Name: probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי עקרות Equipe גרנט עקרות DEQ20130326509, סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש גרנט ANR-בלאן, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (ל פ-F.L.). אנו להכיר תשתית צרפת-BioImaging הנתמכים על ידי הצרפתי הלאומי לחקר הסוכנות (ANR-10-INBS-04-01, «השקעות לעתיד»). אנו מודים Brice Detailleur ו קלוד מורטי מן התשתית PICSL-בי-איי לקבלת סיוע טכני.

1. הגדרה-up מיקרוסקופ אור גיליון
<ol><li>להפנות התיאור של הגדרת הפרסום הקודם25. הערה: ההגדרה מורכב שלב מיקרוסקופ זקוף ומודול גיליון אור בהפקת גיליון אור במישור האופקי. 10 X עדשה המטרה עירור מנחה את הגיליון אור לתוך cuvette זכוכית (איור 4). זיהוי המטרה העדשה יש נה גבוה (1.1),...

<ol>
	<li>Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation,+transmission,+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis.">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li><li>Heisenberg, C. -. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues.">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), 186-196 (2016).</li><li>Camp&#224;s, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues.">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis.">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li><li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling.">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling.">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li><li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bella&#239;che, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Etournay, R., Popovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex.">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., R&#246;per, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation.">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883 (2017).</li><li>Camp&#224;s, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li><li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues.">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li><li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays.">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).</li><li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis.">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li><li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellFIT:+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries.">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+optical+forces.">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Bambardekar, K., Cl&#233;ment, R., Blanc, O., Chard&#232;s, C., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo.">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li><li>Cl&#233;ment, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis.">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li><li>Chard&#232;s, C., M&#233;n&#233;lec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development.">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).</li><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li><li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins.">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li></ol>

מלקחיים אופטיים מאפשרים לבצע מדידות מכניות מוחלטת ישירות בתוך האפיתל מתחלקים המתפתח בצורה לא פולשנית. במובן הזה, הוא מציג יתרונות על פני שיטות אחרות כגון אבלציה לייזר, אשר הינם פולשניים, לספק יחסי מדידות, כוחות מגנטיים, אשר דורשים זריקות, או להכריח היסק, אשר נשענת על הנחות חזק גם לספק יחסי ?...

