Name: probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

यह काम एक FRM लैस ग्रांट FRM DEQ20130326509, Agence राष्ट्रीयकृत डे ला सभ्य ANR-ब्लैंक ग्रांट, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (टू पी.-F.L.) द्वारा समर्थित किया गया । हम फ्रांस-इमेजिंग फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी (ANR-10-INBS-04-01, «भविष्य» के लिए निवेश) द्वारा समर्थित बुनियादी ढांचा स्वीकार करते हैं । हम तकनीकी सहायता के लिए PICSL-एफबीआई के बुनियादी ढांचे से ब्राईस Detailleur और क्लाउड Moretti का शुक्रिया अदा करते हैं ।

1. सेट अप प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप
<ol><li>पिछले प्रकाशन25में सेटअप का वर्णन करने के लिए देखें । नोट: सेटअप एक ईमानदार माइक्रोस्कोप मंच और क्षैतिज विमान में एक प्रकाश चादर का निर्माण एक प्रकाश शीट म...

<ol>
	<li>Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation,+transmission,+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis.">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li><li>Heisenberg, C. -. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues.">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), 186-196 (2016).</li><li>Camp&#224;s, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues.">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis.">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li><li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling.">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling.">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li><li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bella&#239;che, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Etournay, R., Popovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex.">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., R&#246;per, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation.">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883 (2017).</li><li>Camp&#224;s, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li><li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues.">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li><li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays.">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).</li><li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis.">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li><li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellFIT:+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries.">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+optical+forces.">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Bambardekar, K., Cl&#233;ment, R., Blanc, O., Chard&#232;s, C., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo.">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li><li>Cl&#233;ment, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis.">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li><li>Chard&#232;s, C., M&#233;n&#233;lec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development.">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).</li><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li><li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins.">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li></ol>

ऑप्टिकल चिमटी एक गैर इनवेसिव तरीके से विकासशील भ्रूण उपकला में सीधे पूर्ण यांत्रिक माप प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं । उस अर्थ में, यह ऐसे लेजर पृथक, जो आक्रामक है और रिश्तेदार माप, चुंबकीय बलों, ?...

