्मक समुच्चय3,4, 5,6,7,8.
मूलतः, मानक तरीकों सेल संस्कृतियों में αS तंतुओं के गठन को प्राप्त करने के लिए नियमित रूप से अभिकर्मक प्रोटोकॉल या वायरल मध्यस्थता संक्रमण9के माध्यम से इसी αS सीडीएनए के व्यक्तीकरण पर आधारित थे । जबकि पहले मामले में पौंड की तरह αS समुच्चय प्राप्त करने में टिकने थे, कम दक्षता दिखाया, और सेल के प्रकार पर निर्भर, दूसरा प्रोटोकॉल अघुलनशील तंतुओं के गठन के लिए नेतृत्व किया, उच्च आणविक भार सहित (HMW) प्रजातियों में संक्रमण से 24-48 ज 10. इन तरीकों में, समुच्चय के गठन शायद एक अत्यधिक और असंतुलित αS प्रोटीन राशि है कि αS अनुरूपता है कि एकत्रीकरण का एक रोग रूपांतरण के बजाय अघुलनशील हो जाता है के कारण किया गया था । इसके बजाय, तकनीक है कि हम यहां पेश कर रहे है αS अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन नहीं है, लेकिन exogenous तंतुओं के internalization के कारण व्यापक प्रोटीन एकत्रीकरण लाती है । इसके अलावा, exogenous तंतुओं के प्रशासन के माध्यम से αS समुच्चय के गठन के एक लंबी प्रक्रिया है कि दिन या हफ्तों की आवश्यकता है हमें एक समय चूक फैशन में αS शामिल किए जाने के प्रारंभिक और मध्यवर्ती चरणों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देने के लिए व्यापक हो और यह सेलुलर जैव रासायनिक परिवर्तन के साथ सहसंबंधी बनाना । इस प्रकार, हमारी विधि αS एकत्रीकरण के सेलुलर मॉडल है कि सेलुलर pathophysiology के संबंध में αS फाइब्रिल गठन microscopically अध्ययन करने के लिए सहायक है बनाने के लिए एक मूल्यवान आवेदन है ।
हालांकि रोगग्रस्त αS ट्रांसजेनिक (टीजी) चूहों11,12 या मानव पीडी दिमाग6,13 से कच्चे मस्तिष्क निष्कर्षों के प्रशासन टीजी या जंगली में αS जमाव पैदा करने में सक्षम है-type (WT) जानवरों, आवेदन कोशिका संस्कृतियों के लिए एक ही प्रक्रिया के रूप में सफल साबित नहीं हुआ है, संभवतः क्योंकि नमूनों में समुच्चय की कम राशि का इस्तेमाल किया और एक मानक प्रक्रिया की कमी के लिए देशी αS विषाक्त प्रजातियों को अलग14। इस वजह से, इन विट्रो तंतुओं (PFFs) αS की, कोशिकाओं और पशु मॉडल3,4,6,7 में αS समावेशन की प्रेरण के लिए अब तक पसंद के समुच्चय स्रोत रहा है ,१५,१६. हमारे प्रोटोकॉल के साथ, तथापि, हम बताते है कि microsomes-एसोसिएटेड αS एकत्रित प्रजातियों αS टीजी चूहों से अलग कुशलतापूर्वक प्राथमिक ंयूरॉंस में intracellular पौंड की तरह αS शामिल किए जाने के संचय प्रेरित कर सकते हैं ।
हमारी प्रयोगशाला में, microsomes-एसोसिएटेड αS एग्रीगेट प्रजातियों के रीढ़ की हड्डी से अलग कर रहे हैं (SpC) रोगग्रस्त टीजी चूहों के ऊतकों मानव A53T αS जीन एक्सप्रेस के नियंत्रण में माउस prion प्रोटीन (पीआरपी) प्रवर्तक [पीआरपी मानव A53T αS टीजी चूहों, रेखा G2-317]. इन चूहों एक उंर पर निर्भर neurodegenerative phenotype कि मजबूत मोटर रोग और केंद्रीय तंत्रिका phosphorylated, ubiquitinated, और अघुलनशील αS से बना प्रणाली में शामिल किए जाने के गठन, उंर के 9 महीने के बाद शुरू शामिल दिखा । एक बार मोटर रोग प्रकट होता है, phenotype तेजी से पक्षाघात में विकसित, पीछे अंगों से शुरू, कि 2-3 सप्ताह में मौत की ओर जाता है । αS समुच्चय के संचय समानताएं रोग अभिव्यक्ति । मोटर रोग की शुरुआत में बलिदान चूहों SpC, मस्तिष्क स्टेम और सेरिबैलम में αS एकत्रीकरण की एक मजबूत डिग्री दिखा । माउस को बलिदान करने के लिए पक्षाघात सेट तक इंतजार करने की कोई जरूरत नहीं है । रोगसूचक चूहों 9 महीने पुराने जानवरों है कि मोटर रोग प्रदर्शित नहीं करते हैं पर लिया जाता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:931px;" width="931">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">84097-1KG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Hepes&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td>1M pH=7-7.6</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:400px;">EDTA&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">0390-100ml</td>
