Name: a 3-dimensional (3d)-printed template for high throughput zebrafish embryo arraying
Uploaded: 2018-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying at JoVE.com

Detta arbete stöds av programmet ”1000plan ungdom”, start medlen från Tongji University och NSFC Grant # 21607115 och 21777116 (Lin).

1. design och tillverkning av en zebrafiskar embryon Arraying mall
<ol><li>
Utforma mallen arraying med en 12 av 8, 96 brunnar layout som passar en standard plattan med 96 brunnar. Använd måtten som anges i figur 1A för övre embryo brottsprovokation kammaren (se även kompletterande filen).
	<ol>
<li>Använd de dimensioner som visas i figur 1B och 1 D för entrapment väl.</li>
		<li>Använda mått i f...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Leslie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+larvae+could+help+to+personalize+cancer+treatments.">Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments.</a> Science. 357 (6353), 745-745 (2017).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Transformation,+Speciation,+and+Hazard+Potential+of+Copper+Particles+in+a+Model+Septic+Tank+System+Using+Zebrafish+to+Monitor+the+Effluent.">Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent.</a> ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+ratio+plays+a+role+in+the+hazard+potential+of+ceo2+nanoparticles+in+mouse+lung+and+zebrafish+gastrointestinal+tract.">Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract.</a> ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+in+zebrafish+speeds+up+hazard+ranking+of+transition+metal+oxide+nanoparticles.">High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles.</a> ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).</li><li>Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Scanning+Transmission+electron+microscopy+(nanotomy)+of+healthy+and+injured+zebrafish+brain.">Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Phenotype+Recognition+for+Zebrafish+Embryo+Based+In+vivo+High+Throughput+Toxicity+Screening+of+Engineered+Nano-Materials.">Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Tu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Categorization+and+Scoring+of+Solid,+Part-Solid+and+Non-Solid+Pulmonary+Nodules.">Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules.</a> in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li><li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies.">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li></ol>

Det finns två kritiska steg i detta protokoll som kräver stor uppmärksamhet för ett framgångsrikt genomförande av 3D-tryckt mall för arraying zebrafiskar embryon.
Den viktigaste faktorn om utformningen av mallen arraying är entrapment väl. Till gör att det finns bara ett embryo instängd i varje brunn, en bör ägna stor uppmärksamhet åt diametern och djupet av entrapment brunnen, och diametern på den genomgående hål. Rekommenderade diametern är inom 1,5 till 2 gånger av en ty...