भ्रूण विकास एक अत्यधिक reproducible प्रक्रिया है जिसके दौरान कोशिकाओं और ऊतकों को भविष्य के जानवर को आकार ख़राब है । इस तरह के विकृति कोशिका स्तर1,2पर बलों की सक्रिय पीढ़ी की आवश्यकता के लिए दिखाया गया है । morphogenetic प्रक्रियाओं को समझने के लिए जिसके दौरान कोशिकाओं और ऊतकों को अपने आकार बदलने के लिए, यह इसलिए शामिल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों का आकलन करने के लिए कुंजी है, और प्रक्रिया के दौरान ऊतक के भीतर बलों को मापने के लिए3,4 . विशेष रूप से Drosophilaमें उपकला परतों, व्यापक रूप से उनके अर्ध 2d ज्यामिति के कारण और उनके आसान हेरफेर करने के लिए अध्ययन किया गया है.
तकनीक के एक नंबर इस प्रकार हमारे द्वारा विकसित किया गया है और दूसरों के विकास के दौरान vivo में उपकला यांत्रिकी का आकलन करने के लिए. हम उपकला ऊतकों में इस्तेमाल तीन मुख्य तकनीकों का एक त्वरित अवलोकन दे देंगे. लेजर पृथक, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि, सेल जंक्शनों पर स्थानीय यांत्रिक तनाव प्रकट करने के लिए अनुमति देता है5,6,7,8 या बड़े पैमाने पर9,10,11 स्थानीय कटौती है कि लक्ष्य की यांत्रिक अखंडता को बाधित प्रदर्शन करके । कटौती के बाद खोलने की गतिशीलता दोनों तनाव पूर्व पृथक पर जानकारी प्रदान करता है, और ऊतक के rheology पर12,13. लेजर पृथक की एक खामी यह है कि यह आक्रामक है, क्योंकि यह सेल प्रांतस्था के स्थानीय व्यवधान की आवश्यकता है । इसलिए, एक केवल ablations की एक सीमित संख्या में प्रदर्शन कर सकते है यदि एक ऊतक अखंडता को बचाना चाहता है । एक और खामी यह है कि ablations केवल सेल संपर्कों में तनाव के सापेक्ष अनुमान प्रदान करते हैं, क्योंकि खुलने का वेग चिपचिपा घर्षण पर निर्भर होता है, जो सामान्यतः ज्ञात नहीं होता है । चुंबकीय हेरफेर भी विकसित किया गया है और Drosophilaमें इस्तेमाल किया, या तो ferrofluids14 या ultramagnetic liposomes15के उपयोग को शामिल । वे निरपेक्ष माप16,17प्रदान कर सकते हैं, लेकिन इस अर्थ में भी आक्रामक है कि वे वांछित स्थान पर जांच के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है । इस प्रणाली है, जो हमेशा सटीक इंजेक्शन के लिए उत्तरदाई नहीं है पर निर्भर करता है बहुत मुश्किल हो सकता है । एक तीसरी तकनीक, पूरी तरह से गैर इनवेसिव, बल अनुमान है18,19,20। बल निष्कर्ष ट्रिपल अंक (tricellular जंक्शनों, या वर्टेक्स) में यांत्रिक संतुलन की धारणा पर निर्भर करता है, और सभी सेल में तनाव का अनुमान करने की अनुमति देता है सेल संपर्कों (और संभवतः, सभी कोशिकाओं में दबाव) एक व्युत्क्रम समस्या को हल करके । तनाव के लिए, प्रत्येक शीर्ष दो समीकरणों (एक्स और वाई) प्रदान करता है । इस पैदावार रैखिक समीकरणों की एक बड़ी प्रणाली है जो कुछ शर्तों के तहत औंधा किया जा सकता है सभी सेल संपर्कों में तनाव का आकलन । हालांकि यह विधि बहुत आकर्षक है, क्योंकि यह केवल एक विभाजित छवि और कोई अतिरिक्त प्रयोग या सेटअप की आवश्यकता है, इसकी सटीकता अभी तक निर्धारित करने के लिए है, और फिर यह केवल सापेक्ष मान प्रदान करता है, जब तक कि एक निरपेक्ष अंशांकन माप किया जाता है ।
इन सीमाओं में से कुछ को दूर करने के लिए, हम इस लेख ऑप्टिकल Drosophila melanogasterके भ्रूण उपकला में कोशिका पैमाने पर नियंत्रित बलों को लागू करने के लिए एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप करने के लिए मिलकर चिमटी का एक सेटअप में परिचय । ऑप्टिकल चिमटी एकल प्रोटीन पर माप और organelles और कोशिकाओं21के हेरफेर सहित कई जैविक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है । यहां, हम कुछ दर्जन pN है, जो छोटे अभी तक सेल संपर्कों के स्थानीय विकृतियों को प्रेरित और vivo मेंयांत्रिक माप प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है की सीमा में लागू बलों की रिपोर्ट । आमतौर पर, हम सेल संपर्कों के सीधा विक्षेपन का उपयोग करें, kymographs के विश्लेषण के माध्यम से निगरानी, विरूपण के लिए बल संबंधित है । महत्वपूर्ण बात, हमारे सेटअप के ऊतकों में वांछित स्थान पर मोतियों की इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है, के रूप में ऑप्टिकल चिमटी सीधे सेल सेल संपर्कों पर बलों को लागू करने में सक्षम हैं । एक हल्की चादर माइक्रोस्कोप करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी के युग्मन एक रैपिड इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है (प्रति सेकंड कई फ्रेम), जो कम समय तराजू पर एक यांत्रिक विश्लेषण के लिए बहुत प्रशंसनीय है, और कम phototoxicity के साथ, के रोशन के बाद से नमूना इमेजिंग22के विमान तक ही सीमित है ।
कुल मिलाकर, ऑप्टिकल चिमटी एक गैर इनवेसिव तरीका Drosophila भ्रूण में vivo में सेल संपर्कों पर नियंत्रण बलों को लागू कर रहे हैं, और इस तरह के सेल संपर्क23, rheological गुण में कठोरता और तनाव के रूप में यांत्रिक जानकारी निकालने के लिए 24, और ढाल या तनाव के anisotropy23।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td>
			<td style="width:179px;">IPG Laser</td>
			<td style="width:179px;">YLM-10-LP-SC</td>
			<td style="width:591px;">including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">&#216;1/2&#34; Optical Beam Shutter</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">SH05</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Small Beam Diameter Galvanometer Systems</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GVS001</td>
			<td style="width:591px;">1 for X displacement, 1 for Y displacement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">1D or 2D Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GPS011</td>
			<td style="width:591px;">galvanometers power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">2 lenses f = 30mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1757-B</td>
			<td style="width:591px;">relay telescope between 2 galva</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 200mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1945-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 500mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1869-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">KCB1E</td>
			<td style="width:591px;">Periscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LG1</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">45&#176; AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror</td>
			<td style="width:179px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:179px;">#64-470</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Multiphoton-Emitter HC 750/S</td>
			<td style="width:179px;">AHF</td>
			<td style="width:179px;">HC 750/SP</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">CompactDAQ Chassis</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">cDAQ-9178</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Output Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9263</td>
			<td style="width:591px;">Analog output module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Input Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9215</td>
			<td style="width:591px;">Analog input module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &#181;m, red fluorescent (580/605), 2% solids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F8812</td>
			<td>calibration beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C++ (Qt) home made optical tweezers software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s. Alternative solution: labview</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo

Morphogenesis आनुवंशिक पैटर्न और यांत्रिक बलों के बीच समंवय के लिए मजबूती से कोशिकाओं और ऊतकों को आकार की आवश्यकता है । इसलिए, एक चुनौती morphogenetic प्रक्रियाओं को समझने के लिए सीधे सेलुलर बलों और embryogenesis के दौरान vivo में यांत्रिक गुणों को मापने के लिए है । यहाँ, हम एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप करने के लिए मिलकर ऑप्टिकल चिमटी के एक सेटअप मौजूद है, जो सीधे सेल के जल्दी Drosophila भ्रूण के सेल संपर्कों पर बल लागू करने के लिए अनुमति देता है, जबकि प्रति सेकंड कई फ्रेम की गति से इमेजिंग. इस तकनीक का लाभ है कि यह भ्रूण में मोतियों की इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है, आमतौर पर मध्यवर्ती जांच जिस पर ऑप्टिकल बलों लागू कर रहे है के रूप में इस्तेमाल किया है । हम कदम के विस्तार से कदम सेटअप के कार्यांवयन, और उपकरणों का प्रस्ताव को प्रयोगों से यांत्रिक जानकारी निकालने के लिए । वास्तविक समय में सेल-सेल संपर्कों के विस्थापन की निगरानी करके, एक तनाव माप प्रदर्शन और सेल संपर्क ' rheology की जांच कर सकते हैं ।

चित्रा 5 के जाल के लिए एक sinusoidal आंदोलन थोप द्वारा प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा से पता चलता है. जाल इंटरफ़ेस का विक्षेपन पैदा करता है, के रूप में 3 स्नैपशॉट 3 क्रमिक इंटरफेस पदों (?...