			<td>pH=8 0.5M</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:400px;">MgCl2</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:400px;">NaCO3</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:400px;">NAHCO3</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-6X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:400px;">KCl</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:400px;">cOmplete Mini&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">PhosStop&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906837001</td>
			<td>phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:245px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">EMPO14500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells</td>
			<td style="width:245px;">Biorad</td>
			<td>5678094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Supported Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Biorad</td>
			<td>1620097</td>
			<td>0.2 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Blotting-Grade Blocker&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Non-fat dry milk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">34077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Nitric acid&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>1004411000</td>
			<td align="right">65%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Glass Coverslips&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>1014355118NR1</td>
			<td>18 mm x&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14170-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>10,000 U/mL, 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D5796-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td align="right">0.50%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">B27 Supplement&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Glutamax&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">DNAse</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:245px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">EC50182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Glutamate</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>1446600-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10888-022&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytosine arabinoside (AraC)</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3350000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">VECTASHIELD antifade mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">DAPI</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 Ti rotor</td>
			<td style="width:245px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:245px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Syn-1 antibody, clone 42&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BD Biosciences</td>
			<td>610786</td>
			<td>anti-mouse WB: 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Syn303 antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">824301</td>
			<td>anti-mouse IF: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Tau antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Synaptic Systems</td>
			<td>314&#160;002</td>
			<td>anti-rabbit IF: 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:400px;">pser129-&#945;S antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">A gift from Fujiwara et al, reference 19</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anti-rabbit WB: 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">pser129-&#945;S antibody</td>
			<td style="width:245px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab51253</td>
