Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

مكتب البيولوجية، والبحوث البيئية ودعم البحوث في مركز رنل للبيولوجيا الجزيئية الهيكلية (كسمب) والحيوية-بلا استخدام مرافق دعم "شعبة المرافق المستخدم العلمي"، "مكتب العلوم الأساسية في الطاقة"، و "الإدارة الأميركية" للطاقة. حظي بدعم الأعمال الإنشائية على بروتينات الغشاء في مختبر ليبرمان من المعاهد الوطنية للصحة (DK091357، GM095638) وجبهة الخلاص الوطني (0845445).

1-إعداد وتقديم مرفق النيوترون شعاع الوقت والصك المقترح
<ol><li>استشارة على شبكة الإنترنت لتحديد مرافق تشتت النيوترونات التي توفر وصول المستخدم العامة النيوتروني شعاع الوقت، مثل أوك ريدج الوطني المختبرات (رنل). خريطة النيوترون التسهيلات والمعلومات حول النيوترونات البحوث في جميع أنحاء العا?...

البيولوجيا الهيكلية الباحثين الاستفادة من التقنيات الهيكلية التكميلية مثل نثر الحل للحصول على تفاصيل البيوكيميائية والهيكلية (مثل الشكل والحجم الكلي) من الجزيئات الحيوية في الحل. بلا أسلوب جاذبية خاصة لتحديد هياكل منخفضة الدقة من بروتينات الغشاء، وتركيز أساسية لعلم الأحياء الهيكلية ال...

