Name: probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (til P.-F.L.). Vi erkender Frankrig-BioImaging infrastruktur støttet af det franske nationale forskning agentur (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringer for fremtiden»). Vi takker Brice Detailleur og Claude Moretti fra PICSL-FBI infrastruktur for teknisk bistand.

1. oprettelse af lys ark mikroskop
<ol><li>Henvise til beskrivelse af opsætningen i tidligere publikation25. Bemærk: Konfigurationen er sammensat af en opretstående mikroskop fase og en lys ark modul producerer en lys ark i det vandrette plan. Et 10 X excitation mål linse dirigerer arket lys ind i et glas kuvette (figur 4). Påvisning mål linse har en høj NA (1.1), som er nødvendig for effektiv pincet (se nedenfor).</li>
</ol>2. opret...

<ol>
	<li>Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation,+transmission,+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis.">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li><li>Heisenberg, C. -. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues.">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), 186-196 (2016).</li><li>Camp&#224;s, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues.">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis.">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li><li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling.">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling.">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li><li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bella&#239;che, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Etournay, R., Popovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex.">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., R&#246;per, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation.">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883 (2017).</li><li>Camp&#224;s, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li><li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues.">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li><li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays.">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).</li><li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis.">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li><li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellFIT:+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries.">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+optical+forces.">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Bambardekar, K., Cl&#233;ment, R., Blanc, O., Chard&#232;s, C., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo.">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li><li>Cl&#233;ment, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis.">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li><li>Chard&#232;s, C., M&#233;n&#233;lec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development.">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).</li><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li><li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins.">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li></ol>

Optisk pincet gør det muligt for at udføre absolutte mekaniske målinger direkte i det udviklende embryonale epitel i en ikke-invasiv måde. I henseende præsenterer det fordele frem for andre metoder såsom laser ablation, som er invasive og giver relativ målinger, magnetiske kræfter, som kræver injektioner, eller tvinge inferens, som bygger på stærke antagelser og også give relative målinger.
Protokollen indeholder et par kritiske trin. Først, da formålet objektivet kan vise kroma...

