Name: probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

Эта работа была поддержана FRM Equipe Грант FRM DEQ20130326509, Agence Nationale де ла Recherche АНР-Blanc Грант, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (для P.-ф.л.). Мы признаем Франции-BioImaging инфраструктуры, поддержке французского национального исследования агентства (АНР-10-INBS-04-01, «Инвестиции в будущее»). Мы благодарим Брис Detailleur и Клод Moretti от PICSL-ФБР инфраструктуры для оказания технической помощи.

1. Создание Микроскоп свет лист
<ol><li>Обратитесь к описанию установки в предыдущей публикации25. Примечание: Установка состоит из вертикально микроскопа и легкие лист модуль производит легкие лист в горизонтальной плоскости. 10 X возбуждения объектива направляет свет лист ...

<ol>
	<li>Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation,+transmission,+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis.">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li><li>Heisenberg, C. -. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues.">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), 186-196 (2016).</li><li>Camp&#224;s, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues.">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis.">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li><li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling.">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling.">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li><li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bella&#239;che, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Etournay, R., Popovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex.">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., R&#246;per, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation.">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883 (2017).</li><li>Camp&#224;s, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li><li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues.">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li><li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays.">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).</li><li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis.">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li><li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellFIT:+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries.">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+optical+forces.">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Bambardekar, K., Cl&#233;ment, R., Blanc, O., Chard&#232;s, C., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo.">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li><li>Cl&#233;ment, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis.">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li><li>Chard&#232;s, C., M&#233;n&#233;lec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development.">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).</li><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li><li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins.">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li></ol>

Оптический пинцет позволяют выполнять абсолютной механические измерения непосредственно в эпителии развивающихся зародышевых неинвазивным способом. В этом смысле он представляет преимущества перед другими методами, например лазерной абляции, которые являются инвазивными и предос?...

