Name: a quantitative measurement of reactive oxygen species and senescence-associated secretory phenotype in normal human fibroblasts during oncogene-induced senescence
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senesc

Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de la recherche National de Corée (2015R1D1A1A01060839) (à Young Yeon Kim) et par une subvention de la Fondation de recherche National de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée (MSIT) (no 2016R1A2B2008887, no 2016R1A5A2007009) (à Jeanho Yun).

1. induisant la sénescence induite par l’oncogène
<ol><li>
Préparer un H-rétrovirus RasV12
	<ol>
<li>Manteau de la boîte de Petri de 100 mm en ajoutant 2 mL de 0,001 %, poly-L-lysine/phosphate solution saline tamponnée (PBS pendant 5 min) à température ambiante.</li>
		<li>Enlever la solution de la poly-L-lysine à l’aide d’une pipette en verre reliée à un aspirateur et lavez la boîte de Petri en ajoutant 2 mL de solution 1 PBS x.</li>
		<li>Plaque 3 x 106 ecotropic BOSC-23 ...

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+cellular+senescence,+and+cancer.">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li><li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development.">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li><li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi.">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li><li>Collado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+biology:+senescence+in+premalignant+tumours.">Tumour biology: senescence in premalignant tumours.</a> Nature. 436 (7051), 642 (2005).</li><li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+the+senescence+secretome+under+control:+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype.">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li><li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes &amp; Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+senescence.">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li><li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress.">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li><li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+proteins+induce+senescence+by+altering+the+intracellular+levels+of+reactive+oxygen+species.">Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).</li><li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells.">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li><li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast.">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li><li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts.">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li><li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells.">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li><li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening.">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li><li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+faces+of+cellular+senescence.">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li><li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype:+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li><li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+senescent+cells+in+ageing.">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence.">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li><li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a.">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li><li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+(ROS)+in+cancers.">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li><li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry.">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li><li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte.">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li><li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence.">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li><li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li><li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence,+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16(ink4a).">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li><li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence.">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency.">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders.">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li><li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging.">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li><li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice.">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li><li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice.">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li><li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL.">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190 (2016).</li><li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment.">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li></ol>

Ici, nous présentons des méthodes de surveillance des niveaux intracellulaires de ROS au cours de la sénescence induite par H-Ras dans les fibroblastes humains normaux WI-38. Intracellulaire ROS dans les cellules vivantes peut être mesurée quantitativement à l’aide du réactif perméable à la cellule DCF-DA et cytométrie en flux. Après absorption cellulaire, DCF-DA est désacétylée par les estérases intracellulaires et, par la suite, oxydé par ROS pour former très fluorescent 2', 7'-dichlorofluorescéine ...

Plus de 50 ans, Hayflick et Moorhead a révélé que les cellules normales entrent dans l’arrestation de croissance irréversible sur l’épuisement de leur potentiel prolifératif après un certain nombre de divisions cellulaires1. Ce phénomène est maintenant connu comme la sénescence réplicative et croit fortement en corrélation avec le vieillissement organismique2. Bien que l’érosion progressive des télomères est considéré comme une cause majeure de la sénescence réplicative, divers stress cellulaires, tels que des dommages ADN, l’activation oncogène et le stress oxydatif, ont été signalés à induire un autre type de sénescence cellulaire appelé « sénescence prématurée » ou « sénescence induite par le stress ». Fait intéressant, la sénescence prématurée joue un rôle de tumeur comprimant puissant lors de l’activation d’oncogènes tels que H-Ras et BRAF. Des études de modèles murins et tissus humains ont donné des preuves solides que les biomarqueurs de la sénescence cellulaire ont été principalement présents dans les lésions précancéreuses où oncogène Ras et BRAF sont activées mais ont diminué dans les cancers malins qui élaborés à partir ces lésions3,4,5. Au-delà de son rôle dans le vieillissement et la suppression tumorale, sénescence cellulaire a été démontrée dans des études antérieures à jouer un rôle dans divers processus physiologiques, notamment la cicatrisation des plaies, la réparation des tissus, surveillance immunitaire et développement embryonnaire6.
Bien que l’arrêt de la croissance a été particulièrement étudié comme une caractéristique de la sénescence cellulaire7, un nombre significatif de preuves suggère que les espèces réactives intracellulaire de l’oxygène (ROS) contribuent également à la sénescence cellulaire8. L’élévation des niveaux ROS au cours de différents types de sénescence cellulaire, y compris la sénescence réplicative et la sénescence induite par l’oncogène (OIS), a été rapportée à l’origine des décennies il y a9,10. Plus directement, au traitement exogène avec une dose sublétale de H2O2 induit la sénescence11,12. L’inhibition des enzymes ROS-nettoyage, comme la SOD1, provoque également la sénescence prématurée13. En revanche, faible oxygène ambiant et augmentant retard antiradicalaire ROS le début de la sénescence10,14,15. Sans aucun doute, ces résultats indiquent que les ROS sont des médiateurs importants ou des déterminants de l’induction de la sénescence cellulaire. Cependant, comment ROS contribuent à l’induction de la sénescence cellulaire et comment ROS taux sont élevés au cours de la sénescence cellulaire doivent être enquête.
Études récentes ont révélé que les cellules sénescentes ont puissant paracrine activités sur les voisins des cellules et des tissus à travers une SASP16,17. Dans les tissus âgés, cellules sénescentes promouvoir des dysfonctionnements liés à l’âge des tissus via plusieurs sentiers à travers de la SASP en plus un appauvrissement de la couche de cellules prolifératives autonome. Divers facteurs pro-inflammatoires, telles que l’IL-6, IL-8, TGFβ et métalloprotéinases matricielles (MMP), sécrétée par les cellules sénescentes, causer des dysfonctions liées à l’âge des tissus par le biais de l’altération de l’homéostasie tissulaire, destruction de l’architecture tissulaire, sénescence des cellules voisines et inflammation stérile18,19. Cependant, SASP peut avoir des effets bénéfiques selon le contexte biologique. En outre, la nature hétérogénétique de SASP dépend du type de cellules sénescentes et le stade de cellules, mettant l’accent sur la nécessité de plus amples recherches19.
Nous décrivons ici les techniques axée sur la cytométrie en flux rapides et sensibles pour évaluer les niveaux intracellulaires de ROS au cours de l’OIS. En outre, les méthodes pour l’analyse des facteurs SASP utilisation quantitative PCR en temps réel (qPCR) et ELISA sont introduites.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOSC 23</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>wellgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30013.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBabe puro-H-RasV12&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGAG/pol</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSVG</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td>8 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>2 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &#946; D-galactopyranoside (X-gal)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>wellgene</td>
			<td>LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCF-DA</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D6883</td>
			<td>10 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMLV Reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green PCR master 2X mix</td>
			<td>Takara</td>
			<td>PR820A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C118A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 ELISA assay</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>#900-TM16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 ELISA assay</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>#900_TM18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m syringe filter</td>
			<td>sartorius</td>
			<td>16555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>BEMIS&#160;</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4ml</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>UFC800324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>BioDrop</td>
			<td>80-3006-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI Prism 7500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>EMax microplate reader</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative measurement of reactive oxygen species and senescence-associated secretory phenotype in normal human fibroblasts during oncogene-induced senescence

