Name: probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por um FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (a P.-F.L.). Reconhecemos a infra-estrutura de França-BioImaging suportada pelo francês Agência Nacional de pesquisa (ANR-10-INBS-04-01, «Investimentos para o futuro»). Agradecemos a Brice Detailleur e Claude Moretti da infra-estrutura de PICSL-FBI para assistência técnica.

1. criar o microscópio de luz folha
<ol><li>Consulte a descrição da instalação anterior publicação25. Nota: A instalação é composta de uma fase de microscópio vertical e um módulo de folha de luz, produzindo uma folha de luz no plano horizontal. Uma excitação da lente objetiva de 10x direciona a folha de luz em uma cubeta de vidro (Figura 4). A deteção da lente objetiva tem um alto at (1.1), que é necessário para o eficiente tweezing (veja abaix...

<ol>
	<li>Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation,+transmission,+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis.">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li><li>Heisenberg, C. -. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues.">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), 186-196 (2016).</li><li>Camp&#224;s, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues.">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex.">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., R&#246;per, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation.">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883 (2017).</li><li>Camp&#224;s, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li><li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues.">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li><li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays.">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).</li><li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis.">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li><li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Bambardekar, K., Cl&#233;ment, R., Blanc, O., Chard&#232;s, C., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo.">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li><li>Cl&#233;ment, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis.">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li><li>Chard&#232;s, C., M&#233;n&#233;lec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development.">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).</li><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li><li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins.">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li></ol>

Pinça óptica permite realizar medições absolutas mecânicas diretamente no epitélio embrionário em desenvolvimento de forma não-invasiva. Nesse sentido, apresenta vantagens sobre outros métodos tais como a ablação a laser, que são invasivos e fornecem medidas relativas, forças magnéticas, que requerem injeções, ou forçar a inferência, que se baseia em suposições fortes e também fornecem relativo medições.
O protocolo inclui alguns passos críticos. Em primeiro lugar, como...