Эмбриональное развитие является весьма воспроизводимый процесс, во время которой клетки и ткани деформировать формировать будущее животного. Показано, что таких деформаций, требуют активного поколения сил на уровне ячейки уровня1,2. Чтобы понять морфогенетических процессов, во время которых клетки и ткани изменить их форму, это поэтому ключ для оценки механических свойств клеток, участвующих и для измерения силы внутри ткани во время процесса3,4 . Эпителиального слоя, особенно у дрозофилы, были широко изучены вследствие их квази 2D геометрии и их легко манипулировать.
Ряд методов были разработаны таким образом, нас и другие оценки эпителиальных механики в vivo во время разработки. Мы дадим краткий обзор трех основных методов, используемых в эпителиальных тканях. Лазерная абляция, широко используемый метод, позволяет выявить местные механических напряжений в ячейку развязок5,6,,78 или в более крупных масштабах9,10,11 , выполняя местных сокращений, которые нарушают механическую целостность целевого объекта. Динамика открытия после разреза предоставляет информацию как на абляции предварительного напряжения, так и на реологические свойства ткани12,13. Недостатком лазерной абляции является, что это инвазивными, как это требует местной нарушение клетки коры. Следовательно один можно выполнять только ограниченное количество аблаций если один хочет, чтобы сохранить целостность ткани. Еще одним недостатком является аблаций только обеспечить относительной оценки напряженности в ячейку контакты, так как скорость открытия зависит вязкого трения, которые как правило не известна. Магнитные манипуляции также разработана и используется в дрозофилы, с участием либо использование магнитных жидкостей14 или15ultramagnetic липосом. Они могут обеспечить абсолютные измерения16,17, но также инвазивные в том смысле, что они требуют введения зонды в нужное место. Это может быть очень сложно, в зависимости от системы, которая не всегда поддаются точной инъекции. Третий метод, полностью неинвазивным,-силы вывод18,19,20. Вывод сил основывается на предположении о механических равновесия в три раза больше очков (tricellular развязок, или вершин) и позволяет вывести напряженности на всех ячеек контактов (и, возможно, давление во всех клетках), решения обратной задачи. Для напряженности каждая вершина предоставляет два уравнения (X и Y). Это дает большой системы линейных уравнений, которые могут быть инвертированы при некоторых условиях оценить напряжение на всех клеток контактов. Хотя этот метод является очень привлекательным, поскольку он требует только сегментирована изображения и без дополнительных эксперимент или установки, ее точность еще определить, и снова он предоставляет только относительные значения, если измерение абсолютной калибровки.
Чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, мы представляем в этой статье установки Оптический пинцет в сочетании с микроскопом света лист применять контролируемых силами в масштабе ячеек в эпителии эмбриональных Drosophila melanogaster. Оптический пинцет были использованы для многочисленных биологических приложений, включая измерения на одном белков и манипуляции органеллы и клетки21. Здесь, мы приводим прикладной силы в диапазоне от нескольких десятков pN, который является небольшим еще достаточно, чтобы побудить местные деформации клетки контактов и выполнить механические измерения в естественных условиях. Как правило мы используем перпендикулярно прогиб клеток контактов, через анализ kymographs, контроль за относиться силы к деформации. Важно отметить, что наши установки не требует инъекции бусы на нужное место в ткани, как Оптический пинцет способны непосредственно оказывают силы на ячейке контактов. Муфта Оптический пинцет для Микроскоп свет листа позволяет выполнять быстрое изображений (несколько кадров в секунду), который является очень заметны для механического анализа на короткое время весы и с сокращением Фототоксичность, поскольку освещение Образец является ограниченной плоскости изображения22.
В целом, оптические пинцеты являются неинвазивный способ применить контролируемых силами в ячейку контакты in vivo в зародыша дрозофилы и для извлечения механических информации например, жесткость и напряженности в ячейку контакты23, реологические свойства 24и градиент или анизотропии напряженности23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td>
			<td style="width:179px;">IPG Laser</td>
			<td style="width:179px;">YLM-10-LP-SC</td>
			<td style="width:591px;">including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">&#216;1/2&#34; Optical Beam Shutter</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">SH05</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Small Beam Diameter Galvanometer Systems</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GVS001</td>
			<td style="width:591px;">1 for X displacement, 1 for Y displacement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">1D or 2D Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GPS011</td>
			<td style="width:591px;">galvanometers power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">2 lenses f = 30mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1757-B</td>
			<td style="width:591px;">relay telescope between 2 galva</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 200mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1945-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 500mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1869-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">KCB1E</td>
			<td style="width:591px;">Periscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LG1</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">45&#176; AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror</td>
			<td style="width:179px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:179px;">#64-470</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Multiphoton-Emitter HC 750/S</td>
			<td style="width:179px;">AHF</td>
			<td style="width:179px;">HC 750/SP</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">CompactDAQ Chassis</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">cDAQ-9178</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Output Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9263</td>
			<td style="width:591px;">Analog output module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Input Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9215</td>
			<td style="width:591px;">Analog input module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &#181;m, red fluorescent (580/605), 2% solids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F8812</td>
			<td>calibration beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C++ (Qt) home made optical tweezers software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s. Alternative solution: labview</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo

Морфогенез требует координации между генетическими кучность и механических сил надежно формировать клеток и тканей. Таким образом чтобы понять морфогенетических процессов задача непосредственно измерить сотовой сил и механических свойств в vivo во время эмбриогенеза. Здесь мы представляем установки Оптический пинцет, в сочетании с микроскопом света лист, который позволяет непосредственно применять силы на ячейке контактов раннего зародыша дрозофилы , хотя изображений со скоростью несколько кадров в секунду. Этот метод имеет то преимущество, что она не требует инъекции бусины в эмбрион, обычно используются как промежуточные зондов, на которые оказывается оптической силы. Мы подробно, шаг за шагом, осуществление установки и предложить инструменты для извлечения механических информации из экспериментов. Путем мониторинга перемещения ячеек контактов в режиме реального времени, можно выполнить измерения напряженности и исследовать ячейку контакты реологии.

