Name: probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (op P.-F.L.). Wij erkennen de Frankrijk-BioImaging infrastructuur ondersteund door het Franse nationale Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringen voor de toekomst»). Wij danken Brice Detailleur en Claude Moretti van de PICSL-FBI-infrastructuur voor technische bijstand.

1. instellen van het lichte blad Microscoop
<ol><li>Verwijzen naar de omschrijving van de instellingen in eerdere publicatie25. Opmerking: De installatie bestaat uit een rechtop Microscoop stadium en een lichte blad module produceren een lichte vel in het horizontale vlak. Een 10 X excitatie objectief regisseert het lichte blad in een cuvet van glas (Figuur 4). De detectie-objectief heeft een hoge nb (1.1), die noodzakelijk is voor de efficiënte pincet (zie hier...

<ol>
	<li>Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation,+transmission,+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis.">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li><li>Heisenberg, C. -. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues.">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), 186-196 (2016).</li><li>Camp&#224;s, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues.">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis.">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li><li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling.">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling.">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li><li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bella&#239;che, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Etournay, R., Popovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex.">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., R&#246;per, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation.">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883 (2017).</li><li>Camp&#224;s, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li><li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues.">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li><li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays.">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).</li><li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis.">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li><li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellFIT:+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries.">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+optical+forces.">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Bambardekar, K., Cl&#233;ment, R., Blanc, O., Chard&#232;s, C., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo.">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li><li>Cl&#233;ment, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis.">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li><li>Chard&#232;s, C., M&#233;n&#233;lec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development.">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).</li><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li><li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins.">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li></ol>

Optisch pincet wil absolute mechanische metingen rechtstreeks in de ontwikkelingslanden embryonale epitheel uitvoeren op een niet-invasieve wijze. In die zin presenteert het voordelen ten opzichte van andere methoden zoals laser ablatie, die zijn invasief en verstrekken van relatieve metingen, magnetische krachten, waarvoor injecties, of dwingen gevolgtrekking, die gebaseerd op sterke veronderstellingen is en bieden ook relatieve metingen.
Het protocol bevat een paar kritische stappen. Eerst, ...

