Name: quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

이 작품은 미국 심 혼 협회 [H.L.에 특정 0365274B]에 의해 지원 되었다 국립 암 연구소 [Z.W. GI 포자 P50CA150964], 건강의 국가 학회 [사무실의 연구 인프라 공유 계측 그랜트 S10RR031845에 가벼운 현미경 검사 법 케이스 서쪽 예비 대학에서 시설 이미지], [X.G.]를 중국 장학금 위원회. 저자는 슬라이드 스캔 빛 현미경 이미징 핵심 그의 도움에 리처드 리를 감사 합니다.

여기에 설명 된 쥐를 포함 하는 실험의 모든 케이스 서쪽 예비 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다. 2016-0068 프로토콜의 제목 (PI: 화 루)은 "척추 개발에 대체 이전 mRNA 접합의 역할".
참고: 모든 장비, 시 약 및 공급이이 프로토콜에 사용 되는 정보 자료의 테이블에에서 포함 됩니다.
1. 준비 포 르 말린 고정된 파라핀 포함...

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. 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N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA.">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li><li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li><li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras/ERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li><li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner.">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes.">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li><li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections.">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome.">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li></ol>

이 통신 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 검사 BaseScope RNA의 사용을 보고 합니다. 그것은 그 반대로 감각 엑손-엑손 접합 프로브 exon 포함 하 고 견고 하 게 하 고 특히 isoforms를 건너뛰는 50 뉴클레오티드 대상 보다 짧은 시연입니다. 또한, 결과 신호 대체 exon의 PSI를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다.
몇 가지 유사 절차에서 테스트 되었습니다. 예를 들어 냉동된 조직 단면도 cr...

대안 접합 (AS)는 사전 mRNA 성숙 하는 동안 발생 하는 일반적인 과정입니다. 이 과정에서는 exon 차동 성숙한 mRNA에 포함 될 수 있습니다. 따라서, AS, 통해 한 유전자 생성할 수 있습니다 많은 mRNAs 다른 단백질 제품에 대 한 코드. 그것은 추정 인간 유전자의 92-94% 대체 접합1,2를 받 다. 비정상적인 대안 접합 패턴에서 결과 유전자 변이 루 경화 증, 암3,4, myotonic 영양 장애 등 질병의 많은 수에 연결 되었습니다. 따라서 조사 하 고 인간의 질병의 새로운 치료법을 찾을 하려고 대체 접합 규제 메커니즘 이해 결정적 이다.
마찬가지로 종종 셀 형식 관련 패션에서 통제 된다. 그것은 생물 학적 시스템에서 특정 유전자의 AS 식 패턴을 결정 하는 것이 중요입니다. 그러나,이 세포, 심장, 뇌 등의 다양 한 종류를 포함 하는 복잡 한 기관 공부 때 복잡 한 됩니다. 이 경우에, 분석 결과 시스템의 이상적인 선택 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) 티슈를 사용 하 여 특정 유전자의 AS 식 패턴 동시에 많은 세포 유형에서 검출 될 수 있다 그래서 섹션입니다. 실제로, exon 전용 프로브 대체 exon5,,67의 식 수준을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나,이 방법은 아니다 적합 패턴 분석으로 다음과 같은 이유로. 첫째, 기존의 틱 방법 일반적으로 사용 하는 프로브 300 이상 혈압, 척추 내부 exons (하지 첫 번째 또는 마지막 exon)의 평균 크기는 170 뉴클레오티드8,9. 둘째, 내부 양자 택일 exon의 접합 패턴을 검사 하는 exon 전용 프로브를 사용 하는 경우 조사에 의해 감지만 mRNA isoform는 exon를 감지할 수 없습니다 없이 mRNA isoform 동안 exon를 포함 하 이다. 따라서, 양자 택일 exon (PSI) 값에 접합 %의 계산 복잡 하다. 또한, 기존의 형광 틱 종종 결합 분 immunostaining, 검출 효율 및 견고성을 감소 시키는. 예를 들어 스트레스 유발 조사 연구에서 isoform acetylcholinesterase (통증)의 스위칭 접합 mRNA, digoxigenin 분 탐침에 통합 했다 및 안티-digoxigenin 항 체를 사용 하 여 감지. 또는, biotin 표시 된 프로브는 알칼리 성 인산 가수분해 효소/streptavidin 공액 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소10기판에 의해 검색 되었습니다. 어느 방법 탐지의 감도 증가 어떤 확대 전략을 사용 합니다. 결과적으로, 그것은 낮은 수준에서 표현 되는 mRNA 사본 검색 도전 이다. 따라서, 간단 하 고 더 강력한 분 분석 결과 시스템은 식 패턴에서 제자리에분석 필요 합니다.
BaseScope는 RNAscope, 잘 설립의 플랫폼에 따라 최근 개발 하 고 널리 이용 되는 분 분석 결과 시스템. 두 분석 결과 시스템 탐지11,12의 감도 증가 하는 특정 대상 증폭 기술을 사용 합니다. 어떻게 구별 하나에서 다른 짧은 BaseScope에 대 한 50 뉴클레오티드 및 RNAscope에 대 한 300-1000 뉴클레오티드는 대상 시퀀스의 길이입니다. 따라서, 디자인 조사 대상 엑손-엑손 접합 특정 대체 mRNA isoforms를 감지 하는 것이 가능 하다. 현재 연구에서 프로시저 neurofibromatosis 식 패턴 입력 1 (Nf1) exon 23a, 같은 실험실13,,1415 에 광범위 하 게 공부 하는 대안 exon 검사 설립 , 16 , 17, 마우스 뇌 섹션에서. 결과 BaseScope는 Nf1 exon 23a 제자리의 식 패턴을 공부 하는 이상적인 시스템을 보여 줍니다. 이 분석 결과 시스템 많은 양자 택일 exons의 표현 패턴 분석에 적응 될 수 있는, 그것은 다른 이름으로의 연구에 강력한 새로운 도구 대표

