Name: probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por un FRM Equipe beca FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche de ANR-Blanc de Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (al P.-F.L.). Reconocemos Francia-Bioimagen infraestructura apoyado por el francés Agencia Nacional de investigación (ANR-10-INBS-04-01, «Las inversiones para el futuro»). Agradecemos a Brice Detailleur y Claude Moretti de la infraestructura de PICSL-FBI para asistencia técnica.

1. establecer el microscopio de luz hoja
<ol><li>Consulte la descripción de la configuración de publicación anterior25. Nota: La configuración se compone de una etapa de microscopio vertical y un módulo de ficha técnica de iluminación produciendo una ficha técnica de iluminación en el plano horizontal. 10 X objetivo de excitación dirige la ficha técnica de iluminación en una cubeta de vidrio (figura 4). El objetivo de detección tiene una alta NA (1.1...

<ol>
	<li>Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation,+transmission,+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis.">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li><li>Heisenberg, C. -. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues.">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), 186-196 (2016).</li><li>Camp&#224;s, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues.">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis.">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li><li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling.">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling.">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li><li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bella&#239;che, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Etournay, R., Popovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex.">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., R&#246;per, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation.">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883 (2017).</li><li>Camp&#224;s, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li><li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues.">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li><li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays.">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).</li><li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis.">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li><li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellFIT:+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries.">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+optical+forces.">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Bambardekar, K., Cl&#233;ment, R., Blanc, O., Chard&#232;s, C., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo.">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li><li>Cl&#233;ment, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis.">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li><li>Chard&#232;s, C., M&#233;n&#233;lec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development.">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).</li><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li><li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins.">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li></ol>

Pinzas ópticas permiten para realizar mediciones mecánicas absolutas directamente en el epitelio embrionario en desarrollo de una manera no invasiva. En ese sentido, presenta ventajas sobre otros métodos como la ablación del laser, que son invasivos y proporcionan mediciones relativas, fuerzas magnéticas, que requieren inyecciones, o fuerza de inferencia, que se basa en suposiciones fuertes y también proporcionan relativa mediciones.
El protocolo incluye algunos pasos críticos. En prime...

