Name: quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela associação americana do coração [subsídio 0365274B para H.L.], National Cancer Institute [P50CA150964 GI SPORE para Z.W.], National Institutes of Health [escritório de pesquisa infra-estrutura compartilhada instrumentação Grant S10RR031845 para a microscopia de luz imagem facilidade na Case Western Reserve University] e China Scholarship Conselho [X.G.]. Os autores graças a Richard Lee do núcleo de Imaging de microscopia de luz por sua ajuda com a digitalização de slides.

Todos os experimentos descritos aqui que envolvem ratos foram aprovados pelo Comitê de utilização e caso Western Reserve University institucional Cuidado Animal. O título do protocolo de 2016-0068 (PI: Hua Lou) é "Papel de alternativo pre-mRNA emendar no desenvolvimento de vertebrados".
Nota: Informações de todos os equipamentos, reagentes e suprimentos utilizados neste protocolo são incluídas na Tabela de materiais.
1. prepare a formalina pa...

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing?.">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?.</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li><li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+in+situ+hybridisation.">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li><li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity.">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA.">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li><li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li><li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras/ERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice.">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li><li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner.">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes.">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li><li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections.">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome.">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li></ol>

A presente comunicação relata o uso de BaseScope RNA ISH para examinar como os padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Está demonstrado que essa junção exon de anti-sentido-exon sondas menor do que 50 nucleótidos podem direcionar exon inclusão e saltando isoformas robusta e especificamente. Além disso, os sinais resultantes podem ser usados para calcular PSI de um exon alternativo.
Algumas variações foram testadas no procedimento. Por exemplo, seções de tecido cong...

Splicing alternativa (AS) é um processo comum que ocorre durante a maturação de pre-mRNA. Neste processo, um exon diferencialmente pode ser incluído no mRNA maduro. Assim, AS, através de um gene pode gerar muitos mRNAs esse código para produtos diferentes da proteína. Estima-se que os 92 – 94% dos genes humanos sofrem alternativas emenda1,2. Alternativa anormal, padrões de emenda resultou de mutações genéticas têm sido associadas a um grande número de doenças, incluindo câncer,3,4, distrofia miotônica e esclerose lateral amiotrófica. Assim, é crucial investigar e entender melhor os mecanismos reguladores splicing alternativos na tentativa de encontrar novos tratamentos de doenças humanas.
COMO muitas vezes é regulada de forma de tipo específico de célula. É importante determinar o padrão de expressão de AS de um gene específico em um determinado sistema biológico. No entanto, isso se torna complicado quando um órgão complexo que contém muitos tipos diferentes de células, tais como o cérebro ou no coração, é estudado. Neste caso, a escolha ideal do sistema de ensaio é RNA em situ hibridação (ISH) usando tecido seções para que o padrão de expressão de AS de um gene específico pode ser detectado em muitos tipos de células simultaneamente. Com efeito, sondas específicas do exon têm sido utilizadas para avaliar os níveis de expressão de uma alternativa exon5,6,7. No entanto, essa abordagem não é adequada para análise do padrão pelas seguintes razões. Em primeiro lugar, convencionais métodos ISH geralmente usam sondas mais de 300 bp, enquanto o tamanho médio dos vertebrados exões internos (não primeiro ou último exon) é 170 nucleotídeos8,9. Em segundo lugar, quando uma sonda exon-específico é usada para examinar o padrão de emenda de um exon alternativo interno, a única isoforma de mRNA detectada pela sonda é aquele que contém o exon, enquanto a isoforma de mRNA sem o exon não pode ser detectado. Assim, o cálculo por cento emendados em valor (PSI) para o exon alternativo é complicado. Além disso, ISH fluorescente convencional muitas vezes combina ISH com imunocoloração, que reduz a eficiência de deteção e robustez. Por exemplo, em um estudo que investigou a induzida por estresse, Emendando isoform comutação da acetilcolinesterase (AChE) mRNA, Digoxigenina foi incorporada a sonda ISH e detectado usando anticorpo anti-Digoxigenina. Alternativamente, biotina-rotulado sonda foi detectada por um fosfatase alcalina/estreptavidina conjugado e um substrato para a fosfatase alcalina10. Nenhum método usa qualquer estratégia de amplificação para aumentar a sensibilidade da deteção. Como resultado, é difícil detectar as transcrições de mRNA que são expressos em níveis baixos. Assim, é necessário um sistema de ensaio ISH mais simples e mais robusto para analisar como expressão padrões em situ.
BaseScope foi recentemente desenvolvido com base na plataforma de RNAscope, uma bem estabelecida e amplamente utilizado o sistema de ensaio ISH. Ambos os sistemas de ensaio utilizam uma tecnologia de amplificação de destino específico que aumenta a sensibilidade da deteção11,12. O que distingue um do outro é o comprimento da sequência de destino, que é tão curto quanto 50 nucleótidos para BaseScope e 300 – 1.000 nucleotídeos para RNAscope. Assim, é possível a concepção sondas junções exon-exon para detectar alternativa específica do mRNA isoformas de destino. No estudo atual, foi estabelecido um procedimento para examinar como testes padrões da expressão de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) exon 23a, um exon alternativo extensivamente estudado no mesmo laboratório13,14,15 , 16 , 17, nas seções de cérebro de rato. Os resultados demonstram que o BaseScope é um sistema ideal para estudar os padrões de expressão de Nf1 exon 23a in situ. Como este sistema de ensaio pode ser adaptado para analisar como padrões de expressão de muitos exões alternativos, representa uma nova ferramenta poderosa nos estudos de AS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>241000ACD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain Rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1160049SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imperial III General Purpose Incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SCN400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pretreatment kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>322381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III*</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Target Retrieval</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2002555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseScope Detection Reagent Kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>332910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 0</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 1</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 2</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 3</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 4</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 5-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 6-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-A</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-B</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16230F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X Wash Buffer</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifying Paper</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Rack</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>9837976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Dishes</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>LWS20WH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12--545-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>002689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formalde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF94-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin I</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>17012359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>173942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

