Name: quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dall'associazione americana del cuore [sovvenzione dai 0365274B a H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 a Z.W.], National Institutes of Health [Ufficio di ricerca infrastrutture condivise strumentazione Grant S10RR031845 a la microscopia chiara Imaging Facility presso Case Western Reserve University] e del Consiglio di borsa di studio di Cina [a X.G.]. Gli autori ringraziano Richard Lee nel nucleo Imaging microscopia luce per il suo aiuto con scivolo di scansione.

Tutti gli esperimenti descritti qui che coinvolgono i topi sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali con istituzionale Case Western Reserve University. Il titolo del protocollo 2016-0068 (PI: Hua Lou) è il "Ruolo di impionbatura alternativo pre-mRNA in vertebrate development".
Nota: Le informazioni di tutte le attrezzature, reagenti e materiali di consumo utilizzati nel presente protocollo sono incluso nella Tabella materiali.
1. ...

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing?.">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?.</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li><li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+in+situ+hybridisation.">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li><li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity.">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA.">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li><li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li><li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras/ERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li><li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner.">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes.">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li><li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections.">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome.">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li></ol>

La presente comunicazione illustra l'uso di BaseScope RNA ISH per esaminare come i modelli di espressione nelle sezioni di cervello di topo. È dimostrato che giunzione esone-esone anti-senso sonde inferiore 50 nucleotidi possono indirizzare l'inclusione dell'esone e saltando le isoforme robustamente e specificamente. Inoltre, i segnali risultanti possono essere utilizzati per calcolare PSI di un esone alternativo.
Alcune variazioni sono state testate nella procedura. Ad esempio, sezioni di te...

Splicing alternativo (AS) è un processo comune che si verifica durante la maturazione del pre-mRNA. In questo processo, un esone possa essere incluse differenzialmente nel mRNA maturo. Così, attraverso AS, un gene può generare molti mRNA che codificano per prodotti proteici differenti. Si stima che 92 – 94% dei geni umani sottoposti a1,d'impionbatura alternativa2. Modelli di splicing alternativo che anormale è derivato da mutazioni genetiche sono state collegate a un gran numero di malattie, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, la distrofia miotonica e cancro3,4. È dunque fondamentale per studiare e comprendere meglio i meccanismi regolatori d'impionbatura alternative nel tentativo di trovare nuovi trattamenti delle malattie umane.
COME spesso è regolata in modo specifico del tipo di cella. È importante determinare il pattern di espressione AS di un gene specifico in un determinato sistema biologico. Tuttavia, questo diventa complicato quando un organo complesso che contiene molti tipi diversi di cellule, come il cervello o del cuore, è studiato. In questo caso, la scelta ideale del sistema di dosaggio è RNA in situ ibridazione (ISH usando il tessuto) sezioni così il modello di espressione AS di un gene specifico può essere rilevato in molti tipi cellulari contemporaneamente. Infatti, sonde essone-specific sono stati utilizzati per valutare i livelli di espressione di un'alternativa dell'essone5,6,7. Tuttavia, questo approccio non è adatto come analisi di modelli per i seguenti motivi. Primi, ISH i metodi convenzionali di solito uso sonde più di 300 bp, mentre la dimensione media degli esoni interni dei vertebrati (non primo o l'ultimo esone) è di 170 nucleotidi8,9. In secondo luogo, quando una sonda essone-specific è utilizzata per esaminare il pattern d'impionbatura di un esone alternativo interno, la sola isoforma di mRNA rilevata dalla sonda è quello che contiene l'esone, mentre l'isoforma di mRNA senza l'esone non può essere rilevato. Così, il calcolo della percentuale impiombata nel rapporto (PSI) dell'esone alternativo è complicato. Inoltre, ISH fluorescenti convenzionali spesso combina ISH con immunostaining, che riduce l'efficienza di rivelazione e la robustezza. Ad esempio, in uno studio che ha analizzato l'indotta da stress splicing isoforma di commutazione dell'acetilcolinesterasi (AChE) mRNA, digossigenina fu incorporata la sonda ISH e rilevato usando l'anticorpo anti-digossigenina. In alternativa, la sonda marcata con biotina è stato rilevato da un coniugato di fosfatasi alcalina/streptavidina e un substrato per la fosfatasi alcalina10. Nessun metodo utilizza qualsiasi strategia di amplificazione per aumentare la sensibilità di rilevazione. Di conseguenza, è difficile da rilevare trascritti di mRNA che sono espressi a livelli bassi. Così, un sistema di dosaggio più semplice e più affidabile di ISH è necessario analizzare come espressione modelli in situ.
BaseScope recentemente è stato sviluppato sulla base della piattaforma di RNAscope, una consolidata e ampiamente usato sistema di dosaggio ISH. Entrambi i sistemi di analisi utilizzano una tecnologia di amplificazione specifica della destinazione che aumenta la sensibilità di rilevazione11,12. Ciò che distingue uno da altro è la lunghezza della sequenza di destinazione, che è più breve 50 nucleotidi per BaseScope e 300 – 1.000 nucleotidi per RNAscope. Così, è possibile per le sonde di progettazione destinati a giunzioni esone-esone per rilevare specifiche isoforme di mRNA alternativi. Nello studio corrente, è stata predisposta una procedura per esaminare come modelli di espressione di neurofibromatosi tipo 1 (Nf1) esone 23a, un esone alternativo ampiamente studiato nel laboratorio stesso13,14,15 , 16 , 17, nelle sezioni del cervello del mouse. I risultati dimostrano che BaseScope è un sistema ideale per studiare i modelli di espressione di Nf1 esone 23a in situ. Come questo sistema di dosaggio può essere adattato per analizzare come i modelli di espressione degli esoni alternativi molti, rappresenta un nuovo e potente strumento negli studi di As.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>241000ACD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain Rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1160049SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imperial III General Purpose Incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SCN400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pretreatment kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>322381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III*</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Target Retrieval</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2002555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseScope Detection Reagent Kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>332910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 0</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 1</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 2</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 3</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 4</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 5-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 6-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-A</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-B</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16230F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X Wash Buffer</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifying Paper</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Rack</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>9837976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Dishes</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>LWS20WH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12--545-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>002689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formalde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF94-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin I</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>17012359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>173942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