Sénescence cellulaire a été considérée comme un état d’arrêt de la croissance irréversible après épuisement des capacité proliférative ou l’exposition à divers stress. Des études récentes ont élargi le rôle de la sénescence cellulaire à divers processus physiologiques, y compris le développement, la cicatrisation des plaies, surveillance du système immunitaire et dysfonction liée à l’âge des tissus. Bien que l’arrêt du cycle cellulaire est une caractéristique essentielle de la sénescence cellulaire, la production d’une augmentation intracellulaire réactives de l’oxygène (DRO) a aussi démontrée à jouer un rôle important dans l’induction de la sénescence cellulaire. En outre, des études récentes ont révélé que les cellules sénescentes ont activités paracrine puissants voisins des cellules et des tissus par un phénotype sécrétoire associée à la sénescence (SASP). La forte augmentation de l’intérêt au sujet des stratégies thérapeutiques contre la sénescence cellulaire met l’accent sur la nécessité d’une compréhension fine des mécanismes de la sénescence, y compris les ROS intracellulaire et la SASP. Nous décrivons ici les protocoles pour évaluer quantitativement les niveaux intracellulaires de ROS au cours de la sénescence cellulaire induite par H-Ras à l’aide de colorant fluorescent ROS-sensible et cytométrie en flux. En outre, nous introduisons des techniques sensibles pour l’analyse de l’induction de l’expression de l’ARNm et la sécrétion des facteurs de la SASP. Ces protocoles peuvent être appliqués aux divers modèles de sénescence cellulaire.

Un exemple de la sénescence induite par H-Ras est illustré à la Figure 1. Une infection de fibroblastes humains normaux de WI-38 avec le rétrovirus H-RasV12 provoqué des changements morphologiques dramatiques (Figure 1 b). En outre, comme le montre la Figure 1, activité coloration SA β-gal a augmenté remarquablement une expression H-RasV12. Plus de 70 % des cellules ont montré SA β-gal colo...

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A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

ROS intracellulaire a été démontré à jouer un rôle important dans l’induction de la sénescence cellulaire. Nous décrivons ici une analyse sensible pour quantifier les niveaux ROS au cours de la sénescence cellulaire. Nous fournissons également des protocoles d’évaluation le phénotype sécrétoire associée à la sénescence, qui aurait été contribue à diverses dysfonctions liées à l’âge.

Une mesure Quantitative des espèces réactives de l’oxygène et phénotype sécrétoire associée à la sénescence dans des fibroblastes humains normaux pendant la sénescence induite par l’oncogène

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Recherche

Biologie du développement

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Mise en place de cellules tétraploïdes proliférative de fibroblastes humains non transformés

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Évaluation de la localisation intracellulaire des espèces réactives de l’oxygène dans les spermatozoïdes de Solea Senegalensis

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et<em&gt; Xenopus</em&gt; Développement embryonnaire

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induction et la Validation de la sénescence cellulaire dans les cellules humaines primaires

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Base d’ARN reprogrammation des fibroblastes humains de primaires sur les cellules souches pluripotentes induites

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...