Desarrollo embrionario es un proceso altamente reproducible durante el cual las células y los tejidos se deforman para dar forma a los futuros animales. Tales deformaciones han demostrado requerir la generación activa de las fuerzas de la célula nivel1,2. Para entender procesos morfogenéticos durante el cual las células y los tejidos cambian su forma, por lo tanto es clave para evaluar las propiedades mecánicas de las células involucradas y para medir las fuerzas dentro del tejido durante el proceso3,4 . Capas epiteliales, especialmente en Drosophila, se han estudiado ampliamente debido a su geometría de quasi-2D y a su fácil manipulación.
Así, un número de técnicas ha sido desarrollado por nosotros y otros para evaluar mecánica epitelial en vivo durante el desarrollo. Daremos un repaso rápido de las tres principales técnicas utilizadas en los tejidos epiteliales. Ablación con láser, un método ampliamente utilizado, permite revelar la tensión mecánica local en célula ensambladuras5,6,7,8 o en mayor escala9,10,11 mediante la realización de cortes locales que alteran la integridad mecánica del objetivo. La dinámica de la apertura tras el corte proporciona información sobre la ablación previa de estrés tanto en la reología del tejido12,13. Un inconveniente de la ablación láser es que es invasiva, ya que requiere la interrupción local de la corteza de la célula. Por lo tanto, sólo uno puede realizar un número limitado de ablaciones, si quiere preservar la integridad del tejido. Otro inconveniente es que ablaciones sólo proporcionan estimaciones relativas de la tensión en los contactos del celular, ya que la velocidad de apertura depende de la fricción viscosa, que generalmente no se conoce. Manipulación magnética también ha desarrollado y utilizado en Drosophila, que implican el uso de ferrofluidos14 o liposomas ultramagnetic15. Puede proporcionar medidas absolutas16,17, pero también son invasoras en el sentido que requieren la inyección de las puntas de prueba en el lugar deseado. Esto puede ser muy complicado dependiendo del sistema, que no siempre es sensible a las inyecciones precisas. Una tercera técnica, completamente no-invasivo, es fuerza de inferencia18,19,20. Fuerza de inferencia se basa en la suposición de equilibrio mecánico en puntos triples (tricellular nudos o vértices) y permite para deducir las tensiones en todo célula contactos (y posiblemente, las presiones en todas las células) por resolver un problema inverso. Para las tensiones, cada vértice proporciona dos ecuaciones (X e Y). Esto produce un gran sistema de ecuaciones lineales que puede ser invertida bajo ciertas condiciones para evaluar la tensión en todos los contactos de la célula. Mientras que este método es muy atractivo, ya que sólo no requiere una imagen segmentada y experimento adicional o configuración, su exactitud está aún por determinar, y otra vez sólo proporciona valores relativos, a menos que una medida de calibración absoluta se realiza.
Para superar algunas de estas limitaciones, presentamos en este artículo la configuración de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación a aplicar fuerzas controladas a escala celular en el epitelio embrionario de Drosophila melanogaster. Pinza óptica se han utilizado para numerosas aplicaciones biológicas incluyendo las mediciones de proteínas solo y la manipulación de células y organelos21. Aquí, Divulgamos a fuerzas aplicadas en la gama de algunos docena pN, que es pequeño pero suficiente para inducir deformaciones locales de contacto y realizar mediciones mecánicas en vivo. Por lo general, utilizamos desviación perpendicular de contacto, monitoreados a través del análisis de kymographs, relacionarse con fuerza a la deformación. Lo importante, nuestro programa de instalación no requiere la inyección de granos en el lugar deseado en el tejido, pinzas ópticas son capaces de ejercer directamente las fuerzas en los contactos célula-célula. El acoplamiento de las pinzas ópticas para un microscopio de luz hoja permite realizar rápida proyección de imagen (varios fotogramas por segundo), que es muy apreciable para un análisis mecánico en escalas de tiempo corto y con menor fototoxicidad, desde la iluminación de la muestra se limita al plano de proyección de imagen22.
Pinzas en generales, ópticas son una forma no invasiva para aplicar fuerzas controladas en contacto in vivo en el embrión de Drosophila y extraer información mecánica como rigidez y tensión en celular contactos23, propiedades reológicas 24y gradiente o anisotropía de tensión23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td>
			<td style="width:179px;">IPG Laser</td>
			<td style="width:179px;">YLM-10-LP-SC</td>
			<td style="width:591px;">including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">&#216;1/2&#34; Optical Beam Shutter</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">SH05</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Small Beam Diameter Galvanometer Systems</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GVS001</td>
			<td style="width:591px;">1 for X displacement, 1 for Y displacement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">1D or 2D Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GPS011</td>
			<td style="width:591px;">galvanometers power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">2 lenses f = 30mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1757-B</td>
			<td style="width:591px;">relay telescope between 2 galva</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 200mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1945-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 500mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1869-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">KCB1E</td>
			<td style="width:591px;">Periscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LG1</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">45&#176; AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror</td>
			<td style="width:179px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:179px;">#64-470</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Multiphoton-Emitter HC 750/S</td>
			<td style="width:179px;">AHF</td>
			<td style="width:179px;">HC 750/SP</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">CompactDAQ Chassis</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">cDAQ-9178</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Output Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9263</td>
			<td style="width:591px;">Analog output module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Input Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9215</td>
			<td style="width:591px;">Analog input module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &#181;m, red fluorescent (580/605), 2% solids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F8812</td>
			<td>calibration beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C++ (Qt) home made optical tweezers software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s. Alternative solution: labview</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo

Morfogénesis requiere coordinación entre patrones genéticos y las fuerzas mecánicas a robusta forma de las células y los tejidos. Por lo tanto, es un reto entender procesos morfogenéticos directamente medir fuerzas celulares y propiedades mecánicas en vivo durante la embriogénesis. Aquí, presentamos un programa de instalación de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación, que permite para aplicar directamente las fuerzas en los contactos de la célula del embrión temprano de Drosophila , mientras que la proyección de imagen a una velocidad de varios fotogramas por segundo. Esta técnica tiene la ventaja que no requiere la inyección de granos en el embrión, generalmente utilizado como sondas intermedias en el cual se ejercen las fuerzas ópticas. Detalle paso a paso la aplicación de la configuración y proponer herramientas para extraer información mecánica de los experimentos. Mediante el control de los desplazamientos de los contactos de la célula en tiempo real, uno puede realizar mediciones de tensión e investigar la reología de los contactos de la célula.