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Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

हम एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप करने के लिए युग्मित ऑप्टिकल चिमटी के एक सेटअप मौजूद है, और Drosophila भ्रूण में मोतियों के बिना सेल यांत्रिकी जांच करने के लिए इसके कार्यांवयन ।

Drosophila भ्रूण में मनका मुक्त ऑप्टिकल चिमटी के साथ सेल यांत्रिकी की जांच

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

यह विधि ऊतक यांत्रिकी में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है जैसे कि ऊतक मॉर्फोजेनेसिस के दौरान सेल सेल संपर्कों के गुण अंतरिक्ष और समय में कैसे बदलते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह कमजोर आक्रामक है और यह लाइव इमेजिंग जैसे लाइट शीट माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है। इस तकनीक को ऊतक में मोतियों के इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है।आमतौर पर demiere जांच जिस पर froses पाने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया, मैं उत्साहित हूं । इस प्रक्रिया का प्रदर्शन Chardes, एक इंजीनियर, और रफ़ाएल क्लेमेंट, इलाके के अपने स्तर से अनुसंधान वैज्ञानिक होगा । शुरू करने के लिए, क्षैतिज मैदान में प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के लिए एक ईमानदार माइक्रोस्कोप स्थापित करें, फिर ऑप्टिकल चिमटी के रूप में कार्य करने के लिए लेजर और प्रकाशिकी तैयार करें।इसके बाद, एक माइक्रो-लीटर 500 नैनोमीटर फ्लोरोसेंट मोतियों को ग्लास क्यूवेट में पाइप करें, और 10 मिलीलीटर आसुत पानी जोड़ें। उद्देश्य के तहत क्यूवेट धारक में क्यूवेट रखें, और उद्देश्य के ध्यान को समायोजित करें ताकि उद्देश्य पानी की सतह को छू सके। अब, एकीकृत विकास पर्यावरण क्यूटी क्रिएटर खोलें जिसका उपयोग अधिग्रहण सॉफ्टवेयर को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है।माइक्रोआरेओ खोलकर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें। प्रोफ़ाइल, और लाइव अधिग्रहण मोड को चालू करें, लाइव का चयन करके। लेजर पर स्विच करने से पहले, सुरक्षा काले चश्मे पर डाल दिया, तो, एक वाट के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें, और लेजर पर स्विच करें।लाइव फीड को अब लेजर के फोकस में फंसा मनका दिखाना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो ध्यान में मनका का निरीक्षण करने के लिए, दूसरे टेलीस्कोप लेंस की स्थिति को समायोजित करें। किसी को छवि में मनका को केंद्र में लाने के लिए पेरिस्कोप युद्धाभ्यास के कोण को समायोजित करने की भी आवश्यकता हो सकती है।डेटा अधिग्रहण बोर्ड और अंकुश कनेक्शन तैयार करें, जैसा कि साथ वाले टेक्स्ट प्रोटोकॉल के चित्र तीन में वर्णित है। ऑप्टिकल शटर इंटरफेस पर, समय खुला सेकंड पैरामीटर समायोजित करें, 000.000 करने के लिए, समय बंद सेकंड पैरामीटर 000.000 करने के लिए, मोड पैरामीटर एकल करने के लिए, और EXT के लिए ट्रिगर पैरामीटर। सेट करने के बाद, सक्षम बटन का चयन करें।क्यूटी क्रिएटर में ओटी खोलें। परियोजना को खोलने के लिए प्रोफ़ाइल। एजेनेरेटर में इनपुट और आउटपुट का नाम बदलें।सीपीपी फ़ाइल आपके सेट अप में उपयोग किए जाने वाले एमआई कार्ड से मेल खाती है। अंत में, ऑप्टिकल चिमटी सॉफ्टवेयर संकलित और चलाएं। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, वांछित एक्सपोजर समय, खेल, दो छवियों के बीच का समय, प्राप्त की जाने वाली छवियों की संख्या और लेजर की शक्ति का चयन करें।फिर, ऑप्टिकल चिमटी सॉफ्टवेयर में, ऑप्टिकल चिमटी पैरामीटर सेट, यहां दिखाया गया है, एक सर्कल का पता लगाने के लिए । इसके बाद, एआई पैरामीटर बॉक्स, वेट फॉरवर्ड बॉक्स की जांच करें, और रिकॉर्ड पुश बटन दबाएं, फिर छवि अधिग्रहण शुरू करें। ऑप्टिकल चिमटी पर स्विच करें, उत्पादन बटन का चयन करें, और फंसे हुए मनका को कम से कम दो पूर्ण सर्कल को पूरा करने की अनुमति दें, फिर उत्पीडिंग बटन का चयन करके ऑप्टिकल चिमटी को रोकें।अंत में, छवि अधिग्रहण बंद करो। ध्यान दें कि एक झगड़ा फिल्म, और गैल्वाओमीटर वोल्टेज के साथ एक पाठ फ़ाइल डिफ़ॉल्ट फ़ोल्डर में बनाई जाती है। Matlab खोलें, अंशांकन फ़ोल्डर पर जाएं, और स्थिति दो तनाव स्क्रिप्ट चलाने के लिए स्क्रिप्ट इंटरपोलेशन समारोह की गणना, ऑप्टिकल जाल स्थिति के लिए गैल्वेनोमीटर वोल्टेज का अनुवाद ।