Name: probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

この作品は、FRM エキップ グラント FRM DEQ20130326509、アジャンス ナシオナル デ ラ凝った ANR ブラン グラント Morfor ANR-11-BSV5-0008 (に p. f. l.) によって支えられました。我々 は、フランス国立研究機関 (ANR-10-INBS-04-01, «将来の投資») でサポートされているフランス バイオ イメージング インフラストラクチャを認めます。テクニカル サポート PICSL FBI インフラストラクチャからブライス Detailleur とクロード ・ モレッティに感謝します

1. 設定光シート顕微鏡
<ol><li>以前の文書25の設定の説明を参照してください。 注: セットアップは正立顕微鏡ステージの水平面内光シートを生産光シート モジュールで構成されます。励起対物レンズ × 10 ガラスキュベット (図 4) に光のシートに指示します。検出の対物レンズは高 NA (1.1) 効率的な tweezing (下記参照) のために必要があります。</li>
</...

<ol>
	<li>Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation,+transmission,+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis.">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li><li>Heisenberg, C. -. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues.">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), 186-196 (2016).</li><li>Camp&#224;s, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues.">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis.">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li><li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling.">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling.">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li><li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bella&#239;che, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Etournay, R., Popovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex.">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., R&#246;per, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation.">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883 (2017).</li><li>Camp&#224;s, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li><li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues.">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li><li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays.">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).</li><li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis.">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li><li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellFIT:+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries.">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+optical+forces.">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Bambardekar, K., Cl&#233;ment, R., Blanc, O., Chard&#232;s, C., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo.">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li><li>Cl&#233;ment, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis.">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li><li>Chard&#232;s, C., M&#233;n&#233;lec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development.">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).</li><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li><li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins.">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li></ol>

光ピンセットは、非侵襲的な方法で発展途上の胚上皮に直接絶対機械計測を実行する許可します。その意味で、それは、侵襲的と磁気力と、注射を必要とする、相対的な測定を提供するまたは強い仮定に依存する推論の力、また相対提供、レーザーアブレーションなど他の方法上の利点を提示します。測定。
プロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれています。?...

萌芽期の開発は、その中に細胞や組織を将来の動物の形に変形再現性の高いプロセスです。このような変形は、セル レベル1,2では、軍のアクティブな世代を必要とする示されています。地形形成過程中に細胞や組織は、その形状を変更して、それしたがってキー関係の細胞の力学特性を評価するために、プロセス3,4の間に組織内で力を測定するには.擬 2次元のジオメトリと簡単操作に、ショウジョウバエ、特に上皮の層は広く研究されています。
テクニックの数は、われわれや他の開発中に体内の上皮の力学評価このように開発されています。我々 は上皮組織で使用される 3 つの主要な技術の概要を与えます。セル接合5,6,7,8または9,スケール大きい10,11 のローカルの機械的ストレスを明らかにすることにより、レーザー焼灼、広く使用されている方法ターゲットの力学的整合性を混乱させる地方のカットを実行することによって。カットの次拡大のダイナミクスは、ストレス前アブレーションと組織12,13のレオロジーの両方の情報を提供します。レーザーアブレーションの欠点は、ことだが、侵襲的な細胞の皮質のローカルの中断を必要とです。したがって、試練の限られた数は、1 つは組織の整合性を保持したい場合 1 つのみ実行できます。別の欠点は、開離速度は、一般的に知られていない粘性摩擦に依存なので試練だけ細胞の接触の張力の相対的な見積もりを提供です。磁気操作はまた開発し、ショウジョウバエ、磁性14の使用または ultramagnetic リポソーム15のいずれかを含むで使用されます。彼らは絶対測定16,17を提供することができますが、目的の位置にプローブの注入を要求することの意味で侵襲も。これは常に正確な注射に従順ではないシステムによって非常に難しいことができます。3 番目の手法は、完全に非侵襲的は力の推定18,19,20です。力の推論はトリプル ポイント (tricellular 接合または頂点) で力学的平衡の仮定に依存していると推論する緊張まったく細胞連絡先 (おそらく、すべての細胞圧力) によって逆問題を解くことができます。緊張、各頂点には、2 つの方程式 (X と Y) が用意されています。これにより、大規模な連立一次方程式をすべての細胞の接触の張力を評価するためにいくつかの条件の下で反転することができます。それだけ分割イメージがない余分な実験やセットアップを必要と、この方法は非常に魅力的で、その精度は調べるには、まだ、再び絶対校正測定が行われていない限り、それはのみ相対値を提供します。
これらの制限の一部を克服するために紹介するこの記事の光ピンセットのセットアップキイロショウジョウバエの胚上皮細胞のスケールで制御された力を適用する光シート顕微鏡と結合しました。光ピンセットは、単一蛋白質および細胞内小器官や細胞の21の操作で測定を含む多数の生物学的応用のために使用されています。ここで、報告は小さい少数のダース pN の範囲で応用力まだ細胞の接触のローカル変形を誘発して体内の機械計測を実行するのに十分な。通常、力を変形に関連するのに細胞の接触、kymographs の分析を通して監視の垂直偏向を使用します。重要なは、我々 のセットアップには、光ピンセットは直接細胞間の接触に力を発揮することができる、組織内の目的の場所でビーズの注入は不要です。光シート顕微鏡光学ピンセットのカップリングの照明は非常に減らされた毒性との短い時間スケールで、機械的分析のためかなり高速イメージング (フレーム数/秒) を実行することができます、サンプル画像22の平面に制限されます。
全体的にみて、光ピンセットは、ショウジョウバエ胚の in vivo 細胞の接触力制御を適用して剛性と携帯連絡先23、張力レオロジー特性などの機械情報を抽出する非侵襲的な方法24、グラデーションや異方性張力23。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td>
			<td style="width:179px;">IPG Laser</td>
			<td style="width:179px;">YLM-10-LP-SC</td>
			<td style="width:591px;">including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">&#216;1/2&#34; Optical Beam Shutter</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">SH05</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Small Beam Diameter Galvanometer Systems</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GVS001</td>
			<td style="width:591px;">1 for X displacement, 1 for Y displacement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">1D or 2D Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GPS011</td>
			<td style="width:591px;">galvanometers power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">2 lenses f = 30mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1757-B</td>
			<td style="width:591px;">relay telescope between 2 galva</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 200mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1945-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 500mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1869-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">KCB1E</td>
			<td style="width:591px;">Periscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LG1</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">45&#176; AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror</td>
			<td style="width:179px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:179px;">#64-470</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Multiphoton-Emitter HC 750/S</td>
			<td style="width:179px;">AHF</td>
			<td style="width:179px;">HC 750/SP</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">CompactDAQ Chassis</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">cDAQ-9178</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Output Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9263</td>
			<td style="width:591px;">Analog output module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Input Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9215</td>
			<td style="width:591px;">Analog input module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &#181;m, red fluorescent (580/605), 2% solids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F8812</td>
			<td>calibration beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C++ (Qt) home made optical tweezers software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s. Alternative solution: labview</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo

形態形成には、遺伝的パターン形成と細胞や組織をしっかり形に機械力間の調整が必要です。したがって、地形形成過程を理解するための課題は、胚発生の間に細胞の力と体内の力学的性質を直接測定するためです。ショウジョウバエの初期胚の細胞間の接触の力を直接適用することができます、光シート顕微鏡と結合した光ピンセットのセットアップを提案するここでは、いくつかのフレーム/秒の速度でイメージングしながら。この手法には、胚は、通常の光学力が行使が中間のプローブとして使用ビーズの注入を必要としない利点があります。我々 は、ステップバイ ステップのセットアップの実装の詳細し、実験から力学的情報を抽出するためのツールを提案します。細胞細胞の接触リアルタイムの変位を監視することによって張力測定を実行、細胞の接触のレオロジーを調査できます。

図 5は、トラップに正弦波の動きを課すことによって得られた実験データを示しています。トラップには、3 連続インターフェイス位置 (図 5 a)23を表示 3 のスナップショットが例示として、インタ フェースのたわみが生成されます。録画したムービーは kymograph (図 5 b) の生成に使用?...

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Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

光シート顕微鏡とショウジョウバエの胚でビーズなし細胞力学をプローブへの実装に結合光ピンセットのセットアップを紹介します。

ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

この方法は、細胞細胞接触の特性が組織形態形成中の空間および時間でどのように変化するかを含む組織力学の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、弱侵襲性であり、軽シート顕微鏡などのライブイメージングと互換性があることです。この技術は、組織にビーズの注入を必要としません。通常、フラスを得るためにデミエールプローブとして使用され、私は興奮しています。このプロセスを実証するには、エンジニアのシャルデスと、私のレベルの地形の研究科学者ラファエル・クレメントです。まず、水平平野に光シート顕微鏡用の直立顕微鏡を設置し、光学ピンセットとして機能するようにレーザーと光学を準備します。次に、500ナノメートルの蛍光ビーズを1マイクロリットルのガラスキュベットにパイプアウトし、10ミリリットルの蒸留水を加えます。キュベットを目的のキュベットホルダーに置き、目的が水面に触れるように目的の焦点を調整します。次に、取得ソフトウェアの制御に使用する統合開発環境 QT Creator を開きます。マイクロRheoを開いて取得ソフトウェアを開きます。ライブを選択して、ライブ取得モードをオンにします。レーザーのスイッチを入れる前に、安全ゴーグルを置き、レーザーパワーを1ワットに調整し、レーザーのスイッチを入れます。ライブフィードは、レーザーの焦点に閉じ込められたビーズを表示する必要があります。必要に応じて、第2の望遠鏡レンズの位置を調整し、ビーズが焦点を合わせて観察する。また、画像内のビードを中央に配置するために、ペリスコープの操縦角度を調整する必要がある場合もあります。付属のテキストプロトコルの図3に示すように、データ取得ボードと縁石接続を準備します。光シャッターインターフェイスで、時間オープンsecパラメータを000.000、000.000に終了時間秒パラメータ、モードパラメータをシングルに、トリガパラメータをEXTに調整します。設定したら、[有効] ボタンを選択します。QTクリエイターで、オットを開きます。をクリックしてプロジェクトを開きます。aogenerator での入出力の名前を変更します。cpp ファイルは、セットアップで使用された MI カードと一致します。最後に、光ピンセットソフトウェアをコンパイルして実行します。取得ソフトウェアでは、目的の露光時間、ゲーム、2つの画像間の時間、取得する画像の数、およびレーザーのパワーを選択します。次に、光ピンセットソフトウェアで、ここで示す光ピンセットパラメータを設定し、円をトレースする。次に、AIパラメータボックス、ウェイトフォワードボックスをチェックし、レコード押しボタンを押して、画像取得を開始します。光ピンセットのスイッチを入れ、生成ボタンを選択し、トラップされたビーズが少なくとも2つの完全な円を完了できるようにし、生成ボタンの選択を解除して光学ピンセットを停止します。最後に、画像取得を停止します。