התפתחות הוא תהליך מאוד לשחזור במהלכו תאים ורקמות לעוות לעצב את החיה לעתיד. דפורמציות כזה הוכחו דורשים הדור פעיל של כוחות ב ברמה1,תא2. כדי להבין תהליכים morphogenetic במהלכו תאים ורקמות לשנות את צורתם, לכן זה מפתח כדי להעריך את התכונות המכאניות של התאים המעורבים, וכדי למדוד את הכוחות בתוך רקמת במהלך תהליך3,4 . שכבות אפיתל, בפרט דרוזופילה, נחקרו באופן נרחב עקב הגיאומטריה קוואזי-2D שלהם וכדי שלהם טיפול קל.
מספר טכניקות ולכן פותחו על ידי, ואחרים כדי להעריך מכניקה אפיתל ויוו במהלך הפיתוח. אני אתן סקירה מהירה של שלושת הטכניקות העיקריות בשימוש ברקמות האפיתל. אבלציה לייזר, שיטה בשימוש נרחב, מאפשרת לחשוף את הלחץ מכני מקומי ברמת התא צמתי5,6,7,8 או גדולים בקנה מידה9,10,11 על-ידי ביצוע חתכים המקומי לשבש את תקינות מכנית של המטרה. הדינמיקה של הפתח בעקבות החתך מספק מידע על אבלציה מוקדמת מתח, וגם על rheology של12,רקמת13. החיסרון של אבלציה לייזר היא שזה פולשני, כפי שהוא דורש שיבוש קליפת תא מקומיים. לפיכך, אחת ניתן לבצע רק מספר מוגבל של ablations אם אדם רוצה לשמר את שלמות רקמות. חיסרון נוסף הוא כי ablations מספקים רק הערכות היחסי של מתח התא באנשי קשר, מאז פתיחת המהירות תלויה חיכוך צמיגה, אשר בדרך כלל אינו ידוע. מניפולציה מגנטי גם פותחה, בשימוש דרוזופילה, המערבים את השימוש ferrofluids14 או ליפוזומים ultramagnetic15. הם יכולים לספק מדידות מוחלטת16,17, אבל הם גם פולשני במובן שהן דורשות ההזרקה של הגששים-המיקום הרצוי. זה יכול להיות מסובך מאוד תלוי במערכת, וזה לא תמיד לבצע זריקות מדויקות. טכניקה שלישית, לחלוטין לא פולשנית, היא כוח היסק18,19,20. כוח היסק מסתמך על ההנחה של שיווי משקל מכני בנקודות טריפל (tricellular צמתים או קודקודים), מאפשר להסיק המתחים בכלל תא-תא אנשי קשר (ואולי, לחצים בכל תאי) על ידי פתירת בעיית ההופכי. מתחים, כל קודקוד מספק שתי משוואות (X ו- Y). זה מניב מערכת גדולה של משוואות לינאריות, אשר יכולה להיות הפוכה בתנאים מסוימים כדי להעריך את המתח על כל אנשי הקשר של התא. אמנם שיטה זו מושכת מאוד, כפי שהיא דורשת רק תמונה מקוטעת, לא ניסוי נוסף או את תוכנית ההתקנה, רמת הדיוק שלה היא עדיין לקבוע, שוב זה רק מספק ערכים יחסיים, אלא אם כן מתבצעת מדידה כיול מוחלטת.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, נסקור במאמר זה כיוונון של פינצטה אופטית מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון להחלת כוחות מבוקרת המידה תא ב האפיתל מתחלקים של melanogaster דרוזופילה. מלקחיים אופטיים שימשו עבור יישומים ביולוגיים רבים, כולל את המידות על חלבונים יחיד ומניפולציה של organelles ותאים21. כאן, אנחנו מדווחים כוחות יישומית בטווח של כמה עשרות pN, אשר קטן עדיין מספיק כדי לגרום העיוותים המקומיים אנשי תא ולבצע מדידות מכניות ויוו. בדרך כלל, אנו משתמשים הסטה אנכית של אנשי קשר תא, פיקוח באמצעות הניתוח של kymographs, להתייחס כוח דפורמציה. חשוב, ההתקנה שלנו לא דורשת ההזרקה של החרוזים על המיקום הרצוי בתוך הרקמה, כפי מלקחיים אופטיים מסוגלים להפעיל כוחות על התא-תא אנשי קשר ישירות. זיווג מלקחיים אופטיים כדי מיקרוסקופ אור גיליון מאפשרת לבצע הדמיה מהירה (מספר פריימים לשניה), וזה ניכר מאוד עבור ניתוח מכני-פרקי זמן קצרים, ועם phototoxicity מופחת, מאז איור מדגם הוא מוגבל למישור הדמיה22.
פינצטה אופטית, הכולל, הם דרך לא פולשנית כדי להחיל כוחות מבוקרת תא באנשי קשר ויוו ב העובר דרוזופילה , וכדי לחלץ מידע מכני כגון נוקשות ועל מתח התא אנשי קשר23, מאפייני rheological 24, ואת הדרגה או מתח23. בנוגע למקורו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td>
			<td style="width:179px;">IPG Laser</td>
			<td style="width:179px;">YLM-10-LP-SC</td>
			<td style="width:591px;">including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">&#216;1/2&#34; Optical Beam Shutter</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">SH05</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Small Beam Diameter Galvanometer Systems</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GVS001</td>
			<td style="width:591px;">1 for X displacement, 1 for Y displacement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">1D or 2D Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GPS011</td>
			<td style="width:591px;">galvanometers power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">2 lenses f = 30mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1757-B</td>
			<td style="width:591px;">relay telescope between 2 galva</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 200mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1945-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 500mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1869-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">KCB1E</td>
			<td style="width:591px;">Periscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LG1</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">45&#176; AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror</td>
			<td style="width:179px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:179px;">#64-470</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Multiphoton-Emitter HC 750/S</td>
			<td style="width:179px;">AHF</td>
			<td style="width:179px;">HC 750/SP</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">CompactDAQ Chassis</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">cDAQ-9178</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Output Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9263</td>
			<td style="width:591px;">Analog output module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Input Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9215</td>
			<td style="width:591px;">Analog input module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &#181;m, red fluorescent (580/605), 2% solids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F8812</td>
			<td>calibration beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C++ (Qt) home made optical tweezers software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s. Alternative solution: labview</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo

מורפוגנזה דורשת תיאום בין המתבנת גנטי וכוחות מכני robustly לעצב את תאים ורקמות. ומכאן, אתגר להבין תהליכים morphogenetic הוא למדוד ישירות כוחות הסלולר לבין תכונות מכניות ויוו במהלך מופרה. כאן, אנו מציגים את כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, המאפשר ליישם ישירות כוחות על אנשי קשר תאים תאים של העובר דרוזופילה מוקדם, תוך כדי הדמיית במהירות של מספר פריימים לשניה. טכניקה זו יש יתרון כי הוא אינו דורש ההזרקה של חרוזים לתוך העובר, בדרך כלל נעשה שימוש הגששים ביניים שבו כוחות אופטי הם המופעל. אנחנו מפרטים שלב אחר שלב המימוש של ההתקנה, ולהציע כלים כדי לחלץ מידע מכני של הניסויים. על ידי ניטור של displacements של תא-תא אנשי הקשר בזמן אמת, אחד יכול לבצע מדידות מתח ולחקור rheology של אנשי הקשר של התא.