Splicing alternativo (AS) si verifica in oltre il 90% dei geni umani. Il pattern di espressione di un esone alternativamente impiombato spesso è regolato in modo specifico del tipo di cella. COME espressione di modelli in genere vengono analizzati mediante RT-PCR e RNA-seq utilizzando campioni di RNA isolato da una popolazione di cellule. In situ esame di come modelli di espressione per una particolare struttura biologica può essere effettuato da RNA in situ di ibridazione (ISH) usando le sonde essone-specific. Tuttavia, questo uso particolare di ISH è stato limitato poiché esoni alternativi sono generalmente troppo brevi per la progettazione di sonde essone-specific. In questo rapporto, l'uso di BaseScope, una tecnologia sviluppata di recente che si avvale di corti oligonucleotidi antisenso in RNA ISH, è descritto per analizzare come i modelli di espressione nelle sezioni di cervello di topo. Esone 23a di neurofibromatosi di tipo 1 (Nf1) viene utilizzato come esempio per illustrare che sonde di giunzione esone-esone breve mostrano segnali di ibridazione robusto con elevata specificità nell'analisi di RNA ISH su sezioni di cervello di topo. Ancora più importante, i segnali rilevati con sonde specifiche inclusione e saltando essone utilizzabile per calcolare in modo affidabile la percentuale impiombata in valori di Nf1 esone 23a espressione in diverse aree anatomiche di un cervello di topo. Il protocollo sperimentale e metodo di calcolo per analisi sono presentati. I risultati indicano che BaseScope fornisce un nuovo e potente strumento per valutare come espressione modelli in situ.

BaseScope ISH è stata effettuata utilizzando tre diversi ceppi di topi: topi wild type CD1, topi wild type C57BL/6J e Nf123aIN/23aIN topi mutanti in background C57BL/6J, nel quale esone 23a è incluso in tutti i tipi di cellule come conseguenza di engineered della giuntura le mutazioni14,15.
Come primo passo, il sistema di analisi ISH è stato testa...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Ricerca

Genetica

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Chromogenic In Situ Hybridization è uno strumento per la diagnosi del cancro della testa e del collo correlate all'HPV

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...