La figura 5 muestra los datos experimentales obtenidos mediante la imposición de un movimiento sinusoidal a la trampa. La trampa produce una desviación de la interfaz, como por las 3 instantáneas que muestran 3 interfaz sucesivas posiciones (figura 5A)23. Películas grabadas se utilizan para generar un kymograph (figura 5B) y además se analizan para determinar la posición...

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Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Presentamos una instalación de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación y su aplicación a la punta de prueba mecánica de la célula sin cuentas en el embrión de Drosophila .

Sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de Drosophila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la mecánica de tejido, como cómo las propiedades de los contactos celulares cambian en el espacio y el tiempo durante la morfogénesis tisular. La principal ventaja de esta técnica es que es débilmente invasiva y es compatible con imágenes en vivo como la microscopía de láminas de luz. Esta técnica no requiere la inyección de perlas en el tejido.Usualmente se utilizan como sondas demiere en las que conseguir asos, estoy emocionado. Demostrando el proceso estarán Chardes, un ingeniero, y Raphael Clement, científico de investigación de mi nivel de terreno. Para comenzar, configure un microscopio vertical para la microscopía de lámina de luz en la llanura horizontal, luego prepare el láser y la óptica para que actúen como pinzas ópticas.A continuación, canaliza un micro litro de cuentas fluorescentes de 500 nanómetros en una cubeta de vidrio, y agrega 10 mililitros de agua destilada. Coloque la cubeta en el soporte de la cubeta bajo el objetivo, y ajuste el enfoque del objetivo para que el objetivo toque la superficie del agua. Ahora, abra el entorno de desarrollo integrado QT Creator que se utiliza para controlar el software de adquisición.Abra el software de adquisición abriendo el microRheo. perfil, y activar el modo de adquisición en vivo, seleccionando en vivo. Antes de encender el láser, encienda las gafas de seguridad, luego, ajuste la potencia del láser a un vatio y encienda el láser.La transmisión en vivo ahora debe mostrar una perla atrapada en el foco del láser. Si es necesario, ajuste la posición de la segunda lente del telescopio para observar el cordón en el foco. También es posible que deba ajustar el ángulo de las maniobras del periscopio para centrar el cordón en la imagen.Prepare la placa de adquisición de datos y las conexiones de bordillo, como se describe en la figura tres del protocolo de texto adjunto. En la interfaz del obturador óptico, ajuste el parámetro de seg de apertura de tiempo a 000.000, el parámetro de segundo de tiempo cerrado a 000.000, el parámetro de modo a solo y el parámetro de disparador a EXT. Una vez configurado, seleccione el botón de activación.En QT Creator, abra el ot. perfil para abrir el proyecto. Cambie el nombre de la entrada y la salida en el generador.cpp para hacer juego las tarjetas MI que fueron utilizadas en su configuración. Por último, compile y ejecute el software de pinzas ópticas. En el software de adquisición, seleccione el tiempo de exposición deseado, el juego, el tiempo entre dos imágenes, el número de imágenes a adquirir y la potencia del láser.A continuación, en el software de pinzas ópticas, configure el parámetro de pinzas ópticas, que se muestra aquí, para trazar un círculo. A continuación, marque la casilla Parámetros de IA, la casilla de peso hacia delante, presione el botón de registro y, a continuación, inicie la adquisición de la imagen. Encienda las pinzas ópticas, seleccione el botón de generación y permita que el cordón atrapado complete al menos dos círculos completos, luego detenga las pinzas ópticas, anulando la selección del botón de generación.Por último, detenga la adquisición de imágenes. Tenga en cuenta que en la carpeta predeterminada se crean una película tiff y un archivo de texto con voltajes galvanómetros. Abra Matlab, vaya a la carpeta de calibración y ejecute el script de posición dos tensional El script calcula la función de interpolación, traduciendo voltajes