इसके बाद, अंशांकन फिल्म स्थापित करने के लिए साथ पाठ प्रोटोकॉल में साथ का पालन करें । जांच करें कि एक्स और वाई लेजर पदों के लिए इंटरपोलेशन मानचित्र की गणना की जाती है और स्क्रिप्ट द्वारा ठीक से प्रदर्शित की जाती है। नक्शे में सफेद क्षेत्रों की जांच करें, जो लापता मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं।यदि महत्वपूर्ण सफेद क्षेत्र हैं, तो एक नई अंशांकन फिल्म के साथ ऑपरेशन दोहराएं। यहां दिखाई गई अंशांकन फिल्म पर्याप्त डेटा वाली फिल्म का प्रतिनिधित्व करता है । एक पाइक, या एक नम ब्रश का उपयोग करना, वांछित चरण में लगभग 10 भ्रूण का चयन करें और उन्हें संरेखित करें।फिर ग्लास स्लाइड के एक टुकड़े को काटने के लिए एक डायमंड मार्किंग पेन का उपयोग करें, 10 से 20 तक एक मिलियनोमीटर। कट टुकड़े के एक तरफ गोंद जोड़ें, और इसे 20 सेकंड के लिए सूखने दें, फिर कट पीस को चालू करें, और इसे स्लाइड के किनारे पर चिपकाकर भ्रूण की रेखा पर रखें। इसके बाद, नमूना धारक में तैयारी स्थापित करें, और धारक को क्यूवेट में रखें, फिर पिकेट को पिसो-इलेक्ट्रिक स्थिति पर रखें, और इसे पानी से भरें।शुरू करने के लिए, ब्याज के स्थान को ढूंढें, और पिसार चरण का उपयोग करके लक्ष्य जंक्शन के मिडपॉइंट को लेजर ट्रैप की स्थिति में ले जाएं। संपर्क लाइन के लंबवत दोलनों को प्राप्त करने के लिए जाल के मापदंडों को सेट करें। इसके अलावा शून्य के रूप में चरणों सेट, एक्स और वाई दिशाओं में आयाम संपर्क लाइन के लिए लंबवत एक आंदोलन है, और ०.१ वोल्ट के लिए आयाम सेट ।अब, अधिग्रहण शुरू करें, एक तेज फ्रेम दर का उपयोग करके, जैसे कि 10 फ्रेम प्रति सेकंड। इमेजिंग शुरू हो जाने के बाद, गो पुश बटन दबाकर ऑप्टिकल चिमटी पर स्विच करें। जब इमेजिंग पूरी हो जाती है, तो चिमटी बंद कर दें, और छवि अधिग्रहण को रोकें।निर्दिष्ट फ़ोल्डर में, एक फिल्म होगी, और अधिग्रहण के दौरान गैल्वेनोमीटर वोल्टेज युक्त एक टेक्स्ट फाइल होगी। एकत्र फ्रेम का निरीक्षण करने के लिए फिल्म खोलें। वीडियो के विश्लेषण के बाद, मटलैब में वीडियो खोलकर, ऊतक नमूने में कठोरता और तनाव को मापें।यहां, जाल की स्थिति के कार्य के रूप में इंटरफेस की स्थिति को प्लॉट करने के लिए प्लॉट फ़ंक्शन का उपयोग करें। फिर, डेटा के रैखिक फिट करने के लिए मैटलैब आसान फिट फ्री टूलबॉक्स का उपयोग करें। फिट की ढलान का व्युत्क्रम, इंटरफ़ेस स्थिति पर जाल की स्थिति का औसत अनुपात प्रदान करता है।इस जानकारी से, कठोरता, और तनाव मूल्यों को निर्धारित करने के लिए साथ पाठ प्रोटोकॉल में समीकरणों का उपयोग करें। लेजर ट्रैप नमूने का एक साइनसॉयडल विक्षेप पैदा करता है, जो इंटरफ़ेस के लंबवत है। यहां लगातार तीन इंटरफेस पदों के रूप में दिखाया गया है।इसे क्लाइमोग्राफ उत्पन्न करने के लिए फिल्मों के रूप में भी दर्ज किया जा सकता है और उप-पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ इंटरफ़ेस की स्थिति निर्धारित करने के लिए आगे विश्लेषण किया जाता है। यहां यह अवधि पांच सेकेंड थी। छोटे विकृतियों के शासन में, जाल और इंटरफेस की स्थिति आनुपातिक हैं।जाल के सापेक्ष इंटरफ़ेस विक्षेप का आयाम इंटरफ़ेस तनाव या कठोरता तक पहुंच प्रदान करता है। यहां दिखाया गया है एक पुल और रिलीज प्रयोग की मूल बातें हैं । जब ऑप्टिकल जाल चालू होता है, तो दो कोशिकाओं के बीच इंटरफ़ेस के मध्य बिंदु से लगभग एक माइक्रोमीटर दूर होता है, तो इंटरफ़ेस जाल की स्थिति की ओर विक्षेपित होता है।इसके बाद वांछित समय के बाद जाल को बंद कर दिया जाता है। परिणामस्वरूप ग्राफ की तुलना परिकल्पना वास्तविक तार्किक मॉडलों से की जा सकती है, जैसे मैक्सवेल जैसे मॉडल। DOn भूल नहीं है कि अवरक्त लेजर के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है, और इस तरह के सुरक्षात्मक काले चश्मे पहनने के रूप में सावधानियों, हमेशा लिया जाना चाहिए था जब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन ।यहां, भ्रूण के उन लोगों के लिए टिंकल चिमटी से सबसे लगातार उपयोगकर्ता के साथ, विधि भी इस तरह के रूप में अंय मां प्रणालियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Zebrafish भ्रूण में Microbead आरोपण