بروتينات الغشاء تم ترميزها بما يقدر 30 في المائة من جميع الجينات1 وتمثل أغلبية قوية من أهداف للعقاقير الطبية الحديثة. 2 هذه البروتينات تنفيذ مجموعة واسعة من المهام الحيوية الخلوية،3 ولكن على الرغم من وفرة، وأهمية – لا تمثل سوى حوالي 1 في المائة من مجموع هياكل أودعت في "سيقتضي البحوث" للبروتين الهيكلي المعلوماتية الحيوية (ركسب) بنك البيانات. 4 نظراً لطبيعتها مسعور جزئيا، وقد تم التصميم الهيكلي للبروتينات الغشاء زمنياً صعبة جداً. 5 , 6 , 7
كما يتطلب العديد من التقنيات الفيزيائية الحيوية الجزيئات مونوديسبيرسي في حل للقياس، عزل البروتينات الغشاء من الأغشية الأصلية واستقرار هذه البروتينات في تقليد القابلة لذوبان في الأغشية الأصلية كانت منطقة نشطة للبحث في الآونة الأخيرة العقود. 8 , 9 , 10 هذه التحقيقات أدت إلى تطوير العديد من التجميعات amphiphilic رواية لجعل البروتينات الغشاء، مثل نانوديسكس،11،،من1213 بيسيليس،14،15 وأمفيبولس. 16 , 17 ومع ذلك، استخدام المنظفات المذيلات تظل واحدة من الأساليب الأكثر شيوعاً ووضوحاً لتلبية متطلبات القابلية للذوبان بروتين معين. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 للأسف، لا واحد المنظفات أو السحر مزيج من المنظفات القائم حاليا الذي يفي بجميع بروتينات الغشاء؛ وبالتالي، يجب فحص هذه الشروط تجريبيا للمتطلبات الفريدة لكل البروتين. 26 , 27
الذاتي تجميع المنظفات في الحل أعلاه تركزها مذيل حرجة لتشكيل هياكل تجميعية تسمى المذيلات. المذيلات تتكون من العديد من مونومرات المنظفات (تتراوح عادة ما بين 20-200) مع سلاسل الألكيل مسعور تشكيل نواة مذيل ومجموعات رأسه ماء مرتبة في طبقة شل مذيل تواجه المذيب مائي. قد سلوك المنظفات وتشكيل مذيل كلاسيكي وصف تشارلز تانفورد في تأثير مسعور،28 والأحجام وأشكال المذيلات من المنظفات المستخدمة عادة في غشاء بروتين الدراسات ووصف استخدام تشتت الزاوية الصغير. 29 , ودرست أيضا 30 منظمة المنظفات حول بروتينات الغشاء، ومن المتوقع تشكيل مجمعات البروتين-المنظفات (PDCs) مع المنظفات الجزيئات المحيطة البروتين في ترتيب يشبه المنظفات أنيق المذيلات. 31
وأضاف أحد هو ميزة في استخدام المنظفات يمكن التلاعب بخصائص مذيل الناتجة بإدراج مواد التنظيف الأخرى. يحمل العديد من المنظفات خلط مثالية، واختر خصائص من المذيلات المختلطة قد حتى يمكن التنبؤ بها من مكونات ونسبة الاختلاط. 22 ولكن وجود المنظفات يمكن لا تزال تحديات للخصائص الفيزيائية بالمساهمة في الإشارة الإجمالية. على سبيل المثال، إشارة من المنظفات في PDC مع الأشعة السينية وتقنيات تشتت الضوء، لا يمكن تمييزها تقريبا من البروتين. 32 التحقيقات مع واحد-الجسيمات cryo-إلكترون مجهرية (cryo-م) تعتمد عادة على المحاصرين جزيئات (المجمدة)؛ تفاصيل الهيكلية من البروتين هي لا تزال تحجب بعض المنظفات أو تركيزات عالية من المنظفات التي تضيف إلى الخلفية. 33 نهج بديل نحو تفسير هيكل PDC كاملة (بما في ذلك مواد التنظيف) قد بذلت من خلال الطرق الحسابية التي تسعى إلى إعادة بناء المنظفات حول بروتين غشاء معين. 34