איור 5 מציג נתונים ניסיוני מתקבל על ידי הטלת תנועה sinusoidal למלכודת. ההשמנה מייצרת אפשרות סטיה של הממשק, למשל, הצילומים 3 מציג ממשק רצופים 3 עמדות (איור 5A)23. סרטים מוקלטים משמשים כדי ליצור את kymograph (איור 5B), עוד ניתוח ?...

Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

אנו מציגים כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, ואת יישומו כדי לחקור מכניקה תא בלי חרוזים ב העובר דרוזופילה .

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במכניקת רקמות כגון כיצד תכונות של מגעים תאים לשנות במרחב ובזמן במהלך morphogenesis רקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פולשנית חלשה והיא תואמת הדמיה חיה כגון מיקרוסקופיה של יריעות אור. טכניקה זו אינה דורשת הזרקה של חרוזים לרקמה.בדרך כלל משמש כבדיקות demiere שבו כדי לקבל froses, אני מתרגש. הדגמת התהליך תהיה Chardes, מהנדס, ורפאל קלמנט, מדען מחקר מרמת השטח שלי. כדי להתחיל, להגדיר מיקרוסקופ זקוף עבור מיקרוסקופ יריעות אור במישור האופקי, ולאחר מכן להכין את הלייזר ואת האופטיקה לפעול כמו פינצטה אופטית.לאחר מכן, יש לצנרת מיקרו-ליטר אחד של 500 חרוזי ננואורסצנט אל קובט זכוכית, ולהוסיף 10 מיליליטר של מים מזוקקים. מניחים את ה- cuvette במחזיק ה- cuvette תחת המטרה, ומתאימים את מוקד המטרה כך שהמטרה נוגעת במשטח המים. עכשיו, לפתוח את סביבת פיתוח משולבת QT הבורא אשר משמש כדי לשלוט בתוכנת הרכישה.פתח את תוכנת הרכישה, על ידי פתיחת microRheo. והפעיל את מצב הרכישה החיה, על-ידי בחירה בשידור חי. לפני החלפת הלייזר, לשים על משקפי בטיחות, ולאחר מכן, להתאים את כוח הלייזר לוואט אחד, ולהדליק את הלייזר.ההזנה החיה אמורה להראות עכשיו חרוז לכוד במוקד הלייזר. במידת הצורך, התאימו את מיקום עדשת הטלסקופ השנייה, כדי לצפות בקדושה בפוקוס. ייתכן גם שיהיה צורך להתאים את הזווית של תמרוני פריסקופ למרכז את חרוז בתמונה.הכן את לוח איסוף הנתונים ואת חיבורי המדרכה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. בממשק התריס האופטי, התאם את הפרמטר זמן פתוח שניה, ל- 000.000, את פרמטר ה- sec שנסגר ל- 000.000, את פרמטר המצב ל יחיד ואת פרמטר הגורם המפעיל ל- EXT. לאחר הגדרה, בחר בלחצן הפוך לזמין.ביוצר QT, לפתוח את ot. כדי לפתוח את הפרוייקט. שנה את שם הקלט והפלט באוגנרטור.cpp כדי להתאים את כרטיסי MI ששימשו בהגדרה שלך. לבסוף, בצע קומפילציה והפעל את תוכנת פינצטה אופטית. בתוכנת הרכישה, בחר את זמן החשיפה הרצוי, את המשחק, את הזמן בין שתי תמונות, את מספר התמונות שיש לרכוש ואת כוחו של הלייזר.לאחר מכן, בתוכנת פינצטה אופטית, להגדיר את הפרמטר פינצטה אופטי, המוצג כאן, כדי לעקוב אחר מעגל. לאחר מכן, סמן את תיבת הפרמטרים של הבינה המלאכותית, את התיבה משקל קדימה ולחץ על לחצן ההצבה ולאחר מכן התחל את רכישת התמונה. הפעל את הפינצטה האופטית, בחר את לחצן יצירת, ואפשר בחרוז הלכוד להשלים לפחות שני עיגולים מלאים, ולאחר מכן הפסק את הפינצטה האופטית, על-ידי ביטול הבחירה בלחצן יוצר.לבסוף, הפסק את רכישת התמונה. שים לב שסרט tiff וקובץ טקסט עם מתחי גלוונומטר נוצרים בתיקיית ברירת המחדל. פתח את Matlab, עבור לתיקיית הכיול והפעל את המיקום שני סקריפט מתח הסקריפט מחשב את פונקציית האינטרפולציה, מתרגם מתחי גלוונומטר למיקום מלכודת אופטי.