Name: a quantitative measurement of reactive oxygen species and senescence-associated secretory phenotype in normal human fibroblasts during oncogene-induced senescence
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senesc

Dit werk werd gesteund door een subsidie van de National Research Foundation Korea (2015R1D1A1A01060839) (voor de jonge Yeon Kim) en door een subsidie van de National Research Foundation van Korea (NRF) gefinancierd door de regering van Korea (MSIT) (nr. 2016R1A2B2008887, nr. 2016R1A5A2007009) (tot op Jeanho Yun).

1. inducerende oncogen-geïnduceerde senescentie
<ol><li>
Voorbereiding van een H-RasV12 retrovirus
	<ol>
<li>Coat de schotel van 100 mm cultuur door toevoeging van 2 mL van 0,001% poly-L-lysine/fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder de poly-L-lysine oplossing om met een glazen pipet verbonden met een vacuüm en wassen van de cultuur-schotel door toevoeging van 2 mL 1 x PBS.</li>
		<li>Plaat 3 x 106 ecotropic BOSC-23 verpakking c...

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+cellular+senescence,+and+cancer.">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li><li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development.">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li><li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi.">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li><li>Collado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+biology:+senescence+in+premalignant+tumours.">Tumour biology: senescence in premalignant tumours.</a> Nature. 436 (7051), 642 (2005).</li><li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+the+senescence+secretome+under+control:+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype.">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li><li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes &amp; Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+senescence.">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li><li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress.">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li><li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+proteins+induce+senescence+by+altering+the+intracellular+levels+of+reactive+oxygen+species.">Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).</li><li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells.">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li><li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast.">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li><li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts.">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening.">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li><li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+faces+of+cellular+senescence.">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li><li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype:+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li><li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+senescent+cells+in+ageing.">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence.">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li><li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a.">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry.">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li><li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte.">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li><li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence.">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li><li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence,+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16(ink4a).">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li><li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence.">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency.">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders.">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li><li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging.">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li><li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice.">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li><li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li><li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL.">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190 (2016).</li><li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment.">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li></ol>

Hier hebben we methoden voor controle van intracellulaire ROS niveaus tijdens H-Ras-geïnduceerde senescentie in WI-38 normale menselijke fibroblasten gepresenteerd. Intracellulaire ROS niveaus in levende cellen kunnen worden gemeten met behulp van de cel-permeabele reagens DCF-DA kwantitatief en stroom cytometry. Op cellulaire opname, is DCF-DA door intracellulaire esterasen deacetylated en vervolgens geoxideerd door ROS te vormen zeer fluorescerende 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF). DCF-fluorescentie kan worden gedetec...