			<td>anti-rabbit&#160; IF: 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Mouse &#945;S (D37A6) XP&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">4179</td>
			<td>anti-rabbit IF 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A27039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Termo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Microson XL-2000&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Misonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sonicator&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type</td>
			<td style="width:245px;">Science Service EU</td>
			<td style="width:119px;">S4484</td>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AXIO Observer Inverted Light Microscope&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCS SP2 laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:245px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted epi-fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:400px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:245px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td>Nonionic surfactant&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exogenous administration of microsomes-associated alpha-synuclein aggregates to primary neurons as a powerful cell model of fibrils formation

वर्षों के लिए, सेल संस्कृतियों में अघुलनशील अल्फा-synuclein (αS) समावेश के गठन की नकल की अक्षमता पार्किंसंस रोग (पीडी) में αS एकत्रीकरण के अध्ययन में एक महान सीमा रही है । हाल ही में, रोगग्रस्त αS ट्रांसजेनिक चूहों या पीडी रोगियों से मस्तिष्क अर्क के exogenous टीका के माध्यम से नए पशु मॉडलों के विकास ने αS एकत्रीकरण के अधिक पर्याप्त सेल मॉडल बनाने की संभावना को नई आशाएँ दी हैं. दुर्भाग्य से, जब यह संस्कृतियों में कोशिकाओं की बात आती है, कच्चे मस्तिष्क निष्कर्षों के प्रशासन चूहों में के रूप में सफल साबित नहीं किया है और exogenous समुच्चय के विकल्प का स्रोत अभी भी इन विट्रो में αS तंतुओं है ।
हम मूल microsomes के exogenous प्रशासन के माध्यम से प्राथमिक न्यूरॉन्स में intracellular αS समावेश के गठन के लिए प्रेरित करने के लिए एक विधि विकसित की है-जुड़े αS समुच्चय, αS चूहों के रोगग्रस्त क्षेत्रों से पृथक एक अत्यंत विषैले ट्रांसजेनिक प्रजातियों. αS समुच्चय है कि microsomes बुलबुले के साथ जुड़ा हुआ है के इस अंश, कुशलतापूर्वक आंतरिक है और intracellular समावेश के गठन के लिए सकारात्मक एकत्रित और phosphorylated αS के लिए लाती है । इन विट्रो मेंकी तुलना में-क्षेऽ तंतुओं जो रिकॉमबिनेंट αS से बने हैं, हमारे विधि तेजी से है और गारंटी देता है कि रोगजनक सीडिंग प्रामाणिक αS पीडी के रोगग्रस्त पशु मॉडल से निकाले गए समुच्चय के साथ किया जाता है, और अधिक निकटता के प्रकार की नकल उतार vivo मेंसमावेशन प्राप्त । नतीजतन, αS समावेशन में अमीर ऊतकों की उपलब्धता अनिवार्य है ।
हम मानते है कि इस विधि αS एकत्रीकरण और vivo में संबंधित सेलुलर pathophysiology के सूक्ष्म पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी सेल आधारित मॉडल प्रदान करेगा और अधिक सटीक और परिष्कृत सेल के निर्माण के लिए एक प्रारंभिक बिंदु होगा पीडी के प्रतिमान ।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल और चित्रा 2में संक्षेप के बाद, हम तीन रोगग्रस्त A53T αS टीजी चूहों (चित्रा 3) से microsomes-एसोसिएटेड αS समुच्चय शुद्ध । Microsomes कच्चे झिल्ली गोली भागों है कि endoplasmic जालिका, Golgi, और छोटे synaptic बुलबुले होते हैं । अन्य अंशों की तुलना में माइक्रोसोमल गोली की शुद्धता की डिग्री पहले विशिष्ट organelle मार्करों का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था18.