לאחר מכן, המשך בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי להגדיר את סרט הכיול. בדוק אם מפת האינטרפולציה עבור עמדות לייזר X ו- Y מחושבת ומוצגת כראוי על-ידי קובץ ה- Script. בדוק אם קיימים אזורים לבנים במפה, המייצגים ערכים חסרים.אם קיימים אזורים לבנים משמעותיים, חזור על הפעולה באמצעות סרט כיול חדש. סרט הכיול המוצג כאן מייצג סרט עם נתונים נאותים. בעזרת כידון, או מברשת לחה, בחרו כ-10 עוברים בשלב הרצוי ויישרו אותם.לאחר מכן השתמש בעט סימון יהלום כדי לחתוך חתיכה מגלשת הזכוכית, ל 10 על 20 על ידי מילומטר אחד. מוסיפים דבק בצד אחד של החתיכה החתוכה, ולתת לו להתייבש במשך 20 שניות, ולאחר מכן להפוך את החתיכה לחתוך מעל, ולמקם אותו על קו העוברים, דבק אותו בקצה השקופית. לאחר מכן, להתקין את ההכנה במחזיק מדגם, ולמקם את המחזיק אל cuvette, ולאחר מכן למקם את cuvette על מצב piso-חשמלי, ולמלא אותו במים.כדי להתחיל, למצוא את המיקום של עניין, ולהזיז את נקודת האמצע של צומת היעד למיקום של מלכודת לייזר, באמצעות שלב pisar. הגדר את הפרמטרים של המלכודת כדי להשיג תנודות בניצב לקו המגע. כמו כן להגדיר את השלבים כאפס, משרעת ב X ו Y כיוונים יש תנועה בניצב לקו המגע, ולהגדיר את משרעת 0.1 וולט.עכשיו, להתחיל את הרכישה, באמצעות קצב מסגרות מהיר, כגון 10 מסגרות לשנייה. לאחר שההדמיה החלה, הפעל את פינצטה אופטית על ידי לחיצה על כפתור ללכת ללחוץ. לאחר השלמת ההדמיה, כבה את פינצטה והפסק את רכישת התמונה.בתיקיה שצוינה, יהיה סרט, וקובץ טקסט המכיל את מתחי גלוונומטר במהלך הרכישה. פתח את הסרט כדי לצפות במסגרות שנאספו. לאחר ניתוח הסרטון, למדוד את הנוקשות ואת המתח בדגימה רקמה, על ידי פתיחת הווידאו ב Matlab.כאן, השתמש בפונקציית ההתוויה, כדי להתוות את מיקום הממשק כפונקציה של מיקום המלכודת. לאחר מכן, השתמש בארגז הכלים ללא התאמה קלה של Matlab כדי לבצע התאמה ליניארית של הנתונים. ההופכי של שיפוע מתאים, מספק את היחס הממוצע של מיקום ההשמנה מעל מיקום הממשק.ממידע זה, השתמש במשוואות בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי לקבוע את הנוקשות וערכי המתח. מלכודת הלייזר מייצרת הסטה סינוזואידית של המדגם, כי הוא בניצב לממשק. מוצג כאן כשלוש עמדות ממשק רצופות.זה יכול גם להיות מוקלט כמו סרטים כדי ליצור אקלים והם מנותחים עוד יותר כדי לקבוע את המיקום של הממשק עם רזולוציית תת פיקסל. כאן, התקופה הייתה חמש שניות. במשטר של עיוותים קטנים, עמדות המלכודת והממשק הן פרופורציונליות.משרעת הסטת הממשק יחסית לזה של המלכודת נותנת גישה למתח ממשק או נוקשות. מוצגים כאן היסודות של ניסוי משיכה ושחרור. כאשר המלכודת האופטית מופעלת, במרחק של מיקרומטר אחד בערך מנקודת האמצע של הממשק בין שני תאים, הממשק מסיט לכיוון מיקום המלכודת.לאחר מכן המלכודת כבויה לאחר משך הזמן הרצוי. ניתן להשוות את הגרף המתקבל למודלים לוגיים אמיתיים המשוערים, כגון מודל דמוי מקסוול. DOn't לשכוח כי עבודה עם לייזר אינפרא אדום יכול להיות מסוכן מאוד, ואמצעי זהירות כגון לבישת משקפי מגן, תמיד היה צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.כאן, עם המשתמש השכיח ביותר מן פינצטה tinkle עבור אלה של העובר, השיטה יכולה לשמש גם עבור מערכות אם אחרות כגון

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...