في حالة تشتت النيوترونات، تنتج ترتيب الأساسية-شل المنظفات في مذيل عامل نموذج الذي يسهم في تشتت ملاحظتها. لحسن الحظ، يمكن تغيير مكونات الحل بأنها لا تساهم في بعثرة الملاحظ الصافية. هذه العملية "على النقيض من مطابقة" يتحقق عن طريق استبدال الديوتريوم للهيدروجين لتحقيق كثافة طول تشتت الذي يتطابق مع الخلفية (المخزن). يجب أن يعتبر خياراً حكيما للمنظفات (مع نظرائهم الديوتيريوم المتاحة) ونسبة الاختلاط. المذيلات المنظفات، يمكن تنفيذ هذا الاستبدال باستخدام مطهر مع نفس مجموعة الرأس لكن بعد سلسلة الكيل الديوتيريوم (د-الذيل بدلاً من ذيل ح). نظراً للمنظفات جيدا مختلطة،35 على المجاميع سوف يكون بكثافة طول تشتت التي هي المرجحة الخلد-الجزء متوسط من العنصرين (ح-ذيول وذيول د). عندما هذا التباين المتوسط يتسق مع رئيس الفريق، يمكن أن يقابل هياكل تجميعية موحدة تماما لإزالة جميع المساهمات لنثر الملاحظة.
نحن الحاضرين هنا وضع بروتوكول للتعامل مع تباين النيوترون المذيلات المنظفات بدمج جزيئات المنظفات كيميائيا متطابقة مع سلاسل الألكيل يسمى الديوتريوم. 19 , 36 , 37 يسمح هذا التباين المتزامن كاملة مطابقة مذيل الأساسية وشل، وقدرة فريدة على تشتت النيوترونات. 35 , 38 مع هذا المستوى المكرر إلى حد كبير من التفصيل، مطابقة التباين يمكن تمكين الدراسات خلاف ذلك غير مجد للهياكل بروتين الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع هذا النهج النقيض مطابقة للنظم الأخرى التي تنطوي على مواد التنظيف، مثل البوليمر تبادل ردود الفعل39 والزيت عن الماء المشتتات أو40 أو حتى غيرها من الوكلاء سولوبيليزينج، مثل بيسيليس،41 البوليمرات الإسهامية نانوديسكس أو42 أو كتلة. نهج مماثل 43 ألف كما ورد في هذه المخطوطة، ولكن استخدام أنواع منظفات واحد مع استبدال الديوتريوم الجزئي على مجموعة الألكيل سلسلة و/أو رئيس، صدر مؤخرا. 37 بينما يمكن توقع هذا إلى تحسين توزيع عشوائي للهيدروجين والديوتريوم في جميع أنحاء المنظفات بالمقارنة مع النهج الذي قدم هنا، عدد محدود من الوظائف المتاحة في مواد التنظيف للاستبدال وخطوتين مطلوب توليف المنظفات يطرح تحديات إضافية للنظر فيها.
الخطوات 1 و 2 من البروتوكول المفصلة أدناه وكثيراً ما تتداخل منذ التجربة الأولى التخطيط يجب أن يتم تقديم اقتراح نوعية. ومع ذلك، يعتبر تقديم الاقتراح هنا كخطوة أولى للتأكيد على أن هذه العملية ينبغي أن تبدأ قبل وقت كاف من تجربة نيوترون. كما تجدر الإشارة إلى أن خطوة أساسية، ينبغي إثبات أنه بهذا الاقتراح، أن يكون توصيف البيوكيميائية والفيزيائية (بما في ذلك الاستقرار والنقاء) من العينة التي تدعم الحاجة إلى دراسات النيوترونات. مناقشة عامة للتشتت النيوتروني زاوية صغيرة (بلا) خارج نطاق هذه المقالة. أ مقدمة موجزة ولكنها شاملة يتوفر في عمل مرجع تم مؤخرا نشر توصيف المواد كوفمان،44 والكتب المدرسية ركزت بيولوجية زاوية صغيرة حلاً شاملا نثر. 45 كذلك تعطي القراءة الموصى بها في جزء المناقشة. تشتت الزاوية الصغيرة يستخدم ناقل نثر ما يسمى Q كالكمية المركزية التي تصف عملية نثر. تستخدم هذه المقالة تعريف مقبول على نطاق واسع Q = 4π سين (θ)/λ، حيث θ هي نصف الزاوية بين الشعاع الوارد ومتناثرة و λ هو الطول الموجي للإشعاع النيوتروني في أنجسترومس. توجد تعاريف أخرى أن استخدام مختلف رموز مثل في ' لناقلات تشتت، والتي قد تختلف من 2π عامل أو بواسطة استخدام نانومتر بدلاً من انغستروم (انظر أيضا المناقشة من الشكل 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