एक बार पृथक, αS समुच्चय के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन denaturing एसडीएस के माध्यम से मूल्यांकन किया जाता है-पृष्ठ, Syn के साथ मशीन द्वारा पीछा-1 या phosphorylated αS पर Serine १२९ (pSer129-αS) एंटीबॉडी । रोगसूचक (दबाव) और आयु-मिलान गैर टीजी (nTg) चूहों की तुलना में, microsomes बीमार चूहों से अलग αS समुच्चय के साथ हाला । Microsomes-एसोसिएटेड αS प्रजातियों αS समुच्चय के विशिष्ट सुविधाओं, इस तरह के HMW डिटर्जेंट प्रतिरोधी प्रजातियों के संचय के रूप में, फास्फारिलीकरण १२९19 और सी में serine-और N-टर्मिनल कटा हुआ टुकड़े दिखाने के (एक पूर्ण लक्षण वर्णन के लिए microsomes-संबद्ध αS समुच्चय संदर्भ18,20,21) देखें । इन बुनियादी आवश्यकताओं के बाद से monomeric αS नहीं मिलता है कुशलतापूर्वक आंतरिक और αS साठा7,15,22प्रेरित नहीं करता है । यह किसी भी डिटर्जेंट (ईओण या गैर ईओण) का उपयोग करने के लिए P100 छर्रों reसस्पेंड के बाद से यह कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है महत्वपूर्ण नहीं है । इसके अलावा, आदेश में नमूना परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, microsomes से जुड़े αS समुच्चय तीन अलग रोगग्रस्त चूहों से ंयूरॉन उपचार के लिए परित किया जाएगा ।
cortical के संस्कृति माध्यम को रोगग्रस्त A53T चूहों से microsomes-एसोसिएटेड αS समुच्चय के 1 µ जी के प्रशासन या हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स αS समावेशन के एक समय पर निर्भर गठन लाती है, के लिए सकारात्मक समुच्चय-विशिष्ट αS एंटीबॉडी जैसे Syn303 (चित्रा ४, ५) या pser129-αS (चित्रा ५). उपचार के दो दिन (2d) के बाद इन समुच्चय के रूप में छोटे, बिखरे हुए puncta कि बाद में समय अंक में और अधिक प्रचुर मात्रा में हो जाएगा दिखाई देते हैं । दो सप्ताह के बाद, αS शामिल किए जाने लंबे और परिपक्व मोतियों की तरह संरचनाओं, भारी न्यूरॉन संस्कृतियों भर में फैले, एक neurite पैटर्न और आंशिक रूप से presynaptic और neurites मार्करों के साथ स्थानीयकरण के बाद (चित्रा 5). कभी-कभार, नवगठित αS समावेश को सह-स्थानीयकरण और सेल सोमा दाग या पूरी प्रक्रिया को कवर करने के लिए देखा जा सकता है, जैसे कि गल neurites ।
हालांकि microsomes-जुड़े αS समुच्चय अंशों कुशलता से ंयूरॉन संस्कृतियों में फैल सकता है, उनकी राशि के लिए पतले चढ़ाया न्यूरॉन्स की संख्या को देखते है (चित्रा 1) । वास्तव में, की सिफारिश की अनुपात से अधिक, microsomes के µ जी-संबद्ध समुच्चय: ंयूरॉंस की संख्या, कुछ दिनों के भीतर समय से पहले सेल मौत पैदा (6 अंक), जबकि microsomes के एक अपर्याप्त राशि-संबद्ध αS समुच्चय के लिए नेतृत्व करेंगे दुर्लभ और शामिल किए जाने के दो सप्ताह के उपचार के बाद कम संख्या, जो पहले समय अंक में प्राप्त किया गया था (चित्रा 4ए) के समान है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig1.jpg"> चित्रा 1 . Cortical ंयूरॉंस संस्कृतियों । प्रतिनिधि cortical ंयूरॉन संस्कृतियों के DIV 7 में घनत्व दिखा छवि । छवियां एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप, 10x उद्देश्य के साथ लिया गया । स्केल बार = १०० µm. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> ।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig2.jpg"> चित्रा 2 . माउस SpC से microsomes-संबद्ध αS समुच्चय का अलगाव । रोगग्रस्त चूहों के SpC से microsomes-संबद्ध αS समुच्चय के शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का फ़्लोचार्ट । <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig3.jpg"> चित्रा 3 . रोगग्रस्त, रोगसूचक A53T αS टीजी और nTg चूहों से microsomes अंशों का अलगाव. पश्चिमी दाग विश्लेषण दिखा शुद्ध microsomes-एसोसिएटेड αS समुच्चय तीन रोगग्रस्त (बीमार), रोगसूचक (दबाव) और वृद्ध-मिलान nTg चूहों से पृथक । रोगग्रस्त चूहे A53T αS टीजी चूहे हैं जो मोटर और स्नायविक रोग को दिखाते हैं, जिनमें αS समावेशन का संचय शामिल है, जबकि रोगसूचक पशु स्वस्थ A53T αS Tgs के ९ माह की आयु के होते हैं जो अभी तक किसी भी αS विकृति संबंधी phenotype नहीं दिखा पाते हैं. nTg चूहों रोगग्रस्त चूहों जो αS transgene ले नहीं है और इसलिए αS प्रेरित विकृति का विकास नहीं है की littermates हैं । प्रत्येक शुद्ध अंशों के 1 µ g को एक denaturing एसडीएस-पृष्ठ पर चलाया गया, एक nitrocellulose झिल्ली पर स्थानान्तरित किया गया और blotted-1 या Syn-pSer129 αS के साथ एंटीबॉडी । केवल microsomes बीमार चूहों से पृथक अलग HMW डिटर्जेंट प्रतिरोधी αS समुच्चय है कि serine १२९ पर phosphorylated थे और सी और एन-टर्मिनल जनचेतना दिखाया निहित है । यह आंकड़ा Colla एट अल से अनुकूलित किया गया है । 18. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> ।