galvanómetros a la posición de trampa óptica.A continuación, siga el protocolo de texto adjunto para configurar la película de calibración. Compruebe si el script calcula y muestra correctamente el mapa de interpolación para las posiciones del láser X e Y. Compruebe si hay regiones blancas en el mapa, que representan valores que faltan.Si hay áreas blancas significativas, repita la operación con una nueva película de calibración. La película de calibración que se muestra aquí representa una película con datos adecuados. Usando un lucio, o un cepillo húmedo, seleccione unos 10 embriones en la etapa deseada y alinee.A continuación, utilice una pluma de marcado de diamante para cortar una pieza de la diapositiva de vidrio, a 10 por 20 por un milómetro. Agregue pegamento en un lado de la pieza cortada, y déjela secar durante 20 segundos, luego gire la pieza cortada y colóquela en la línea de embriones, pegándola en el borde de la diapositiva. A continuación, instale la preparación en el portacuchillas y coloque el soporte en la cubeta, luego coloque la cubeta en el estado eléctrico y llénelo con agua.Para comenzar, busque la ubicación de interés y mueva el punto medio de la unión objetivo a la posición de la trampa láser, utilizando la etapa pisar. Establezca los parámetros del reventado para lograr oscilaciones perpendiculares a la línea de contacto. Establezca también las fases como cero, las amplitudes en las direcciones X e Y para tener un movimiento perpendicular a la línea de contacto y establezca la amplitud en 0,1 voltios.Ahora, comience la adquisición, utilizando una velocidad de fotogramas rápida, como 10 fotogramas por segundo. Una vez que la imagen haya comenzado, encienda las pinzas ópticas pulsando el botón ir. Cuando la imagen esté completa, apague las pinzas y detenga la adquisición de imágenes.En la carpeta especificada, habrá una película y un archivo de texto que contiene los voltajes del galvanómetro durante la adquisición. Abra la película para observar los fotogramas recopilados. Tras el análisis del vídeo, mida la rigidez y la tensión en la muestra de tejido, abriendo el vídeo en Matlab.Aquí, utilice la función de trazado para trazar la posición de la interfaz en función de la posición del reventado. A continuación, utilice la caja de herramientas libre de ajuste fácil de Matlab para realizar un ajuste lineal de los datos. El inverso de la pendiente del ajuste, proporciona la relación media de la posición del reventado sobre la posición de la interfaz.A partir de esta información, utilice las ecuaciones del protocolo de texto adjunto para determinar la rigidez y los valores de tensión. La trampa láser produce una desviación sinusoidal de la muestra, que es perpendicular a la interfaz. se muestra aquí como tres posiciones de interfaz sucesivas.Esto también se puede grabar como películas para generar un climograma y se analizan más a fondo para determinar la posición de la interfaz con resolución de subpíxeles. Aquí, el período fue de cinco segundos. En el régimen de pequeñas deformaciones, las posiciones de trampa e interfaz son proporcionales.La amplitud de la desviación de la interfaz en relación con la de la trampa da acceso a la tensión o rigidez de la interfaz. Aquí se muestran los conceptos básicos de un experimento de extracción y liberación. Cuando se enciende la trampa óptica, aproximadamente un micrómetro lejos del punto medio de la interfaz entre dos células, la interfaz se desvía hacia la posición del desvío.La trampa se apaga después de la cantidad de tiempo deseada. El gráfico resultante se puede comparar con modelos lógicos reales hipotéticos, como un modelo similar a Maxwell. DOn't forget that working with infrared laser can be extremely hazardous, and precautions such as wearing protective goggles, should have always taken taken al realizar este procedimiento.Aquí, con el usuario más frecuente de pinzas de tintineo para las del embrión, el método también se puede utilizar para otros sistemas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

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Investigación

Biología del Desarrollo

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