Fosterudviklingen er en yderst reproducerbar proces hvor celler og væv deformere for at forme det fremtidige dyr. Disse deformationer har vist sig at kræve den aktive generation af styrker på celle niveau1,2. For at forstå morfogenetiske processer, hvorunder celler og væv ændre deres form, er det derfor nøglen til at vurdere de mekaniske egenskaber af celler involveret og måle kræfter i vævet under processen3,4 . Epitel lag, især i Drosophila, er blevet meget studeret deres kvasi-2D-geometri og deres let manipulation.
En række teknikker har således udviklet af os og andre til at vurdere epitelial mekanik i vivo under udvikling. Vi vil give et hurtigt overblik over de tre vigtigste teknikker, der anvendes i epitel væv. Laser ablation, en meget udbredt metode, giver mulighed for at afsløre den lokale mekanisk stress på celle vejkryds5,6,7,8 eller større skala9,10,11 ved at udføre lokale nedskæringer, der forstyrrer den mekaniske integritet af målet. Dynamikken i åbningen efter snittet giver oplysninger både om stress forudgående ablation og på reologi væv12,13. En ulempe ved laser ablation er, at det er invasive, da det kræver de lokale forstyrrelser af celle cortex. Derfor kan man kun udføre et begrænset antal ablations hvis man ønsker at bevare vævet intakt. En anden ulempe er, at ablations kun give relative skøn af spænding i celle kontakter, idet den indledende hastighed er afhængig af tyktflydende friktion, som ikke er kendt. Magnetiske manipulation er også blevet udviklet og anvendt i Drosophila, der involverer enten brugen af ferrofluids14 eller ultramagnetic Liposomer15. De kan give absolutte målinger16,17, men er også invasive i den forstand, at de kræver indsprøjtning af sonder på den ønskede placering. Dette kan være meget vanskelig afhængigt af systemet, som ikke altid er indstillet til præcise injektioner. En tredje teknik, fuldstændig ikke-invasiv, er kraft inferens18,19,20. Kraft inferens bygger på en antagelse om mekanisk ligevægt på triple point (tricellular vejkryds eller vertices), og gør det muligt for at udlede spændinger på alle celle-celle kontakter (og eventuelt pres i alle celler) ved at løse en invers problem. For spændinger giver hver vertex to ligninger (X og Y). Dette giver et stort system af lineære ligninger, som kan vendes på visse betingelser at vurdere spænding på alle celle kontakter. Mens denne metode er meget attraktiv, da det kun kræver en segmenteret billede og ingen ekstra eksperiment eller setup, dets nøjagtighed er endnu til at bestemme, og igen det kun indeholder relative værdier, medmindre en absolut kalibrering måling udføres.
For at overvinde nogle af disse begrænsninger, vi indfører i denne artikel en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop til at anvende kontrollerede styrker på celle skala i Drosophila melanogasterembryonale epitel. Optisk pincet har været brugt til mange biologiske applikationer herunder målinger på enkelt proteiner og manipulation af organeller og celler21. Her rapporterer vi anvendte kræfter i rækken af et par dusin pN, som er små endnu tilstrækkelig til at fremkalde lokale deformationer af celle kontakter og udføre mekaniske målinger i vivo. Vi bruger typisk vinkelrette afbøjning af celle kontakter, overvåget gennem en analyse af kymographs, skal vedrøre deformation kraft. Vigtigere, kræver vores setup ikke indsprøjtning af perler på den ønskede placering i væv, som Optisk pincet er i stand til direkte lægge kræfter på celle-celle kontakter. Kobling af den optiske pincet til en lys ark mikroskop gør det muligt at udføre hurtige imaging (flere billeder pr. sekund), som er meget mærkbar for en mekanisk analyse på kort tidsskalaer, og med reducerede fototoksicitet, siden belysningen af den prøven er begrænset til flyet i imaging22.
Samlede, Optisk pincet er en non-invasiv måde at anvende kontrollerede styrker på celle kontakter in vivo i Drosophila embryo og udtrække mekaniske oplysninger såsom stivhed og spænding i celle kontakter23, rheologiske egenskaber 24, og gradueringsfyld eller anisotropy spænding23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td>
			<td style="width:179px;">IPG Laser</td>
			<td style="width:179px;">YLM-10-LP-SC</td>
			<td style="width:591px;">including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">&#216;1/2&#34; Optical Beam Shutter</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">SH05</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Small Beam Diameter Galvanometer Systems</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GVS001</td>
			<td style="width:591px;">1 for X displacement, 1 for Y displacement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">1D or 2D Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GPS011</td>
			<td style="width:591px;">galvanometers power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">2 lenses f = 30mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1757-B</td>
			<td style="width:591px;">relay telescope between 2 galva</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 200mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1945-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 500mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1869-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">KCB1E</td>
			<td style="width:591px;">Periscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LG1</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">45&#176; AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror</td>
			<td style="width:179px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:179px;">#64-470</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Multiphoton-Emitter HC 750/S</td>
			<td style="width:179px;">AHF</td>
			<td style="width:179px;">HC 750/SP</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">CompactDAQ Chassis</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">cDAQ-9178</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Output Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9263</td>
			<td style="width:591px;">Analog output module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Input Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9215</td>
			<td style="width:591px;">Analog input module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &#181;m, red fluorescent (580/605), 2% solids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F8812</td>
			<td>calibration beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C++ (Qt) home made optical tweezers software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s. Alternative solution: labview</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo

Morfogenese kræver koordinering mellem genetiske mønstre og mekaniske kræfter håndfast forme celler og væv. Derfor er en udfordring at forstå morfogenetiske processer direkte måle cellulære styrker og mekaniske egenskaber i vivo under embryogenese. Vi præsenterer her, en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop, som tillader direkte anvende styrker på celle-celle kontakter af den tidlige Drosophila embryo, mens imaging med en hastighed på flere billeder per sekund. Denne teknik har den fordel, at det ikke kræver indsprøjtning af perler i embryo, normalt bruges som mellemliggende sonder som optisk styrker er udøvet. Vi detaljeret trin for trin gennemførelsen af opsætningen, og foreslå værktøjer til at udtrække mekaniske oplysninger fra forsøgene. Ved at overvåge fordrivelse af celle-celle kontakter i realtid, kan man udføre spænding målinger og undersøge celle kontaktpersoners reologi.