Meer dan 50 jaar geleden, bleek Hayflick en Moorhead dat normale cellen onomkeerbare groei arrestatie op de uitputting van hun proliferatieve potentieel na een bepaald aantal celdelingen1 invoeren. Dit fenomeen is nu bekend als Dr. senescentie en gelooft te sterk correleren met organisch veroudering2. Hoewel de geleidelijke erosie van de telomeren wordt beschouwd als een belangrijke oorzaak van Dr. senescentie, zijn diverse cellulaire benadrukt, zoals DNA schade oncogene activering en oxidatieve stress, voor het opwekken van een ander type van cellulaire senescentie gemeld "voorbarig senescentie" of "stress-induced senescentie" genoemd. Interessant, speelt voortijdige senescentie een potente tumor-onderdrukkende rol bij de activering van oncogenen zoals H-Ras en BRAF. Studies van Muismodellen en menselijke weefsels hebben sterke aanwijzingen dat biomarkers voor cel senescentie waren voornamelijk aanwezig in Premaligne laesies waar oncogene Ras en BRAF worden geactiveerd maar werden afgenomen in kwaadaardige kanker die ontwikkeld op basis van Deze letsels3,4,5. Naast haar rol in veroudering en onderdrukking van de tumor, is cellulaire senescentie aangetoond in eerdere studies een rol te spelen in verschillende fysiologische processen, met inbegrip van wondgenezing, weefselherstel, immuun toezicht en embryonale ontwikkeling6.
Hoewel groei arrestatie heeft uitvoerig bestudeerd als een stempel van cellulaire senescentie7, suggereert een aanzienlijke hoeveelheid bewijs dat intracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) draagt ook bij tot cellulaire senescentie8. De hoogte van ROS niveaus tijdens verschillende soorten cellulaire senescentie, met inbegrip van Dr. senescentie en oncogen-geïnduceerde senescentie (OIS), werd oorspronkelijk gemeld decennia geleden9,10. Een meer direct, exogene behandeling met een subletale dosis H2O2 induceert senescentie11,12. De remming van ROS-opruiming enzymen, zoals SOD1, veroorzaakt ook voorbarig senescentie13. In tegenstelling, lage omgevingstemperatuur zuurstof voorwaarden en het vergroten van ROS opruiming vertraging het intreden van senescentie10,14,15. Deze resultaten geven ongetwijfeld dat ROS belangrijk bemiddelaars of determinanten van cellulaire senescentie inductie zijn. Echter hoe ROS bijdragen tot de inductie van cellulaire senescentie en hoe ROS niveaus zijn verheven tijdens cellulaire senescentie nader onderzoek.
Recente studies is gebleken dat verouderend cellen potente paracrine activiteiten op naburige cellen en weefsels door een SASP16,17 hebben. In leeftijd weefsel bevorderen verouderend cellen leeftijdsgebonden weefsel disfuncties via vele paden door SASP naast een autonome uitputting van de proliferatieve cellen. Verschillende proinflammatoire factoren, zoals IL-6, IL-8, TGFβ en matrix metalloproteinasen (MMP), uitgescheiden door verouderend cellen, veroorzaken de dysfuncties van de leeftijdsgebonden weefsel door de verslechtering van de weefsel homeostase, vernietiging van het weefsel architectuur, senescentie van naburige cellen en steriele ontsteking18,19. Echter kan SASPs hebben gunstige effecten afhankelijk van de biologische context. Bovendien, hangt de aard van de heterogenetic van de SASPs af van het celtype verouderend en de cel fase, nadruk op de noodzaak van verder onderzoek19.
Hier beschrijven we snelle en gevoelige cytometry gebaseerde technieken voor de beoordeling van intracellulaire ROS niveaus tijdens OIS. Bovendien, de methoden voor de analyse van SASP factoren met behulp van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) en ELISA zijn ingevoerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOSC 23</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>wellgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30013.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBabe puro-H-RasV12&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGAG/pol</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSVG</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>8 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>2 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &#946; D-galactopyranoside (X-gal)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>wellgene</td>
			<td>LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCF-DA</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D6883</td>
			<td>10 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMLV Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR master 2X mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>PR820A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C118A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 ELISA assay</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>#900-TM16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 ELISA assay</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>#900_TM18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>16555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>BEMIS&#160;</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4ml</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>UFC800324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>BioDrop</td>
			<td>80-3006-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI Prism 7500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>EMax microplate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative measurement of reactive oxygen species and senescence-associated secretory phenotype in normal human fibroblasts during oncogene-induced senescence

Cellulaire senescentie is beschouwd als een staat van onomkeerbare groei arrestatie na uitputting van de proliferatieve capaciteit of blootstelling aan verschillende benadrukt. Recente studies hebben uitgebreid de rol van cellulaire senescentie naar verschillende fysiologische processen, met inbegrip van de ontwikkeling, wondgenezing, immuun toezicht en leeftijdsgebonden weefsel dysfunctie. Hoewel celcyclus arrestatie een essentieel kenmerk van cellulaire senescentie is, heeft een verhoogde intracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) productie ook aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Recente studies bleek bovendien dat verouderend cellen krachtige paracrine activiteiten op naburige cellen en weefsels via een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP exposeren). De scherpe stijging van de rente met betrekking tot therapeutische strategieën tegen cellulaire senescentie onderstreept de noodzaak van een nauwkeurig inzicht in senescentie mechanismen, met inbegrip van intracellulaire ROS en de SASP. We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van kwantitatief intracellulaire ROS niveaus tijdens H-Ras-geïnduceerde cellulaire senescentie met behulp van ROS-gevoelige fluorescente kleurstof en stroom cytometry. Daarnaast introduceren we gevoelige technieken voor de analyse van de inductie van mRNA uitdrukking en secretie van SASP factoren. Deze protocollen kunnen worden toegepast op verschillende cellulaire senescentie modellen.

Een voorbeeld van H-Ras-geïnduceerde senescentie is weergegeven in Figuur 1. Een infectie van het normale menselijke fibroblasten WI-38 met de H-RasV12-retrovirus geïnduceerde dramatische morfologische veranderingen (figuur 1B). Bovendien, zoals blijkt uit Figuur 1 c, SA β-gal kleuring activiteit was opmerkelijk steeg op H-RasV12 expressie. Meer dan 70% van de cellen toonde SA β-gal kleuring acti...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senesc

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Intracellulaire ROS heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Hier beschrijven we een gevoelige assay voor het kwantificeren van ROS niveaus tijdens cellulaire senescentie. We bieden ook protocollen voor de beoordeling van het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype, die naar verluidt aan verschillende leeftijdsgebonden disfuncties bijdraagt.

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Oprichting van Proliferatieve Tetraploïde Cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Evaluatie van intracellulaire locatie van reactieve zuurstof soorten in Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Lichtgemedieerde Terugkeerbare Modulatie van de Mitogeen-Geactiveerde Proteïne Kinase Pathway tijdens Cell Differentiatie en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Ontwikkeling

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...