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

लिविंग zebrafish भ्रूण में subcellular संरचनाओं इमेजिंग

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

ईरीथ्रोमाइलॉयड प्रजनकों की पहचान और उनकी गर्भ में फ्लो साइटोमैट्री द्वारा माउस भ्रूण

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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वयस्क Drosophila melanogaster दिमाग में मशरूम शरीर और Photoreceptor न्यूरॉन्स के विच्छेदन और Immunofluorescent धुंधला

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Zebrafish भ्रूण जर्दी सेल में AFM और Microrheology

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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सेल एकत्रीकरण परख सीआईएसद्वारा ट्रांस-लाइगैंडों और उसके निषेध के साथ Drosophila पायदान के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए-लाइगैंडों

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Zebrafish भ्रूण में सेल Photoconversion के द्वारा निंनलिखित Endocardial ऊतक आंदोलनों

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

न्यूनतम इनवेसिव भ्रूण हस्तांतरण और खरगोश मॉडल में इष्टतम भ्रूण के चरण में भ्रूण काचन

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-आधारित प्रणाली के लिए Vivo में भ्रूण Cardiomyocytes के प्रत्यारोपण में एवियन भ्रूण

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

लाइव इमेजिंग और Drosophila भ्रूण में मांसपेशी संकुचन का विश्लेषण

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...