Som en populär modellorganism, är zebrafisk allmänt används i fälten för läkemedel och toxikologi1,2,3,4. Jämfört med in vitro- plattformar, zebrafiskar erbjuder mycket större biologiska komplexitet som en eller två celltyper kunde inte erbjuda. Förutom att vara en hel organism modell, zebrafiskars stora fruktsamhet, snabb och samtidiga embryonal utveckling och hög orgel translucens har gett denna modell unika fördelar som ska användas för storskaliga toxicitet eller droger/förening screening5. Hundratals embryon produceras av ett par vuxna zebrafiskar varje vecka överträffa alla andra hela djurmodeller och har gjort det lämpar sig för hög genomströmning screening.
En typisk screeningförfarande med zebrafiskar innebär en betydande mängd manuellt arbete, såsom vuxna zebrafiskar lekande, embryo urval, och arraying embryon i lämpliga behållare där de utsätts för exponering genom nedsänkning i vatten. Utvecklingen av embryon övervakas och observerbara slutpunkter som dödlighet, kläckbarhet och abnormitet ofta utvärderas manuellt och används som identifiering av preliminära toxicitet av kemikalier eller upplysningar av effektivitet droger eller föreningar. För att påskynda screeningen, har lösningar som automatiserad avbildning och datorstödd bildanalys undersökts tidigare. Till exempel, har Mikroskop med hög halt imaging funktioner anpassats till utföra automatiserade ljusa fält eller fluorescens imaging på zebrafiskar embryon i olika utvecklingsstadier från plattor med 96/3846. Mikroflödessystem enheter tillsammans med Mikroskop användes att placera zebrafiskar larver genom nuvarande manipulation för avbildning av hjärnan nervceller7. Dessa metoder kan avsevärt förbättra effektiviteten i bild förvärv jämfört med traditionell manuell drift. Dessutom med stort antal bilder som genereras, har bild analysverktyg också utvecklats för att påskynda databehandlingen, vilket framgår av Liu et al. och Tu o.a. 8 , 9.
Som dataflödesnivån bildbehandling och bildanalys ökar, blev det klart att det hastighetsbegränsande steget för screening ligger håller på att förbereda zebrafiskar embryon för exponering, vilket vanligtvis betyder att arraying dem i 96 - eller 384-bra plattor. För att lösa denna flaskhals steg, vision-guidad robotics har utvecklats av Mandrell o.a. 10 och oss11 tidigare att ersätta manuell hantering men instrumenten var ganska sofistikerad och det finns en djup inlärningskurva att genomföra sådana tekniker. Därför att ge en lätt-till-använda tillvägagångssätt blir en viktig faktor att ytterligare förbättra dataflödesnivån zebrafiskar screening och är huvudsyftet med detta arbete.
I detta arbete, vi utformade och tillverkade ett embryo arraying mall av 3D-utskrifter. En sådan arraying mallen är utformad att snärja zebrafiskar embryo i brunnar som passar med en standard plattan med 96 brunnar. Istället för att välja embryon och arraying dem i enskilda brunn en efter en, kunde en utföra array och embryo klämskador alla 96 embryon i en storsäck av plattan på en gång. Använda den här mallen och följande protokoll, kunde en avsevärt öka effektiviteten av arraying embryon i storsäck av plattor, som skulle i termen boost screening kapacitet minst tiofalt, jämfört med manuell drift. Protokollet beskrivs nedan innehåller en övergripande design för arraying mall, zebrafiskar lekande, embryosamlingsgrupper och arraying. Figur 1 visar den övergripande utformningen av mallen arraying. Figur 2 visar en översikt av stegvisa protokollet på med hjälp av mallen som beskrivs i delarna 3 och 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1557">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Zebrafish Facility</td>
			<td style="width:425px;">Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td style="width:229px;">Z-A-S5</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Mating box</td>
			<td style="width:425px;">Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Wash Bottle, 500 ml</td>
			<td style="width:425px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:229px;">F505001-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:425px;">Vetec</td>
			<td style="width:229px;">V900058-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:425px;">Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td style="width:229px;">10016318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:425px;">Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td style="width:229px;">20011160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td style="width:425px;">Vetec</td>
			<td style="width:229px;">v900182-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue Hydrate</td>
			<td style="width:425px;">TCI</td>
			<td style="width:229px;">M0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:425px;">Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td>
			<td style="width:229px;">10011008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Sea Salts</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td style="width:229px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipetter</td>
			<td style="width:425px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:229px;">13-675M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Controlled Drop Pasteur Pipet</td>
			<td style="width:425px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:229px;">13-678-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Microscope</td>
			<td style="width:425px;">OLYMPUS</td>
			<td style="width:229px;">SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biochemical incubator</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>LRH-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3D printer</td>
			<td>UnionTech</td>
			<td>Lite600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Photosensitive resin</td>
			<td>UnionTech</td>
			<td>UTR9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum pump</td>
			<td>Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>SHB-IIIA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Adhesive PCR Plate Seals</td>
			<td style="width:425px;">Solarbio</td>
			<td style="width:229px;">YA0245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td style="width:425px;">Costar</td>
			<td style="width:229px;">3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Multi 8-channel pipette 30 - 300 &#956;l</td>
			<td style="width:425px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:229px;">3122000.051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Compressed Gas Duster</td>
			<td style="width:425px;">Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.</td>
			<td style="width:229px;">ST1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">DI Water</td>
			<td style="width:425px;">Thermo</td>
			<td style="width:229px;">GenPure Pro UV/UF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Drying oven</td>
			<td style="width:425px;">Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td>
			<td style="width:229px;">BPG-9106A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">System water</td>
			<td style="width:425px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:429px;">Water out of the facility&#8217;s water system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:475px;">Egg water</td>
			<td style="width:425px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:429px;">Dilute 60mg &#8220;Instant Ocean&#8221; sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water</td>
		</tr>
		<tr height="116">
			<td height="116" style="height:116px;width:475px;">Holtfreter&#8217;s solution</td>
			<td style="width:425px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:429px;">Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3-dimensional (3d)-printed template for high throughput zebrafish embryo arraying