Embryonale ontwikkeling is een zeer reproduceerbaar proces waarin de cellen en weefsels vervormen om het toekomstige dier vorm te geven. Dergelijke vervormingen hebben aangetoond dat vereist de actieve generatie van krachten op de cel niveau1,2. Om te begrijpen morfogenetische processen waarin cellen en weefsels hun vorm wijzigen, is daarom sleutel tot het beoordelen van de mechanische eigenschappen van de cellen die betrokken zijn, en voor het meten van de krachten binnen het weefsel tijdens het proces3,4 . Epitheelweefsel lagen, met name in Drosophila, hebben grote schaal onderzocht als gevolg van hun quasi-2D-geometrie en hun gemakkelijke manipulatie.
Een aantal technieken hebben dus ontwikkeld door ons en anderen om te beoordelen epitheliale mechanica in vivo tijdens de ontwikkeling. Zullen wij een snel overzicht van de drie belangrijkste technieken gebruikt in epitheliale weefsels. Laser ablatie, een veel gebruikte methode, maakt het mogelijk om het onthullen van de lokale mechanische stress op cel kruispunten5,6,7,8 of op grotere schaal9,10,11 door het uitvoeren van lokale bezuinigingen die de mechanische integriteit van het doel verstoren. De dynamiek van de opening na de cut vindt u informatie over de voorafgaande ablatie van stress, zowel de reologie van het weefsel12,13. Een nadeel van laser ablatie is dat het invasieve, daar het vereist dat de lokale verstoring van de cortex van de cel. Vandaar, kan een alleen een beperkt aantal ablations uitvoeren, als men wil weefsel integriteit behouden blijft. Een ander nadeel is dat ablations alleen schattingen op te relatieve van spanning op de contacten van de cel, leveren omdat de opening snelheid is afhankelijk van viskeuze wrijving, dat over het algemeen niet bekend is. Magnetische manipulatie heeft ook ontwikkeld en gebruikt in Drosophila, waarbij het gebruik van ferrofluids14 of15van de ultramagnetic liposomen. Ze bieden absolute metingen16,17, maar zijn ook invasief in de zin dat zij de injectie van sondes op de gewenste locatie vereisen. Dit kan erg lastig zijn afhankelijk van het systeem, dat niet altijd vatbaar voor precieze injecties is. Een derde techniek, volledig niet-invasieve, is kracht gevolgtrekking18,19,20. Kracht gevolgtrekking is gebaseerd op de veronderstelling van mechanisch evenwicht op driedubbele punten (tricellular verbindingen, of hoekpunten) en kunt afleiden spanningen helemaal cel contacten (en eventueel druk in alle cellen) door een omgekeerde probleem op te lossen. Voor spanningen biedt elke vertex twee vergelijkingen (X en Y). Dit levert een grote stelsel van lineaire vergelijkingen, die onder bepaalde omstandigheden te beoordelen van spanning op alle contacten van de cel kan worden omgekeerd. Terwijl deze methode zeer aantrekkelijk, is omdat het vereist alleen een gesegmenteerde afbeelding en geen extra experiment of setup, de juistheid ervan is nog te bepalen, en opnieuw het levert alleen relatieve waarden, tenzij een absolute kalibratie-meting is uitgevoerd.
Om sommige van deze beperkingen te overwinnen, voeren we in dit artikel een opstelling van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop toe te passen gecontroleerde krachten op de schaal van de cel in de embryonale epitheel van Drosophila melanogaster. Optisch pincet zijn gebruikt voor tal van biologische toepassingen met inbegrip van de metingen op één eiwitten en manipulatie van organellen en cellen21. Hier, rapporteren we toegepaste krachten in de range van een paar dozijn pN, die klein is nog voldoende induceren van lokale deformaties van mobiele contacten en mechanische metingen in vivouitvoeren. Wij gebruiken meestal loodrecht doorbuiging van cel contacten, gevolgd door de analyse van kymographs, kracht op vervorming. Nog belangrijker is, vereist onze opstelling geen injectie van kralen op de gewenste locatie in het weefsel, aangezien optisch pincet kunnen direct oefenen krachten op cel contacten. De koppeling van de optisch pincet om een lichte blad Microscoop kan men voor het uitvoeren van snelle beeldvorming (aantal frames per seconde), die zeer merkbaar voor een mechanische analyse op korte tijd schalen, en met beperkte fototoxiciteit, sinds de verlichting van is de monster is beperkt tot het vlak van imaging22.
Algemene, optisch pincet zijn een niet-invasieve manier toe te passen gecontroleerde krachten op cel contacten in vivo in de Drosophila embryo, en mechanische gegevens zoals stijfheid en spanning op cel contacten23, Rheologische eigenschappen extraheren 24, en verloop- of anisotropie van spanning23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td>
			<td style="width:179px;">IPG Laser</td>
			<td style="width:179px;">YLM-10-LP-SC</td>
			<td style="width:591px;">including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">&#216;1/2&#34; Optical Beam Shutter</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">SH05</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Small Beam Diameter Galvanometer Systems</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GVS001</td>
			<td style="width:591px;">1 for X displacement, 1 for Y displacement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">1D or 2D Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GPS011</td>
			<td style="width:591px;">galvanometers power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">2 lenses f = 30mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1757-B</td>
			<td style="width:591px;">relay telescope between 2 galva</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 200mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1945-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 500mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1869-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">KCB1E</td>
			<td style="width:591px;">Periscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LG1</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">45&#176; AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror</td>
			<td style="width:179px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:179px;">#64-470</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Multiphoton-Emitter HC 750/S</td>
			<td style="width:179px;">AHF</td>
			<td style="width:179px;">HC 750/SP</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">CompactDAQ Chassis</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">cDAQ-9178</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Output Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9263</td>
			<td style="width:591px;">Analog output module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Input Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9215</td>
			<td style="width:591px;">Analog input module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &#181;m, red fluorescent (580/605), 2% solids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F8812</td>
			<td>calibration beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C++ (Qt) home made optical tweezers software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s. Alternative solution: labview</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo

Morfogenese vereist coördinatie tussen genetische patronen en mechanische krachten krachtig vorm van de cellen en weefsels. Vandaar, is een uitdaging voor een beter begrip morfogenetische direct cellulaire krachten en de te meten mechanische eigenschappen in vivo tijdens de embryogenese. Hier presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, waarmee direct toepassen krachten op cel contacten van het vroege embryo van de Drosophila , terwijl beeldvorming bij een snelheid van verschillende frames per seconde. Deze techniek heeft het voordeel dat het niet nodig de injectie van parels in het embryo, meestal gebruikt als tussenliggende sondes waarop optische krachten worden uitgeoefend. We stap voor stap de uitvoering van de installatie in detail te beschrijven, en voorstellen voor methoden om mechanische informatie extract van de experimenten. Door het toezicht op de verplaatsingen van cel-cel contactpersonen in real time, kan een spanning metingen uitvoeren en cel contacten reologie onderzoeken.