الصك ونثر البيولوجية زاوية صغيرة النيوترون في عالية-الجريان "النظائر المفاعل من مختبر أوك ريدج الوطني" مخصصة للتحقيق في المواد البيولوجية، وتجهيز الوقود الحيوي والمواد المستوحاة من السيرة الذاتية تغطي نانومتر إلى جداول طول ميكرومتر. الأساليب المقدمة هنا للتحقيق في الخواص الفيزيائية (أي، حجم وشكل) البروتينات الغشاء (هنا، مياب، حوزتي أسبارتيل إينتراميمبراني من ماريسنيجري ميثانوكوليوس) في إيجاد حلول لتشكيل مذيل المنظفات مناسبة تماما لهذا الصك تشتت النيوترونات زاوية صغيرة، بين أمور أخرى. تقنيات تحديد الخصائص الفيزيائية الأخرى تعيق قدرتهم على معالجة الاشتراكات المنظفات في هيكل معقد البروتين-المنظفات. بالإضافة إلى ذلك، يوفر الوصول إلى "مختبر" بيو-ديوتيريشن قدرات فريدة من نوعها لإعداد الزراعات الواسعة النطاق والتعبير عن البروتينات يسمى الديوتريوم لنثر معزز إشارة من البروتين. لئن كان هذا تقنية لا توفر تفاصيل الهيكلية في الاستبانة، وفجوة المعرفة الهيكلية للبروتينات الغشاء يحتوي على العديد من مجالات البحوث عنونة دون أن يتطلب ذلك القرار قرب الذري. وتشمل هذه المجالات على سبيل المثال، تحديد الدول أوليجوميريك، تشكيل معقدة، التغييرات conformational أثناء اضطراب، وقابلة للطي/تتكشف الأحداث. يمكن سهولة إنجاز هذه التحقيقات من خلال تطبيقات لهذا الأسلوب.