Рисунок 5 показывает экспериментальных данных, полученных путем введения синусоидальные движения в ловушку. Ловушка производит отклонения интерфейса, что подтверждается 3 снимки, показаны 3 последовательных интерфейса позиции (Рисунок 5A</st...

Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Мы представляем установки Оптический пинцет, в сочетании с микроскопом света лист и ее осуществление зонда клеток механика без бисера в зародыша дрозофилы .

Проверка ячейки механики с шарик бесплатно Оптический пинцет в зародыша дрозофилы

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в механике тканей, такие как, как свойства контактов клеток меняются в пространстве и времени во время морфогенеза тканей. Основным преимуществом этой техники является то, что она слабо инвазивна и совместима с живыми изображениями, такими как микроскопия светового листа. Этот метод не требует инъекции бисера в ткани.Обычно используется в качестве demiere зондов, на которых, чтобы получить froses, я взволнован. Демонстрация процесса будет Шардес, инженер, и Рафаэль Клемент, научный сотрудник из моего уровня местности. Для начала установите вертикальный микроскоп для микроскопии светового листа в горизонтальной равнине, а затем подготовьте лазер и оптику в качестве оптического пинцета.Далее, труба из одного микро-литра 500 нанометровых флуоресцентных бусин в стеклянный кювет, и добавить 10 миллилитров дистиллированной воды. Поместите кювет в держатель кюветта под цель, и отрегулируйте фокус цели так, чтобы цель касался поверхности воды. Теперь откройте Интегрированную среду разработки qT Creator, которая используется для управления программным обеспечением для приобретения.Откройте программное обеспечение для приобретения, открыв microRheo. профиль, и включите режим живого приобретения, выбрав жить. Перед включением лазера на надеть защитные очки, затем отрегулировать мощность лазера до одного ватта и включить лазер.Прямая лента теперь должна показывать бисер, захваченный в центре внимания лазера. При необходимости отрегулируйте положение второго объектива телескопа, чтобы наблюдать за шариком в фокусе. Возможно, также потребуется настроить угол перископных маневров, чтобы центр бисера на изображении.Подготовь доску по сбору данных и соединения бордюров, как описано на рисунке 3 сопроводительного текстового протокола. На оптическом интерфейсе затвора отрегулируйте параметр открытой сек времени до 000.000, параметр времени закрытой сек до 000.000, параметр режима до одного и параметр триггера к EXT. После настройки выберите кнопку включения.В КТ Творца, откройте OT. профиль, чтобы открыть проект. Измените название ввода и вывода в аогенераторе.cpp файл, чтобы соответствовать MI карты, которые были использованы в вашей настройки. Наконец, компилировать и запускать программное обеспечение оптических пинцетов. В программном обеспечении приобретения, выбрать желаемое время экспозиции, игра, время между двумя изображениями, количество изображений, которые будут приобретены, и мощность лазера.Затем, в программном обеспечении оптических пинцетов, установите параметр оптического пинцета, показанный здесь, чтобы проследить круг. Затем проверьте коробку параметров ИИ, коробку с перевесом и нажмите кнопку записи, а затем начните получение изображения. Включите оптический пинцет, выберите генерирующей кнопки, и позволить захваченных шарик для завершения по крайней мере два полных круга, а затем остановить оптический пинцет, путем неизбирания генерирующей кнопки.Наконец, прекратите приобретение изображения. Обратите внимание, что в папке по умолчанию создаются фильм tiff и текстовый файл с гальванометром напряжения. Откройте Matlab, перейдите в папку калибровки и запустите два сценария напряжения Скрипт вычисляет функцию интерполяции, переводя гальванометровые напряжения в положение оптической ловушки.Затем следуйте сопроводительному текстовому протоколу для настройки фильма калибровки. Проверьте, вычисляется ли карта интерполяции для лазерных позиций X и Y по сценарию. Проверьте наличие белых регионов на карте, которые представляют недостающие значения.