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>241000ACD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain Rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1160049SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imperial III General Purpose Incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SCN400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pretreatment kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>322381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III*</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Target Retrieval</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2002555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseScope Detection Reagent Kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>332910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 0</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 1</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 2</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 3</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 4</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 5-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 6-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-A</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-B</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16230F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X Wash Buffer</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifying Paper</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Rack</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>9837976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Dishes</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>LWS20WH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12--545-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>002689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formalde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF94-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin I</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>17012359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>173942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

대안 접합 (AS)는 인간 유전자의 90% 이상에서 발생합니다. 양자 택일로 접합된 한 exon의 표현 패턴 셀 형식 관련 패션에서 자주 통제 된다. 패턴은 일반적으로 RT-PCR 및 RNA-seq 분석 식으로 RNA 샘플을 사용 하 여 셀의 인구에서 고립. 현장에서 시험의 특정 생물 학적 구조에 대 한 식 패턴으로는 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) exon 전용 프로브를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나 양자 택일 exons는 일반적으로 너무 exon 전용 프로브 디자인 때문에,의 사용이 제한 되었습니다. 이 보고서에서 BaseScope, 짧은 센스 oligonucleotides RNA 분에를 사용 하 여 최근에 개발 된 기술을 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 분석 설명 되어 있습니다. Exon 23a neurofibromatosis 유형 1 (Nf1)의 짧은 엑손-엑손 접합 프로브 마우스 뇌 섹션에 RNA 분 분석에 높은 특이성을 가진 강력한 교 잡 신호를 전시 설명 하기 위해 예제로 사용 됩니다. 더 중요 한 것은, exon 포함 및 건너뛰는 특정 프로브와 감지 신호 안정적으로 마우스 뇌의 다른 해 부 영역에 Nf1 exon 23a 식의 값에 접합 하는 퍼센트 계산을 사용할 수 있습니다. 실험 프로토콜 및 분석에 대 한 계산 방법 선물 된다. 결과 BaseScope 식 패턴에서 제자리에로 평가 하는 강력한 새로운 도구를 제공 합니다 나타냅니다.

BaseScope 분 3 마우스 종자를 사용 하 여 실시 되었다: CD1 야생 타입 마우스, C57BL/6J 야생 타입 마우스 및 C57BL/6J 배경, 어떤 exon에 23a의 결과로 모든 셀 형식에 포함 되어 있는 n f 123aIN/23aIN 돌연변이 쥐 스플라이스 사이트 설계 변이14,15.
첫 번째 단계로 분 분석 결과 시스?...

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

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