ينبغي أن تنقل شعاع الوقت وصك مقترح وضوح كافة المعلومات اللازمة للجنة الاستعراض حيث أنه يمكن إجراء تقييم صحيح للتجربة المقترحة. الاتصالات مع استراتيجية الأمن القومي يقترح العالية للمستخدمين عديمي الخبرة. استراتيجية الأمن القومي تقييم الجدوى الأولية وتقديم الاقتراح دلي...

Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

المنظفات مطابقة التباين في تجارب نثر النيوترون زاوية صغيرة لغشاء بروتين التحليل الهيكلي والنمذجة Ab منذ البداية

هذا البروتوكول يوضح كيفية الحصول على نموذج منخفضة الدقة منذ البداية وتفاصيل الهيكلية بروتين غشاء solubilized المنظفات في الحل باستخدام تشتت الزاوية الصغير النيوترون مع مطابقة على النقيض من مواد التنظيف.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول البروتينات الغشاء المتكاملة مثل الدولة القلة، وحجمها، وشكلها الكلي وهيكل القرار المنخفض في الحل. تتطلب دراسات الحل لبروتينات الأغشية تثبيت الجزيئات مثل المنظفات. هذه التقنية لديها ميزة أنه يجعل المنظفات غير مرئية ويسلط الضوء على إشارة من بروتين الغشاء.الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد إلى العديد من الأسئلة البيولوجية والطبية للبحوث لأن أكثر من 1/3 من البروتينات الموجودة في الأغشية حيث يؤدون العديد من الوظائف الخلوية الحيوية. إن البرهان المرئي على هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لأن وضع علامات الديوتريوم وخطوات نثر النيوترونات أمر صعب التعلم لأن عدداً قليلاً جداً من المؤسسات يقدم التدريب على هذه التقنيات. للبدء، تحديد النيوترونات نثر كثافة طول أو SLDs باستخدام تطبيق الويب MULCh، وحدات لتحليل بيانات تباين التباين.افتح وحدة التباين بالنقر فوق التباين الموجود في جزء التنقل الأيمن. توفير نص لعنوان مشروع وأدخل التفاصيل أدناه لمكونين كـ 1 و 1 و 1. أدخل الصيغة الجزيئية لكل مكون في مربع نص الصيغة.ثم أدخل وحدة التخزين في angstroms مكعب لكل مكون في المربع أدناه حجم. وأخيراً، أدخل تفاصيل مكونات المخزن المؤقت. انقر فوق إرسال لإجراء عمليات حسابية تباين النيوترون.يتم إنشاء صفحة نتائج توفر جدولاً من كثافة طول التشتت ونقاط مطابقة التباين بالإضافة إلى صيغ لتحديد هذه المعلمات بأي نسبة مئوية معينة من D2O في المخزن المؤقت. راجع معلمات التشتت مع الانتباه بشكل خاص إلى نقاط تطابق تباين المكون. تنمو الخلايا القولونية التي تأوي ناقل تعبير غير قابل للانحسار لتسلسل البروتين المستهدف في LB المتوسطة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر أو OD 600 من واحد تقريبًا.تكييف الخلايا القولونية إلى الديوتريوم وصفت المتوسطة قبل أن التوسع لأكثر من التعبير عن البروتين deuterated عن طريق تمييع ثقافة LB 1-20 في ثلاثة ملليلتر من الحد الأدنى من المتوسطة. بعد أن نمت إلى OD 600 من واحد تقريبا، كرر واحد إلى 20 تخفيف باستخدام الحد الأدنى المتوسطة التي تحتوي على 50، 75، و 100٪ D2O. تكيف مرة واحدة، ومواصلة زراعة الثقافة في مفاعل حيوي لزيادة العائد من كتلة الخلايا deuterated.ومع زيادة محتوى D2O، سوف تنخفض معدلات النمو. المضي قدما في الحصاد ، وlyse وتنقية الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص. اربط التالي عمود استبعاد حجم مع أكبر من اثنين من وحدات التخزين العمود من المخزن المؤقت التبادل النهائي باستخدام نظام كروماتوغرافيا السائلة البروتينية السريعة.بعد حقن العينة، تشغيل العمود في عزل الكسور المقابلة للبروتين من الفائدة. حجز aliquot من العازلة المتطابقة لزاوية صغيرة النيوترونات التشتت أو SANS الطرح الخلفية. لجمع بيانات SANS، قم بتحميل عينات ومخازن مؤقتة في خلايا الكوارتز.بعد التأكد من أن يتم إغلاق مصراع شعاع، نهج منطقة البيئة عينة ووضع خلايا الكوارتز في المغير عينة. تسجيل موضع مغير العينة لكل خلية عينة. تحقق من المنطقة وتأكد من أن مسار الشعاع خال من العرقلة قبل مغادرة منطقة بيئة العينة.ثم افتح مصراع الشعاع. تنفيذ فحص جدول لجمع البيانات التلقائية. اتبع التعليمات لتشغيل الجهاز المقدمة من عالم النيوترونات المنتشرة.استخدام برنامج مانتيد مؤامرة والسيناريو بيثون للحد من البيانات SANS من صورة 2D إلى مؤامرة 1D. للقيام بذلك، قم بتسجيل الدخول إلى الكتلة التحليل البعيد وتنفيذ مؤامرة Mantid من سطر الأوامر. ثم افتح البرنامج النصي المخصص للمستخدم وقم بوضع أرقام المسح الضوئي المقابلة أو تعريف العينة في أزواج المخزن المؤقت في القائمة المناسبة.