Desenvolvimento embrionário é um processo altamente reprodutível, durante o qual as células e os tecidos se deformam para moldar o futuro animal. Tais deformações foram mostradas para exigir a geração ativa de forças no celular nível1,2. Para compreender processos morfogenéticas, durante o qual as células e tecidos mudam a sua forma, é, portanto, chave para avaliar as propriedades mecânicas das células envolvidas e para medir as forças dentro do tecido durante o processo de3,4 . Epitelial, especialmente em Drosophila, têm sido amplamente estudados devido a sua geometria quase-2D e à sua fácil manipulação.
Um número de técnicas, portanto, foram desenvolvido por nós e outros para avaliar mecânica epitelial na vivo durante o desenvolvimento. Vamos dar uma rápida visão geral dos três principais técnicas usadas em tecidos epiteliais. Ablação a laser, um método amplamente usado, permite revelar o estresse mecânico local na célula junções5,6,7,8 ou em maior escala9,10,11 através da realização de cortes locais que interrompem a integridade mecânica do alvo. A dinâmica da abertura do corte a seguir fornece informações tanto na ablação prévia de stress e sobre a reologia do tecido12,13. Uma desvantagem da ablação a laser é que é invasivo, como exige a ruptura local do córtex celular. Daí, um só pode executar um número limitado de ablações se você quiser preservar a integridade do tecido. Outra desvantagem é que ablações só fornecem estimativas relativas da tensão em contatos de celular, desde que a velocidade de abertura depende de atrito viscoso, o que geralmente não é conhecido. Manipulação magnética também foi desenvolvida e usada em Drosophila, envolvendo o uso de Ferrofluidos14 ou lipossomas ultramagnetic15. Eles podem fornecer medições absolutas16,17, mas também são invasoras no sentido de que eles requerem a injeção de sondas no local desejado. Isto pode ser muito complicado dependendo do sistema, que não é sempre passível de injeções precisas. Uma terceira técnica, totalmente não-invasivo, é força inferência18,19,20. Força de inferência se baseia na suposição de equilíbrio mecânico em pontos triplos (fialoconídios entroncamentos ou vértices) e permite inferir as tensões em todos os celular contatos (e possivelmente, pressões em todas as células) por resolver um problema inverso. Para tensões, cada vértice fornece duas equações (X e Y). Isso resulta em um grande sistema de equações lineares que pode ser invertido sob algumas condições para avaliar a tensão em todos os contatos do celular. Enquanto este método é muito atraente, como não exige somente uma imagem segmentada e nenhuma experiência extra ou instalação, sua precisão é ainda a determinar, e novamente apenas fornece valores relativos, a menos que uma medida absoluta da calibração é executada.
Para superar algumas destas limitações, apresentamos neste artigo uma instalação da pinça óptica acoplado a um microscópio de luz folha aplicar forças controladas na escala celular no epitélio embrionário da Drosophila melanogaster. Pinça óptica têm sido utilizada para numerosas aplicações biológicas, incluindo as medições em proteínas simples e manipulação de células e organelas21. Aqui, nós relatamos as forças aplicadas na faixa de uns dúzia de pN, que é pequena, ainda suficientes para induzir deformações locais de contatos do celular e realizar medições mecânicas na vivo. Normalmente, usamos perpendicular deflexão de contatos do celular, monitorada através da análise de kymographs, para relacionar força-deformação. Importante, nossa configuração não exige a injeção de grânulos no local desejado no tecido, como Pinça óptica é capaz de exercer directamente forças nos contatos do celular. A atrelar a Pinça óptica para um microscópio de luz folha permite realizar imagens rápidas (vários quadros por segundo), que é muito sensível para uma análise mecânica em escalas de tempo curto e com reduzida fototoxicidade, desde a iluminação da amostra é limitada ao plano da imagem latente de22.
Globalmente, ópticas pinças são uma maneira não-invasiva para aplicar forças controladas em contatos do celular em in vivo, o embrião da drosófila e extrair informações mecânicas, tais como rigidez e tensão na célula contatos23, propriedades reológicas 24e gradiente ou anisotropia da tensão23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td>
			<td style="width:179px;">IPG Laser</td>
			<td style="width:179px;">YLM-10-LP-SC</td>
			<td style="width:591px;">including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">&#216;1/2&#34; Optical Beam Shutter</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">SH05</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Small Beam Diameter Galvanometer Systems</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GVS001</td>
			<td style="width:591px;">1 for X displacement, 1 for Y displacement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">1D or 2D Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GPS011</td>
			<td style="width:591px;">galvanometers power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">2 lenses f = 30mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1757-B</td>
			<td style="width:591px;">relay telescope between 2 galva</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 200mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1945-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 500mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1869-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">KCB1E</td>
			<td style="width:591px;">Periscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LG1</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">45&#176; AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror</td>
			<td style="width:179px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:179px;">#64-470</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Multiphoton-Emitter HC 750/S</td>
			<td style="width:179px;">AHF</td>
			<td style="width:179px;">HC 750/SP</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">CompactDAQ Chassis</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">cDAQ-9178</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Output Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9263</td>
			<td style="width:591px;">Analog output module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Input Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9215</td>
			<td style="width:591px;">Analog input module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &#181;m, red fluorescent (580/605), 2% solids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F8812</td>
			<td>calibration beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C++ (Qt) home made optical tweezers software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s. Alternative solution: labview</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo

Morfogênese requer a coordenação entre a padronização genética e forças mecânicas para robustamente moldar as células e tecidos. Portanto, um desafio para compreender processos morfogenéticas é diretamente medir forças celulares e propriedades mecânicas na vivo durante a embriogênese. Aqui, apresentamos uma instalação da pinça óptica acoplada a um microscópio de folha de luz, que permite aplicar diretamente as forças em contatos do celular do embrião da drosófila , enquanto imagens a uma velocidade de vários quadros por segundo. Esta técnica tem a vantagem que não exige a injeção de grânulos para o embrião, normalmente usado como sondas intermediárias no qual forças ópticas são exercidas. Nós detalhe passo a passo a execução da instalação e propor ferramentas para extrair informações mecânicas das experiências. Ao monitorar os deslocamentos de contatos do celular em tempo real, um pode executar medições de tensão e investigar a reologia dos contatos do celular.