При значительных белых областях повторите операцию с помощью нового фильма калибровки. Показанный здесь фильм калибровки представляет собой фильм с адекватными данными. Используя щуку или влажную щетку, выберите около 10 эмбрионов на нужном этапе и выровняйте их.Затем используйте бриллиантовую маркировку пера, чтобы вырезать кусок стеклянной горки, до 10 на 20 на один милометр. Добавить клей на одной стороне вырезать кусок, и дайте ему высохнуть в течение 20 секунд, затем поверните разрез кусок более, и поместите его на линии эмбрионов, приклеив его на краю слайда. Затем установите препарат в держатель образца, и поместите держатель в кюветт, затем поместите кювет на пизо-электрическое состояние, и заполнить его водой.Для начала найдите место интереса и переместите середину узла цели в положение лазерной ловушки, используя этап пизар. Установите параметры ловушки для достижения колебаний перпендикулярно линии соприкосновения. Также установите фазы как нулевые, амплитуды в направлениях X и Y, чтобы иметь движение перпендикулярно линии соприкосновения, и установить амплитуду до 0,1 вольт.Теперь начните приобретение, используя быструю частоту кадров, например 10 кадров в секунду. Как только изображение началось, включите оптический пинцет, нажав кнопку "Гоу". Когда изображение будет завершено, выключите пинцет и прекратите получение изображения.В указанной папке будет фильм и текстовый файл, содержащий гальванометровые напряжения во время приобретения. Откройте фильм для наблюдения за собранными кадрами. После анализа видео, измерить жесткость и напряжение в образце ткани, открыв видео в Matlab.Здесь используйте функцию сюжета, чтобы построить положение интерфейса как функцию положения ловушки. Затем используйте Matlab легко подходят свободный набор инструментов для выполнения линейной подгонки данных. Обратная часть наклона подгонки обеспечивает среднее соотношение положения ловушки над положением интерфейса.Из этой информации используйте уравнения в сопроводительном текстовом протоколе для определения жесткости и значений напряжения. Лазерная ловушка производит синуситное отклонение образца, то есть перпендикулярно интерфейсу. показано здесь в качестве трех последовательных позиций интерфейса.Это также может быть записано как фильмы для создания климографа и дополнительно проанализированы, чтобы определить положение интерфейса с суб-пиксельным разрешением. Здесь период составил пять секунд. В режиме малых деформаций положение ловушки и интерфейса пропорционально.Амплитуда отклонения интерфейса относительно того, что из ловушки дает доступ к интерфейсу напряженности или жесткости. Здесь показаны основы эксперимента по вытягивать и выпускать. Когда оптическая ловушка включена, примерно в одном микрометре от середины интерфейса между двумя ячейками, интерфейс отклоняется к положению ловушки.Ловушка затем выключается после желаемого количества времени. Полученный график можно сравнить с гипотетизированными реальными логическими моделями, такими как модель Максвелла. DOn't забыть, что работа с инфракрасным лазером может быть чрезвычайно опасным, и меры предосторожности, такие как ношение защитных очков, должны всегда были приняты при выполнении этой процедуры.Здесь, с наиболее частым пользователем из звона пинцет для тех из эмбриона, метод также может быть использован для других материнских систем, таких как

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Имплантация в данио рерио эмбрионов

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Визуализация субклеточных структур в эмбрионе данио Living

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM и микрореологию в ячейке желток Zebrafish эмбриона

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

После эндокарда ткани движения через ячейки Photoconversion в Zebrafish эмбриона

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Малоинвазивный перенос эмбрионов и Витрификация эмбрионов на оптимальном этапе развития эмбриона в кроличьей модели

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Микроинъекции системы в Vivo имплантации эмбриона кардиомиоцитов птичьего эмбриона

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...