Zebrafiskar är en globalt erkänd färskvatten organismen används ofta i utvecklingsbiologi, miljötoxikologi och mänskliga sjukdomar relaterade forskningsområden. Tack vare sina unika egenskaper, inklusive stora fruktsamhet, embryo translucens, snabb och samtidig utveckling, etc., zebrafiskar embryon används ofta för stor skala toxicitet bedömning av kemikalier och läkemedel/förening screening. En typisk screeningförfarande innebär vuxen zebrafiskar lekande, embryon urval och arraying embryon till plattor med flera. Därifrån, embryon utsätts för exponering och kemiska toxicitet eller effektiviteten av de droger/föreningarna kan utvärderas relativt snabbt utifrån fenotypiska observationer. Bland dessa processer är embryon arraying en av de mest tidskrävande och arbetsintensiva steg som begränsar dataflödesnivån. I detta protokoll presenterar vi en nyskapande strategi som gör användningen av en 3D-tryckt arraying mall tillsammans med vakuum manipulation för att påskynda detta mödosamma steg. Protokollet häri beskriver den övergripande utformningen av mallen arraying, detaljerade experiment och stegvisa anvisningar, följt av representativa resultat. När genomförs, bör detta tillvägagångssätt bevisa fördelaktigt i en mängd forskningstillämpningar med zebrafiskar embryon som testning ämnen.

Figur 3 visar en typisk 3D-tryckt arraying mall. Den här mallen använder ljuskänsliga harts som råvara och gjordes av en 3D-skrivare; ett lager svart färg tillämpades för att ge en bättre kontrast till färgen på embryon. Positionen för 96 brunnarna (12 av 8) var utformad för att passa med en standard plattan med 96 brunnar. Likaså en 384 (24 av 16) väl mall kunde också vara utformade och tillverkade med samma metod. Uppåtsidan kammare var någ...

Watch this Scientific Journal Video about A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying at JoVE.com

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Här presenterar vi ett protokoll för att designa och tillverka ett zebrafiskar embryo arraying mall, följt av en detaljerad procedur på användningen av sådan mall för hög genomströmning zebrafiskar embryo arraying in en plattan med 96 brunnar.

En 3-dimensionell (3D)-tryckt mall för hög genomströmning zebrafiskar Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Research

JoVE Journal

Environment

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Fastställande av mikrobiell extracellulär enzymaktivitet i Vatten, Jord och sediment med hjälp av hög genomströmning mikroplattor Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Hög kapacitet Fluorometrisk Mätning av Potential Soil Extracellulär Enzymaktiviteter

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimerad Negativ Färgning: a hög kapacitet protokoll för prövningen Liten och Asymmetric Protein Structure genom elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

Semi-högkapacitetsscreening för Potentiell torka-tolerans Sallad (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) arvsmassa samlingar

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Hög genomströmning Screening av motsträvighet Variationer i lignocellulosabiomassa: Total Lignin, Lignin monomerer, och enzymatisk Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

RGB och spektrala Root Imaging för växt fenotypning och fysiologisk forskning: experiment och Imaging protokoll

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

Grundforskning i Plasma medicin - en genomströmning strategi från vätskor till celler

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Hög genomströmning, hur provtagningsutrustningen skall protokollet för analys av bearbetning parametrar och näringsvärde i majs (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Singel-genomströmning kompletterande högupplösta analysmetoder för kännetecknar komplexa naturliga organiska ämnen blandningar

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Evaluation of the Productivity of Social Wasp Colonies (Vespinae) and an Introduction to the Traditional Japanese Vespula Wasp Hunting Technique

Evaluation of the Productivity of Social Wasp Colonies Vespinae and an Introduction to the Traditional Japanese Vespula Wasp Hunting Technique

Utvärdering av produktiviteten av sociala Wasp kolonier (Vespinae) och en introduktion till den traditionella japanska Vespula Wasp jaktteknik

For vespine wasps, colony productivity is typically estimated by counting the number of larval cells. This paper presents an improved method that enables ...