Figuur 5 toont experimentele gegevens die zijn verkregen door het opleggen van een sinusoïdale beweging aan de val. De val produceert een afbuiging van de interface is, zoals door de 3 momentopnamen tonen 3 opeenvolgende interface-posities (figuur 5A)23. Opgenomen films worden gebruikt voor het genereren van een Kymograaf (figuur 5B) en zijn verder geanalyseerd om te bepalen ...

Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, en de uitvoering daarvan om te sonderen cel mechanica zonder kralen in de Drosophila embryo.

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in weefselmechanica, zoals hoe eigenschappen van celcelcontacten veranderen in ruimte en tijd tijdens weefselmorfogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zwak invasief is en compatibel is met live beeldvorming zoals lichtplaatmicroscopie. Deze techniek vereist geen injectie van kralen in het weefsel.Meestal gebruikt als demiere sondes waarop froses te krijgen, ik ben opgewonden. Het aantonen van het proces zal Chardes, een ingenieur, en Raphael Clement, onderzoeker van mijn niveau van het terrein. Om te beginnen, het opzetten van een rechte microscoop voor lichtplaat microscopie in de horizontale vlakte, dan bereiden de laser en optica om op te treden als de optische pincet.Vervolgens pijp uit een micro-liter van 500 nanometer tl-kralen in een glazen cuvette, en voeg 10 milliliter gedestilleerd water. Plaats de cuvette in de cuvettehouder onder het doel en pas de focus van het doel aan, zodat het doel het wateroppervlak raakt. Open nu de Integrated Development Environment QT Creator die wordt gebruikt om de acquisitiesoftware te beheren.Open de acquisitiesoftware door de microRheo te openen. profiel en schakel de live acquisitiemodus in door live te selecteren. Voordat u de laser inschakelt, zet u een veiligheidsbril aan, past u vervolgens de laserkracht aan op één watt en schakelt u de laser in.De live feed moet nu tonen een kraal gevangen op de focus van de laser. Pas indien nodig de positie van de tweede telescooplens aan om de kraal scherp te observeren. Men kan ook nodig zijn om de hoek van de periscoop manoeuvres aan te passen aan het centrum van de kraal in het beeld.Bereid de data acquisition board en de curb verbindingen voor, zoals beschreven in figuur drie van het bijbehorende tekstprotocol. Pas op de optische sluiterinterface de parameter time open sec aan op 000.000, de parameter time closed sec op 000.000, de modusparameter op single en de triggerparameter op EXT. Selecteer de knop Inschakelen zodra u is ingesteld.Open in QT Creator de ot. profiel om het project te openen. Wijzig de naam van de invoer en uitvoer in aogenerator.cpp-bestand dat overeenkomt met de MI-kaarten die in uw set-up zijn gebruikt. Compileer en voer ten slotte de optische pincetsoftware samen en voer deze uit. Selecteer in de acquisitiesoftware de gewenste belichtingstijd, het spel, de tijd tussen twee afbeeldingen, het aantal te verkrijgen afbeeldingen en de kracht van de laser.Stel vervolgens in de optische pincetsoftware de optische pincetparameter in, hier weergegeven, om een cirkel te traceren. Schakel vervolgens het vakje AI-parameters, het vakje gewicht naar voren in en druk op de drukknop op de recorddrukknop en start de afbeeldingsverwerving. Schakel de optische pincet in, selecteer de genererende knop en laat de gevangen kraal ten minste twee volledige cirkels voltooien en stop vervolgens de optische pincet door de genererende knop te deslecteren.Tot slot, stop de beeldverwerving. Houd er rekening mee dat een tiff-film en een tekstbestand met galvanometerspanningen worden gemaakt in de standaardmap. Open Matlab, ga naar de kalibratiemap en voer de positie tweespannenscript uit Het script berekent de interpolatiefunctie en vertaal galvanometerspanningen naar optische overvulpositie.Volg vervolgens mee in het bijbehorende tekstprotocol om de kalibratiefilm in te stellen. Controleer of de interpolatiekaart voor X- en Y-laserposities door het script correct wordt berekend en weergegeven. Controleer