Figur 5 viser eksperimentelle data opnået ved at pålægge en sinusformet bevægelse at fælden. Fælden producerer en fordrejning af grænsefladen, som eksemplificeret af 3 snapshots viser 3 successive interface positioner (figur 5A)23. Optagede film bruges til at generere en kymograph (figur 5B) og analyseres yderligere for at bestemme placeringen af grænsefladen med subpi...

Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Vi præsenterer en opsætning af optiske tweezers koblet til en lys ark mikroskop, og dens gennemførelse at sonde celle mekanik uden perler i Drosophila embryo.

Sondering celle mekanik med perle-fri Optisk pincet i Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i væv mekanik såsom hvordan egenskaber cellecellekontakter ændre sig i rum og tid under væv morfogenese. Den største fordel ved denne teknik er, at det er svagt invasiv, og det er kompatibelt med levende billeddannelse såsom lys ark mikroskopi. Denne teknik kræver ikke injektion af perler i vævet.Normalt bruges som demiere sonder, som at få froses, jeg er spændt. Demonstration af processen vil være Chardes, en ingeniør, og Raphael Clement, forsker fra mit niveau af terræn. Til at begynde, oprette en opretstående mikroskop for lys ark mikroskopi i den vandrette sletten, derefter forberede laser og optik til at fungere som den optiske pincet.Dernæst rør en mikro-liter af 500 nanometer fluorescerende perler ind på et glas cuvette, og tilsæt 10 milliliter destilleret vand. Læg kuvette i cuvette indehaveren under målet, og justere fokus for målet, således at målet rører vandets overflade. Nu skal du åbne Integrated Development Environment QT Creator, som bruges til at styre anskaffelsessoftwaren.Åbn anskaffelsessoftwaren ved at åbne microRheo. profil, og slå live-anskaffelsestilstanden til ved at vælge live. Før du tænder for laseren, sættes på sikkerhedsbriller, derefter justere laser magt til en watt, og tænde laseren.Live-feedet skal nu vise en perle fanget i laserens fokus. Hvis det er nødvendigt, justere placeringen af det andet teleskop linse, for at observere perle i fokus. Man kan også nødt til at justere vinklen på periskop manøvrer til at centrere perad i billedet.Forbered dataopkøbsrådet og kantstensforbindelserne, som beskrevet i figur tre i den medfølgende tekstprotokol. På den optiske lukkergrænseflade skal du justere parameteren for tids åbent sekund til 000.000, parameteren for lukket sek til 000.000, tilstandsparameteren til enkelt og udløserparameteren til EXT. Når indstillingen er indstillet, skal du vælge knappen Aktivér.I QT Creator skal du åbne ot. profil for at åbne projektet. Ændre navnet på input og output i aogenerator.cpp-filen, så den passer til de MI-kort, der blev brugt i opsætningen. Endelig kompilere og køre den optiske pincet software. I anskaffelsessoftwaren skal du vælge den ønskede eksponeringstid, spillet, tiden mellem to billeder, antallet af billeder, der skal erhverves, og laserens kraft.Derefter, i den optiske pincet software, indstille den optiske pincet parameter, vist her, at spore en cirkel. Derefter skal du markere afkrydsningsfeltet AI-parametre, feltet frem og trykke på knappen Posttryk, og start derefter billedopetagelsen. Tænd for den optiske pincet, vælg genereringsknappen, og lad den fangede perle fuldføre mindst to fulde cirkler, og stop derefter den optiske pincet ved at fjerne markeringen af genereringsknappen.Endelig stoppe billedet erhvervelse. Bemærk, at der oprettes en tiff-film og en tekstfil med galvanometerspændinger i standardmappen. Åbn Matlab, gå til kalibreringsmappen, og kør positionen to spændingsscript Scriptet beregner interpolationsfunktionen og oversætter galvanometerspændinger til optisk diffuseringsposition.Følg derefter i den medfølgende tekstprotokol for at konfigurere kalibreringsfilmen. Kontroller, om interpolationskortet for X- og Y-laserpositioner beregnes og vises korrekt af scriptet. Kontroller, om der er hvide områder på kortet, som repræsenterer manglende værdier.Hvis der er væsentlige hvide områder, skal du gentage handlingen med en ny kalibreringsfilm. Den