A Figura 5 mostra os dados experimentais obtidos através da imposição de um movimento senoidal para a armadilha. A armadilha produz uma deflexão da interface, como exemplificado por 3 instantâneos mostrando 3 interface sucessivas posições (Figura 5A)23. Filmes gravados são usados para gerar um kymograph (Figura 5B) e ainda mais são analisados para determinar a posiç?...

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Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Apresentamos uma instalação da pinça óptica acoplada a um microscópio de folha de luz e a sua aplicação a sonda mecânica de células sem grânulos no embrião da drosófila .

Sondando a célula mecânica com pinça óptica de grânulo-livre no embrião da drosófila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na mecânica tecidual, como como as propriedades dos contatos celulares mudam no espaço e no tempo durante a morfogênese tecidual. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fracamente invasiva e é compatível com imagens vivas, como microscopia de folha de luz. Esta técnica não requer injeção de contas no tecido.Normalmente usado como sondas demiere em que para obter froses, eu estou animado. Demonstrando o processo estarão Chardes, um engenheiro, e Raphael Clement, cientista de pesquisa do meu nível de terreno. Para começar, configure um microscópio vertical para microscopia de folha de luz na planície horizontal, em seguida, prepare o laser e a óptica para agir como a pinça óptica.Em seguida, despoque um microcompógico de 500 contas fluorescentes de 500 nanômetros em uma cuvette de vidro, e adicione 10 mililitros de água destilada. Coloque a cuvette no suporte cuvette sob o objetivo, e ajuste o foco do objetivo para que o objetivo toque a superfície da água. Agora, abra o QT Creator ambiente de desenvolvimento integrado que é usado para controlar o software de aquisição.Abra o software de aquisição, abrindo o microRheo. perfil, e ativar o modo de aquisição ao vivo, selecionando ao vivo. Antes de ligar o laser, coloque os óculos de segurança, então, ajuste a potência do laser para um watt, e ligue o laser.A transmissão ao vivo deve agora mostrar uma conta presa no foco do laser. Se necessário, ajuste a posição da segunda lente do telescópio, para observar a conta em foco. Também é preciso ajustar o ângulo das manobras do periscópio para centralizar a conta na imagem.Prepare a placa de aquisição de dados e as conexões de meio-fio, conforme descrito na figura três do protocolo de texto que acompanha. Na interface do obturador óptico, ajuste o parâmetro de tempo aberto para 000.000, o parâmetro de tempo fechado para 000.000, o parâmetro do modo para único e o parâmetro de gatilho para EXT. Uma vez configurado, selecione o botão ativar.Em QT Creator, abra o ot. perfil para abrir o projeto. Altere o nome da entrada e saída em aogenerator.arquivo cpp para combinar com os cartões MI que foram usados em sua configuração. Por fim, compile e execute o software de pinça óptica. No software de aquisição, selecione o tempo de exposição desejado, o jogo, o tempo entre duas imagens, o número de imagens a serem adquiridas e o poder do laser.Em seguida, no software pinça óptica, defina o parâmetro pinça óptica, mostrado aqui, para traçar um círculo. Em seguida, verifique a caixa de parâmetros de IA, a caixa de peso para a frente e pressione o botão de pressionar o registro e, em seguida, inicie a aquisição da imagem. Ligue as pinças ópticas, selecione o botão gerador e permita que a conta presa complete pelo menos dois círculos completos, em seguida, pare a pinça óptica, deselecionando o botão gerador.Finalmente, pare a aquisição da imagem. Observe que um filme de tiff e um arquivo de texto com tensões galvanômetros são criados na pasta padrão. Abra o Matlab, vá para a pasta de calibração e execute a posição dois