op witte gebieden op de kaart, die ontbrekende waarden vertegenwoordigen.Als er belangrijke witte gebieden zijn, herhaalt u de bewerking met een nieuwe kalibratiefilm. De hier getoonde kalibratiefilm vertegenwoordigt een film met voldoende gegevens. Selecteer met behulp van een snoek, of een vochtige borstel, ongeveer 10 embryo's in het gewenste stadium en lijn ze uit.Gebruik vervolgens een diamant markering pen om een stuk van de glazen glijbaan te snijden, tot 10 bij 20 bij een milometer. Voeg lijm aan de ene kant van het gesneden stuk, en laat het drogen voor 20 seconden, draai dan de gesneden stuk over, en plaats het op de lijn van embryo's, steken aan de rand van de dia. Installeer vervolgens het preparaat in de monsterhouder en plaats de houder in de cuvette, plaats de cuvette op de piso-elektrische toestand en vul deze met water.Om te beginnen, vind de locatie van belang, en verplaats het doel knooppunt middelpunt naar de positie van de laserval, met behulp van de pisar fase. Stel de parameters van de val in om trillingen te bereiken die loodrecht op de contactlijn staan. Stel ook de fasen als nul, de amplitudes op X en Y richtingen om een beweging loodrecht op de contactlijn hebben, en stel de amplitude op 0,1 volt.Nu, start de overname, met behulp van een snelle framerate, zoals 10 frames per seconde. Zodra de beeldvorming is begonnen, schakelt u de optische pincet in door op de go-drukknop te drukken. Wanneer de beeldvorming is voltooid, schakelt u de pincet uit en stopt u de beeldverwerving.In de opgegeven map vindt u een film en een tekstbestand met de galvanometerspanningen tijdens de overname. Open de film om de verzamelde frames te observeren. Na analyse van de video, meet de stijfheid en spanning in het weefsel monster, door het openen van de video in Matlab.Gebruik hier de plotfunctie om de interfacepositie in kaart te brengen als functie van de overvulpositie. Gebruik vervolgens Matlab easy fit free toolbox om een lineaire pasvorm van de gegevens uit te voeren. De inverse van de helling van de pasvorm, biedt de gemiddelde verhouding van de valpositie over de interfacepositie.Gebruik op basis van deze informatie de vergelijkingen in het bijbehorende tekstprotocol om de stijfheid en spanningswaarden te bepalen. De laserval produceert een sinusoïdale afbuiging van het monster, die loodrecht op de interface staat. hier weergegeven als drie opeenvolgende interfaceposities.Dit kan ook worden opgenomen als films om een climograaf te genereren en worden verder geanalyseerd om de positie van de interface met subpixelresolutie te bepalen. Hier was de periode vijf seconden. In het regime van kleine vervormingen zijn de val- en interfaceposities proportioneel.De amplitude van de interface afbuiging ten opzichte van die van de val geeft toegang tot de interface spanning of stijfheid. Hier worden de basisprincipes van een pull and release-experiment weergegeven. Wanneer de optische val is ingeschakeld, ongeveer een micrometer verwijderd van het middelpunt van de interface tussen twee cellen, buigt de interface af naar de positie van de val.De val wordt vervolgens uitgeschakeld na de gewenste hoeveelheid tijd. De resulterende grafiek kan worden vergeleken met veronderstelde echte logische modellen, zoals een Maxwell-achtig model. DOn't vergeten dat het werken met infrarood laser kan zeer gevaarlijk zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van een beschermende bril, moet altijd zijn genomen bij het uitvoeren van deze procedure.Hier, met de meest frequente gebruiker van tinkle pincet voor die van het embryo, kan de methode ook worden gebruikt voor andere moedersystemen, zoals de

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microkraal Implantatie in de zebravis embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM en Microrheology in de cel van de dooier Zebrafish de Embryo

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live beeldvorming en analyse van spiercontracties in Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...