تنفيذ البرنامج النصي لإنشاء بيانات مخفضة كملف نصي عمود أربعة في الموقع المحدد. انقر بزر الماوس الأيمن على مساحة العمل المناسبة ومؤامرة Mantid وحدد مؤامرة مع أخطاء لفحص أولي من التشكيلات مبعثر. قم بتنزيل مجموعة برامج ATSAS واستخدم برنامج PRIMUS لتآمر البيانات وتحجيم المخزن المؤقت والطرح وتحليل جينييه.إطلاق ATSAS، SAS تطبيق تحليل البيانات وتحميل ملفات البيانات المخفضة المقابلة لنموذج وزوج المخزن المؤقت. لتحجيم المخزن المؤقت بشكل صحيح، حدد نطاق البيانات عند Q عالية حيث تتشابه كلا التشكيلات في مسطح وانقر زر المقياس الموجود تحت علامة التبويب العمليات. زيادة نطاق البيانات لعرض كافة النقاط، انقر فوق طرح لتنفيذ هذه العملية.إجراء تحليل جينييه من البيانات عينة طرح المخزن المؤقت باستخدام علامة التبويب تحليل تطبيق تحليل البيانات SAS. تأكد من تحديد الملف المناسب في القائمة وانقر فوق نصف قطر من gyration. سيتم توفير محاولة تلقائية لتنفيذ ملاءمة Guinier بالنقر على زر RG تلقائيًا.توسيع نطاق البيانات المستخدمة لتضمين كافة البيانات Q منخفضة والبدء في تضييق نطاق البيانات عن طريق أخذ نقاط Q عالية حتى الحد الأقصى Q مرات RG أقل من 1.3. استخدم قطعة المخلفات للتحقق من أن البيانات خطية في النطاق المناسب. إجراء تعديلات صغيرة على المنطقة المناسبة ومراقبة حساسية هذه القيم لنطاق البيانات المستخدمة في الملاءمة.الحصول على وظيفة توزيع الاحتمال P من R في جنوم. الآن بدء تشغيل معالج توزيع المسافة ضمن علامة التبويب تحليل. الحصول على ملائمة جيدة للبيانات أمر ضروري للحصول على نموذج الجودة.تحديد Dmax، المسافة بين الذرية القصوى داخل الجزيء. تقدير قيمة لDmax عن طريق إلغاء تحديد المربع لإجبار Rmax يساوي الصفر وإدخال قيمة كبيرة لDmax. أول تقاطع X في مؤامرة من P من R غلة هذا التقدير.إجراء تغييرات تدريجية على قيمة Dmax هذه بالإضافة إلى نطاق البيانات المستخدمة لعدد من النقاط المستخدمة لتحسين ملاءمة جنوم للبيانات و P الناتجة من منحنى R. بدء تشغيل معالج الشكل بريموس من زر dammif في علامة التبويب تحليل تحليل بيانات SAS واستخدم مجموعة يدوية من المعلمات. تعريف نطاق جينييه من تناسب والمضي قدما إلى الخطوة التالية باستخدام أزرار التنقل.تعريف القيم الملائمة من رسم P من R ثم انتقل إلى الخطوة التالية. توفير المعلمات لعملية النمذجة ab initio. ثم قم ببدء العملية باستخدام زر الالتزام.تراكب فوق المغلف بلا النهائي مع نموذج ذات الصلة عالية الدقة باستخدام supcomb داخل ATSAS. ضع نسخة من طراز PDB عالي الدقة لتكون ملائمة إلى المغلف SANS في دليل العمل. ثم قم بتنفيذ supcomb من سطر الأوامر باستخدام أسماء الملفات PDB كوسيطتين مع بنية القالب المسرودة أولاً.أخيرا تصور نتائج نموذج AB initio باستخدام PyMOL، وهو برنامج عرض الرسومات الجزيئية 3D. مرة واحدة في SANS المغلف وهيكل عالية الدقة قد تم فرضه، يمكن تصور هذه النماذج باستخدام أي برنامج عرض الرسومات الجزيئية. يتم عرض نظرة عامة على عملية PyMOL التصور.بمجرد فتح ملفات بنية PDB في PyMOL ، يجب أن تكون النماذج مرئية في نافذة المشاهد PyMOL. يمكن تغيير تمثيلات كل طراز باستخدام الزر S بجوار كل اسم ملف. هنا يتم استخدام تمثيل السطح لمغلف SANS ويتم استخدام تمثيل الرسوم المتحركة للعمود الفقري للبروتين من نموذج القرار العالي.يمكن اختيار نظام ألوان مناسب من الخيارات المتوفرة تحت الزر C. بالنسبة لسلاسل البروتين، يوفر تلوين االلون تدرج اللون من N إلى C إلى تفسير. يتم تطبيق الشفافية على التمثيل السطحي للسماح بتصور أفضل لبنية البروتين داخل المغلف.بالنسبة لصور المنشور، يوصى بخلفية بيضاء. مرة واحدة وقد تم تطبيق هذه الإشارات التصور يمكن فحص الهياكل 3D عن طريق النقر على سحب الهيكل. يمكن إجراء التلاعب بالمنظور ودوران الجزيئات والترجمة.أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن تتذكر أن تتطابق بدقة مع التباين النيوتروني من مجموعات الرأس والذيل المنظفات مع مذيبات H2O D2O. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق لاستكشاف هيكل البروتيات داخل الأراضي. وتشارك هذه البروتينات في الاستجابة المناعية, التهاب الكبد C ومرض الزهايمر.لا تنس أن العمل في المختبرات الكيميائية الحيوية وفي مرافق شعاع النيوترون يمكن أن يكون خطيرا. الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية واتباع جميع قواعد سلامة المنشأة والبيانات الإشعاعية إلزامية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من سيريفيسيا س.

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

توصيف البروتينات حسب الحجم والاستبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...