Name: frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion
Uploaded: 2018-07-04T14:00:00
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著者は、夫妻ジェニファー ヤンとアレクサンダー (サーシャ) カウフマンの多くの有用な重要な議論と同様に、この手法でテクニカル サポートをありがとうございます。血清ホルモン アッセイは、再現リガンド アッセイ研究解析コア、ユーニス · ケネディ · シュライバー NICHD/NIH (NCTRI) グラント P50 HD28934 によってサポートされているヴァージニアの大学センターで 2017 ヤンら、によって行われました。
研究支援の源: R01 NICHD 86100 (巴)、RBM T32 NICHD 007203 によって支えられました。

ここで説明したメソッドは国家機関の動物医療と使用ガイドラインに一致して、機関動物ケアとカリフォルニア大学サン ディエゴ校利用委員会によって承認されています。
1. 馴化処理
<ol><li>処理手順<ol>
<li>キャビネット、バイオ セーフティにおけるマウス ケージを配置します。ケージとバイオ セーフティ キャビネット内の適切な表面 (例えばきれいなケージ?...

<ol>
	<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li><li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li><li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice.">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li><li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. 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Animal Welfare Inspection Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017)</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li></ol>

ここで全血尻尾先端サンプル マウスの拍動の LH 分泌の評価のための頻繁に血のコレクションのためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、心理社会的ストレスへの暴露に続く拍動の LH 分泌の急性変化の検出のためのサンプルの収集を有効し、LH パルスの他の急性または慢性の操作の評価に適しています。
このプロトコル LH パルスの信頼性と堅牢性のプロフ?...

哺乳類の生殖腺機能、性腺刺激ホルモン分泌、黄体形成ホルモン (LH)、卵胞刺激ホルモンは、脳下垂体からによって異なります。性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) の視床下部分泌への応答での拍動やサージ パターンで、性腺刺激ホルモンが分泌されます。合成と LH と FSH の分泌、視床下部 GnRH、生殖腺ステロイド ホルモン、アクチビン-インヒビン-フォリスタチン システムとの無数を含む分子の様々 な内分泌、パラクリンやオートクリン アクションによって規制されています。生理的ストレスとエネルギーのバランスを含みます。2
血液中の LH 拍動パターンはおよそ指数除去に続いて、末梢血に lh ではなく急激な放電から発生します。重要なパターンの各 LH 放電の頻度と LH 反応の振幅が備わって、どちらのによって決定されます、一部、視床下部下垂体門脈血の測定のための収集の難しさに GnRH。 期限のリリース拍動の GnRH、サンプリングと LH の測定は、視床下部-下垂体-性腺軸の GnRH 調節のプロキシとして使用されます。そのため、重要な情報は、周波数と振幅、LH のパルスは、1 つのサンプルからは判断できないのでエンコードされます。
LH の律動性分泌の解析とその大規模な血液量と頻繁に血液検体採取許容のための大型哺乳類 (ヒト、霊長類、羊) に限定されてきました。齧歯動物、頻繁に採血はラットに限られていたし、心房カテーテルを留置することでいます。3,4比較的低コストと遺伝の可用性 (例えばcre lox、CRISPR) し、複雑な神経回路 (例えばオプトジェネティクス、chemogenetics) 操作するマウス魅力的なモデル有機体;しかし、頻繁に血液サンプルの達成と LH 濃度の後続の分析まで最近、実証してとらえどころのないです。この記念碑的なタスクは、スタインと協力者によって開拓されました。1以来、いくつかのラボは、頻繁に採血と様々 な実験パラダイムの拍動性の LH 分泌を評価する超高感度の LH アッセイを利用し始めています。5,6,7,8,9に留意は道に沿って作った複数の改良と、少なくとも 40 年10に対して進行中のマウスから複数の血液サンプルを集めることの実用的な方法の追求がされていること。11,12
LH パルス パターン (すなわち周波数、振幅) の評価は、この遺伝的扱いの動物モデルの基底のゴナドトロピン分泌の監視の主要な改良を表します。従来、単一の血液サンプルにマウスで LH 濃度を測定しました。シングル ポイントのサンプルの 1 つの弱点は、LH 濃度は、当然のことながら各パルス中に変動非常に可変データ セット。もう一つの弱点は、孤立した測定は本質的に lh パルスのパターンによって伝えられる重要な情報を逃すことです。したがって、自由行動下で頻繁に血液サンプルを集めるための方法、気ままなマウス (サンプリング中に穏やかな処理) を除いて、拡張情報を提供し、有用性拍動性ホルモンの規則を調べる多くの研究所を。
ここでは、頻繁のコレクションのためのプロトコルについて述べる (6 分毎) 血液サンプル目を覚まし、気ままなマウスから。重要なは、我々 は、処理を含める全血試料中の拍動の LH 分泌の堅牢で連続検出は、事前および事後評価急性チャレンジにする時間の長さを決定することができますで収集できる順化プロトコルなど固定化と抑制の心理社会的ストレスに対する応答です。全血中 LH 濃度の効果的なアッセイが以前に記載されています。1この議定書は LH パルス測定のための血液サンプルを集めるための方法に焦点を当てた。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosaftey cabinet</td>
			<td style="width:121px;">Lab Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">L/F-B</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4 (anhydrous)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure water</td>
			<td style="width:121px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purified and filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Broome Rodent Restraint Device</td>
			<td style="width:121px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">52-0460</td>
			<td style="width:183px;">Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">DynPeak</td>
			<td style="width:121px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:183px;">http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion

多くの内分泌システム、継続的に放出されていない循環の要因やホルモンが放出因子の応答の離散パルスとして分泌されます。シングル ポイント サンプリング対策は通常生理学的な条件の下でまたは不全の条件時に拍動性ホルモンの分泌のパターンの生物学的意義を十分に理解して適切です。黄体形成ホルモン (LH) が下垂体前葉の gonadotrope 細胞によって合成・ パルスの評価のための血液サンプルを頻繁に回収を必要とする拍動パターンで分泌されます。これは、マウスで最近まで高感度 LH 測定法の開発は、可能なされていないとの技術の進歩は、低ボリュームのサンプル コレクション、最初ジムと同僚によって記述を頻繁に。1ここで LH の律動性分泌を検出する十分な処理環境に順応マウスから頻繁に末梢血サンプルのコレクションのためのプロトコルについて述べる。現在のプロトコルは、複数時間にわたって LH の堅牢で連続パルスの評価を可能にする拡張の馴化期間を詳しく説明します。このプロトコルでは尾の先端がクリップされて、手持ちピペットを使用して尻尾からは採血します。シリアルのサンプルは、ごきぶりマウスで拍動の LH の評価のため重要なは、90-180 分に 5-6 分毎に収集血のコレクションと LH の堅牢なパルスの測定は、十分な処理を与え目を覚まし、自由行動下のマウスで行うことが順化および環境ストレスを最小限にするため。十分な馴化は、採血前に 4-5 週間以内に達成できます。このプロトコルはマウス神経内分泌研究の強力な動物モデルの複数の時間にわたって拍動の LH 分泌パターンの評価の全血試料の収集を確保するための方法論の進歩を強調表示します。

4 マウスから代表的な LH パルス パターンは、図 1 (データ転載ヤンら2017) に表示されます。LH は、急性の心理社会的ストレス チャレンジへの応答を決定するため頻繁に血液サンプルで測定しました。大人女性 C57/Bl6 マウスが卵巣摘出、頻繁に血のコレクションのこのプロトコルの詳細として処理します。LH の律動性分泌の治療前のベース?...