Splicing alternativa (AS) ocorre em mais de 90% dos genes humanos. O padrão de expressão de um exon alternativamente emendado frequentemente é regulado de forma de tipo específico de célula. COMO expressão de padrões normalmente são analisados por RT-PCR e RNA-seq usar amostras do RNA isolado de uma população de células. Em situ exame de como os padrões de expressão para uma particular estrutura biológica pode ser realizada por RNA em situ da hibridação (ISH) usando sondas específicas do exon. No entanto, este uso particular do ISH tem sido limitado porque exões alternativos geralmente são muito curtos para projetar sondas específicas do exon. Neste relatório, o uso de BaseScope, uma tecnologia desenvolvida recentemente que emprega oligonucleotides antisentidos curtos no RNA ISH, é descrito para analisar como padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Exon 23a de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) é usado como um exemplo para ilustrar que curto exon-exon junction sondas exibem sinais de hibridização robusto com alta especificidade na análise de RNA ISH em seções de cérebro de rato. Mais importante, sinais detectados com sondas de inclusão e saltando-específicas do exon podem ser usados para confiantemente, calcular a porcentagem emendada em valores de Nf1 exon 23a expressão em diferentes áreas anatômicas de um cérebro de rato. O protocolo experimental e o método de cálculo para análise são apresentados. Os resultados indicam que o BaseScope oferece uma nova ferramenta poderosa para avaliar como expressão padrões em situ.

BaseScope ISH foi realizado utilizando três estirpes de rato: CD1 selvagem tipo ratos, C57BL/6J selvagem tipo ratos e ratos mutantes de Nf123aIN/23aIN em background C57BL/6J, em qual exon 23a está incluído em todos os tipos de células como resultado de engenharia local da tala mutações de14,15.
Como primeiro passo, o sistema de ensaio ISH foi t...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genética

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Hibridização in situ cromogênica SS uma ferramenta para diagnóstico de câncer de cabeça e pescoço relacionados ao HPV

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...