kalibreringsfilm, der vises her, repræsenterer en film med tilstrækkelige data. Ved hjælp af en gedde, eller en fugtig børste, skal du vælge omkring 10 embryoner på det ønskede stadium og tilpasse dem.Brug derefter en diamantmarkeringspen til at skære et stykke af glasrutsjebanen til 10 af 20 med et milometer. Tilføj lim på den ene side af snittet stykke, og lad det tørre i 20 sekunder, drej derefter snittet stykke over, og læg det på linjen af embryoner, stikning det på kanten af diaset. Dernæst installeres præparatet i prøveholderen, og holderen anbringes i cuvetteten, hvor cuvette'en anbringes på piso-elektrisk tilstand, og den fyldes med vand.Til at begynde, finde placeringen af interesse, og flytte målet krydset midtpunkt til laser fælde position, ved hjælp af pisar fase. Indstil diffuseringens parametre for at opnå svingninger vinkelret på kontaktlinjen. Også indstille faser som nul, amplituderne på X og Y retninger for at have en bevægelse vinkelret på kontaktlinjen, og sæt amplituden til 0,1 volt.Start nu anskaffelsen ved hjælp af en hurtig billedhastighed, f.eks. Når billeddannelsen er begyndt, skal du tænde for den optiske pincet ved at trykke på trykknappen. Når billeddannelsen er færdig, skal du slukke for pincetten og stoppe billedopkøb.I den angivne mappe vil der være en film og en tekstfil, der indeholder galvanometerspændingerne under erhvervelsen. Åbn filmen for at observere de indsamlede rammer. Efter analyse af videoen, måle stivhed og spænding i vævsprøven, ved at åbne videoen i Matlab.Brug her plotfunktionen til at afbilde grænsefladepositionen som funktion af diffuseringspositionen. Brug derefter Matlab nem pasform gratis værktøjskasse til at udføre en lineær pasform af data. Det modsatte af pasformens hældning giver det gennemsnitlige forhold mellem fældens position over grænsefladepositionen.Ud fra disse oplysninger skal du bruge ligningerne i den medfølgende tekstprotokol til at bestemme stivheds- og spændingsværdierne. Laserfælden producerer en sinusformet afbøjning af prøven, der er vinkelret på grænsefladen. vist her som tre på hinanden følgende grænsefladepositioner.Dette kan også optages som film for at generere en klimatogram og analyseres yderligere for at bestemme placeringen af grænsefladen med sub-pixel opløsning. Her var perioden fem sekunder. I ordningen med små deformationer er fælden og grænsefladepositionerne proportionale.Grænsefladens afbøjning i forhold til fældens amplitude giver adgang til grænsefladespændingen eller stivheden. Vist her er det grundlæggende i en pull og release eksperiment. Når den optiske fælde er tændt, cirka et mikrometer væk fra midtpunktet af grænsefladen mellem to celler, afbøjer grænsefladen mod fældens position.Fælden slukkes derefter efter den ønskede tid. Den resulterende graf kan sammenlignes med hypotese reelle logiske modeller, såsom en Maxwell lignende model. DOn't glemme, at arbejde med infrarød laser kan være yderst farligt, og forholdsregler såsom iført beskyttelsesbriller, bør altid have været taget, når du udfører denne procedure.Her, med den hyppigste bruger fra tinkle pincet til dem af embryonet, kan metoden også bruges til andre moder systemer såsom

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Mikroperle Implantation i Zebrafisk Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation af erythromyeloidprogenitorer og deres afkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM og Microrheology i cellen zebrafisk Embryo æggeblomme

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle sammenlægning Assays til at evaluere bindingen af Drosophila Notch med Trans-ligander og dens hæmning af Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Følgende endokardial væv bevægelser via celle Photoconversion i zebrafisk Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasivt Embryo Transfer og embryo Vitrificering på det optimale embryo stadie i kanin model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroinjektion-baseret System for i Vivo Implantation af embryonale Cardiomyocytes i aviær Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...