tiff ムービーとガルバノ電圧のテキスト ファイルがデフォルト フォルダに作成されることに注意してください。Matlabを開き、キャリブレーションフォルダに移動し、位置2テンションスクリプトを実行スクリプトは、ガルバノメータ電圧を光トラップ位置に変換し、補間関数を計算します。次に、付属のテキストプロトコルに従って、キャリブレーションムービーを設定します。X および Y レーザー位置の補間マップが計算され、スクリプトによって正しく表示されているかどうかを確認します。マップ内の空白の領域を確認します。大きな白い領域がある場合は、新しいキャリブレーションムービーで操作を繰り返します。ここに示すキャリブレーションムービーは、十分なデータを持つ映画を表しています。パイク、または湿ったブラシを使用して、所望の段階で約10個の胚を選択し、それらを整列させる。その後、ダイヤモンドマーキングペンを使用して、ガラススライドの一部を10、20に1ミロメーターでカットします。カットピースの片側に接着剤を追加し、20秒間乾燥させ、カットピースをひっくり返し、スライドの端に貼り付けて胚のラインに置きます。次に、サンプルホルダーに準備を取り付け、ホルダーをキュベットに入れ、キュベットをピソ電気状態に置き、水で満たします。まず、目的の位置を見つけ、ピサールステージを使用してターゲットジャンクションの中間点をレーザートラップの位置に移動します。接触線に対して垂直な振動を実現するには、トラップのパラメータを設定します。また、フェーズをゼロに設定し、X方向とY方向の振幅は接触線に垂直に移動し、振幅を0.1ボルトに設定します。次に、1 秒あたり 10 フレームなどの高速フレーム レートを使用して取得を開始します。イメージングが始まったら、移動ボタンを押して光ピンセットのスイッチを入れ替えます。イメージングが完了したら、ピンセットのスイッチを切り、画像取得を停止します。指定されたフォルダには、撮影中にムービーとガルバノ電圧を含むテキストファイルがあります。収集したフレームを観察するためにムービーを開きます。ビデオの分析に続いて、Matlabでビデオを開くことによって、組織サンプルの剛性と張力を測定する。ここで、プロット関数を使用して、トラップ位置の関数として界面位置をプロットする。次に、Matlab イージーフィットフリーツールボックスを使用して、データの線形適合を実行します。フィットの傾きの逆は、インターフェイス位置に対するトラップ位置の平均比率を提供します。この情報から、付属のテキスト プロトコルの方程式を使用して、剛性と張力の値を決定します。レーザートラップは、界面に垂直なサンプルの中弦波偏向を生成します。ここには、3 つの連続したインターフェイス位置として示されています。これは、映画として記録して、クライモグラフを生成し、さらに解析してサブピクセル解像度でインターフェイスの位置を決定することもできます。ここでは、期間は5秒でした。小さな変形のレジームでは、トラップとインターフェイスの位置は比例します。トラップの面差に対するインタフェースの偏向の振幅は、インタフェースの張力または剛性にアクセスできます。プルとリリースの実験の基本を次に示します。光トラップがオンになると、2つのセル間のインターフェースの中間点から約1マイクロメートル離れて、インターフェイスはトラップの位置に向かって偏向します。その後、トラップは、必要な時間が経過するとオフに切り替わります。結果のグラフは、マクスウェルのようなモデルのような仮説の実論理モデルと比較することができる。DOnは、赤外線レーザーを使用することは非常に危険であり、保護ゴーグルを着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行するときに取られるべきであることを忘れないでください。ここでは、胚の場合に対するティンクルピンセットからの最も頻繁なユーザーと、この方法は、他の母親システムなどにも使用できます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

ウサギモデルにおける最適胚期における低侵襲胚移植と胚ガラス化

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

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ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学

ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセットプローブ細胞力学