script de tensão O script calcula a função de interpolação, traduzindo tensões galvanômetros para posição de armadilha óptica.Em seguida, acompanhe o protocolo de texto que acompanha a configuração do filme de calibração. Verifique se o mapa de interpolação para as posições a laser X e Y são computados e exibidos corretamente pelo script. Verifique se há regiões brancas no mapa, que representam valores perdidos.Se houver áreas brancas significativas, repita a operação com um novo filme de calibração. O filme de calibração mostrado aqui representa um filme com dados adequados. Usando um pique, ou um pincel úmido, selecione cerca de 10 embriões no estágio desejado e alinhe-os.Em seguida, use uma caneta de marcação de diamante para cortar um pedaço do escorregador de vidro, para 10 por 20 por um milômetro. Adicione cola em um lado da peça de corte, e deixe secar por 20 segundos, depois vire a peça de corte e coloque-a na linha de embriões, colocando-a na borda do slide. Em seguida, instale a preparação no suporte da amostra e coloque o suporte no cuvette, em seguida, coloque a cuvette no estado piso-elétrico e encha-a com água.Para começar, encontre a localização do interesse e mova o ponto médio da junção do alvo para a posição da armadilha laser, usando o estágio do pisar. Coloque os parâmetros da armadilha para alcançar oscilações perpendiculares à linha de contato. Também definir as fases como zero, as amplitudes nas direções X e Y para ter um movimento perpendicular à linha de contato, e definir a amplitude para 0,1 volt.Agora, inicie a aquisição, usando uma taxa de quadros rápida, como 10 quadros por segundo. Uma vez iniciada a imagem, ligue as pinças ópticas pressionando o botão de pressão de go. Quando a imagem estiver completa, desligue a pinça e pare a aquisição de imagens.Na pasta especificada, haverá um filme e um arquivo de texto contendo as tensões galvanômetros durante a aquisição. Abra o filme para observar os quadros coletados. Após a análise do vídeo, meça a rigidez e tensão na amostra de tecido, abrindo o vídeo no Matlab.Aqui, use a função plot, para traçar a posição da interface em função da posição da armadilha. Em seguida, use a caixa de ferramentas sem ajuste fácil do Matlab para realizar um ajuste linear dos dados. O inverso da inclinação do ajuste fornece a razão média da posição da armadilha sobre a posição da interface.A partir dessas informações, use as equações no protocolo de texto que acompanha para determinar a rigidez e os valores de tensão. A armadilha laser produz um desvio sinusoidal da amostra, que é perpendicular à interface. mostrado aqui como três posições de interface sucessivas.Isso também pode ser gravado como filmes para gerar um climógrafo e são ainda analisados para determinar a posição da interface com resolução de sub-pixels. Aqui, o período foi de cinco segundos. No regime de pequenas deformações, as posições de armadilha e interface são proporcionais.A amplitude da deflexão da interface em relação à da armadilha dá acesso à tensão ou rigidez da interface. Mostrado aqui estão os fundamentos de um experimento de tração e liberação. Quando a armadilha óptica é ligada, aproximadamente a um micrômetro de distância do ponto médio da interface entre duas células, a interface desvia em direção à posição da armadilha.A armadilha é então desligada após o tempo desejado. O gráfico resultante pode ser comparado a modelos lógicos reais, como um modelo maxwell like. Não se esqueça que trabalhar com laser infravermelho pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de óculos de proteção, sempre devem ter sido tomadas ao realizar este procedimento.Aqui, com o usuário mais frequente de pinças de tilintar para as do embrião, o método também pode ser usado para outros sistemas maternos, como o

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