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig4.jpg"> चित्र 4 . microsomes-संबद्ध αS समुच्चय के प्रशासन के बाद αS जमाव के समय पर निर्भर प्रेरण । (क) प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ इलाज किया microsomes के 1 µ जी से जुड़े αS समुच्चय अंशों तीन अलग रोगग्रस्त चूहों से परित. न्यूरॉन्स 2 दिन (2d), 1 सप्ताह (1w) या 2 सप्ताह (2w) उपचार और syn303 के साथ immunostained (S303, 1:1000), ऑक्सीकरण और एग्रीगेट एंटीबॉडी के लिए एक विशिष्ट αS के साथ तय किए गए थे । कोशिकाएँ DAPI से counterstained थीं. फोकल छवियां एक लेज़र स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप, 63X उद्देश्य का उपयोग कर लिया गया । स्केल बार = ५० µm. (ख) कुल ﬂuorescence का मात्रात्मक विश्लेषण, पृष्ठभूमि घटाव के बाद, छवि जंमू सॉफ्टवेयर के कण गिनती प्लगइन का उपयोग किया गया था । मान नाभिक प्रति फ़ील्ड (DAPI count) की संख्या के लिए सामान्यीकृत किया गया और 2d पर S303 प्रतिदीप्ति सिग्नल के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया । मान मतलब ± एसडी (एन = 5) के रूप में दिया जाता है । * * p < 0.001, * * * * p < 0.00001, एक तरफ़ा ANOVA, जिसके बाद फिशर के एलएसडी के बाद हॉक परीक्षण किया गया । <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig5.jpg"> चित्रा 5 . cortical neurites नेटवर्क के साथ Intracellular αS समावेश colocalize । cortical न्यूरॉन्स के प्रतिनिधि फोकल छवियों microsomes-जुड़े αS रोगग्रस्त टीजी चूहों से प्राप्त समुच्चय के साथ इलाज किया. उपचार के 2 सप्ताह के बाद न्यूरॉन्स तय किया गया और डबल दाग समुच्चय के साथ-विशिष्ट एंटीबॉडी [S303 (ए, B) या pser129-αS, 1:1000 (c)] and neurite marks [माउस αS, 1:200 (A, B) or तौ, 1:10000 (c)]. सह फ्लोरोसेंट संकेतों के लेबल का प्रदर्शन आंशिक सह स्थानीयकरण नवगठित αS मनका-संरचनाओं की तरह neurites नेटवर्क के साथ । कभी-कभार αS समावेश के भीतर न्यूरॉन्स सोमा (ए, बी, ऐरोहेड) जमा. स्टैक्ड छवियां एक लेज़र स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप, 63X उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत किए गए थे । स्केल बार = ५० µm । यह आंकड़ा Colla एट अल से संशोधित किया गया है । 20. <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57884/57884fig6.jpg"> चित्रा 6 . microsomes-जुड़े αS समुच्चय के इष्टतम राशि के अलावा ंयूरॉंस के लिए विषाक्त है । microsomes की बढ़ती एकाग्रता के साथ इलाज न्यूरॉन्स की DAPI धुंधला-जुड़े αS समुच्चय कोशिका मृत्यु की ओर जाता है. (क) Cortical न्यूरॉन्स के साथ इलाज किया गया 1, 2 microsomes के µ जी-जुड़े αS रोगग्रस्त चूहों से निकाले गए समुच्चय या केवल बफर कि समुच्चय शामिल नहीं है (ख) और DAPI के साथ दाग. फ्लोरोसेंट छवियों एक महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ एक 20X उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । स्केल बार = १०० µm.(B) छवि J सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके DAPI-धनात्मक कक्षों को गिना गया. ग्राफ microsomes की बढ़ती एकाग्रता के साथ नाभिक की संख्या में कमी से जुड़े αS समुच्चय ंयूरॉंस मीडिया में जोड़ा दिखाता है । मान b के% के रूप में व्यक्त कर रहे है और मतलब ± एसडी (n = 5), * * * p < 0.0001, एक तरफ़ा ANOVA, फिशर के एलएसडी के बाद हॉक परीक्षण के बाद के रूप में दिया जाता है । <a href="/files/ftp_upload/57884/57884fig6large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

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