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Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

ここで気ままなマウスで頻繁にサンプル コレクションの尻尾先端血液サンプリング プロトコルを提案します。このメソッドは、拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価パターンに対して有用です、他の循環要因の分析のために合わせることができます。

拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価のためマウス尾先端採血を頻繁に

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

The overall goal of frequent tail-tip blood sampling is to obtain whole blood samples for the measurement of pulsatile luteinizing hormone secretion referred to as LH in awake non-anesthestized and normal behaving mice. This method can help answer key questions in the field of reproducive neuroendochrinology by providing a reliable protocol to assess luteinizing hormone pulsatile secretion in mice. The main advantage to this technique is that frequent handling and habituation will ensure robust and reliable luteinizing hormone pulse measurements following acute or chronic experimental treatments.For five weeks prior to the blood collection, handle the mice on a daily basis from Monday to Friday. In the final two weeks, handle the mice on Saturday and Sunday as well. Perform the mouse handling regime in a bio-safety cabinet.Remove the first mouse from its cage and place it on a suitable surface within the cabinet. Gently restrain the mouse on this surface by holding the base of its tail. Then with the other hand firmly stroke the ventral surface of the tail from the base to the tip.Do this a total of six times and then return the mouse to its cage. This constitutes one handling set. Now wait six minutes and perform another handling set.Continuing this pattern with inter set intervals, perform four handling sets per handling session. In total this provides twenty-four tail strokes per session. If experimental treatments during the sampling period will include any additional handling methods like scruffing or an intraperitoneal injection then also acclimatize the mice to such handling activity during the handling sessions.Two weeks before the planned blood collection day, house the mice in pairs to minimize their disruption during the sampling period. For the blood collections prepare 0.6 milliliter micro centrifuge tubes for blood storage. Label the tubes and for three microliter blood collections aliquot fifty-seven microliters of ACES buffer into each tube.Once prepared store the tubes at four degrees Celsius. At the bio-safety cabinet have the following items ready:pipette tips, a waste bin, a timer, an experiemental log, an ice bucket containing the blood collection tubes, sharp, steril scissors, a permanent marker, and small gauze. Forty-five minutes before starting the blood collection, remove the first mouse from its cage and place it on a suitable surface.Then mark the tail to quickly identify this mouse from its cage partner. Now use scissors to remove one to two millimeters of the tip of the tail. After clipping that tail carefully stroke the tail until a droplet of blood forms at the tip.Then collect three microliters of blood and discard both the blood and the tip into the waste bin. Next ensure that the blood flow has stopped. If needed apply gentle pressure with sterile gauze.Then return the mouse to its cage for six minutes. Now on six minute intervals over forty-five minutes, stroke the tail firmly to take additional blood samples from the mouse. If a blood droplet does not form, dab the tail with a gauze pad soaked in saline to help clear the blood clot.During the pre-sampling period, discard all the blood aliquots. After forty-five minutes start the sampling period. When taking samples transfer three microliters of blood into a collection tube mix the tube by inversion and put it back on ice.Now proceed with the sampling for as long as necessary. Once over either euthanize the mice or ensure that their tail blood flow has completely stopped and then provide the mice with a clean cage. Next transfer blood samples to a storage box and store the samples at minus twenty degrees Celsius until they can be analyzed.Luteinizing Hormone or LH was measured in frequent blood samples to determine the response to an acute psychosocial stress challenge. Adult female C57 black six mice were ovariectomized and blood samples were collected for ninety minutes to establish a pretreatment baseline of LH pulsatile secretion. For the stress treatment during the ninety minute sampling experimental animals were put into rodent restraint devices and moved into a new cage while controls remained in their home cages and were not restrained.The analysis showed that control animals had clear unambiguous LH pulses throughout the entire sampling period. In contrast the psychosocial stress of the restraint rapidly and unambiguously suppressed pulsatile LH secretion in the experimental group. When preparing to use this technique, it's important to remember to minimize environmental disturbances such as noise or interruptions by other investigators which could stress the mice and interrupt pulsatile LH secretion.Since its development by Dr.Stein and others in the Chen laboratory this technique has begun to pave the way for researchers in the field of neuroendocrinology to explore LH pulse regulation in a species where complex molecular and genetic tools are practical and available.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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神経科学

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Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

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高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

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An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

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生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

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虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊のIn Vivo評価

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

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生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

刺激間隔の齧歯動物の一時的な処理の評価のための力

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くも膜下出血のモデルとしての水槽マグナへの血液の二重直接注射

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