Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Office af biologiske og miljømæssige forskning støttet forskning på ORNL'S Center for strukturelle Molekylærbiologi (CSMB) og Bio-SANS bruger faciliteter understøttet af videnskabelige bruger faciliteter Division, Office of grundlæggende energi Sciences, os afdeling af energi. Strukturelle arbejde på Membranproteiner i Lieberman lab er blevet støttet af NIH (DK091357, GM095638) og NSF (0845445).

1. forberede og indsende en Neutron facilitet Beam tid og Instrument forslag
<ol><li>Consult online ressourcer for at identificere neutron scattering faciliteter, der giver generelt brugeren neutron stråle tid adgang, såsom Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Et kort over neutron faciliteter og oplysninger om neutron forskningen på verdensplan er tilgængelig online. 46 være klar over, at disse faciliteter typisk har regelmæssig indkaldelser af forslag; Dette afgør, hvornår den næste s...

Strukturel biologi forskere drage fordel af supplerende strukturelle teknikker som løsning spredning til atkræve biomolekyler i løsning biokemiske og strukturelle detaljer (såsom samlede størrelse og form). SANS er et særligt attraktivt teknik til bestemmelse af lav opløsning strukturer af membranproteiner, en kerne fokus på moderne strukturel biologi og biokemi. SANS kræver mængder af rensede proteiner sammenlignes med krystallografiske forsøg (1 mg/prøve). Høj renhed deutereret rengøringsmidler relevante ...

Membranproteiner er kodet med en anslået 30% af alle gener1 og udgør en stærk størstedelen af mål for moderne lægemidler. 2 disse proteiner udfører en bred vifte af vitale cellulære funktioner,3 men trods deres overflod og betydning — kun udgør omkring 1% af de samlede strukturer deponeret i forskning learningsmiljøer for strukturel Bioinformatik (RCSB) Protein Data Bank. 4 på grund af deres delvist hydrofob karakter, har Strukturbestemmelse af proteiner, membran-bundet været overordentlig udfordrende. 5 , 6 , 7
Da mange biofysiske teknikker kræver monodisperse partikler i løsning for måling, har isolerende Membranproteiner fra native membraner og stabilisere disse proteiner i en opløselig efterligner af indfødte membraner været et aktivt område for forskning i de seneste årtier. 8 , 9 , 10 disse undersøgelser har ført til udviklingen af mange nye amphiphilic forsamlinger til solubilize Membranproteiner, såsom nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 og amphipols. 16 , 17 dog brugen af vaskemiddel micelles stadig en af de mest almindelige og enkle metoder til at opfylde kravene Opløselighed af et bestemt protein. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 desværre ingen enkelt vaskemiddel eller magiske blanding af vaske-og rengøringsmidler i øjeblikket findes der opfylder alle Membranproteiner; således, disse betingelser skal screenes empirisk for de unikke krav af hvert protein. 26 , 27
Rengøringsmidler samle selv i løsning over deres kritiske micelle koncentration til at danne samlede strukturer kaldet micelles. Micelles er sammensat af mange vaskemiddel monomerer (typisk spænder fra 20-200) med hydrofobe alkyl kæder danner en micelle kerne og hydrofile hoved grupper arrangeret i en micelle shell lag vender den vandigt opløsningsmiddel. Funktionsmåden for vaske-og rengøringsmidler og micelle dannelse er blevet klassisk beskrevet af Charles Tanford i Den hydrofobe virkning,28 og størrelser og figurer af micelles fra almindeligt anvendte detergenter i membranen protein undersøgelser har været karakteriseret ved hjælp af små-vinkel spredning. 29 , 30 vaskemiddel organisation om Membranproteiner er også blevet undersøgt, og dannelsen af protein-vaskemiddel komplekser (fremdaterede) forventes med vaskemiddel molekyler omkring protein i et arrangement, der ligner den pæn vaskemiddel micelles. 31
En tilføjet fordel i ved hjælp af vaske-og rengøringsmidler er, at de resulterende micelle egenskaber kan manipuleres ved at indarbejde andre rengøringsmidler. Mange rengøringsmidler udstille ideelle blanding, og vælg egenskaber af blandede micelles kan endda forudsiges ud fra komponenter og forholdet mellem blanding. 22 men tilstedeværelsen af vaskemiddel kan stadig præsentere udfordringer for biofysiske beskrivelser ved at bidrage til den samlede signal. For eksempel, med røntgen og lysspredning teknikker er signal fra vaskemiddel i PDC næsten umulig at skelne fra protein. 32 undersøgelser med enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) typisk stole på fanget (frosne) partikler; strukturelle detaljer af protein er stadig skjult af visse rengøringsmidler eller en høj koncentration af vaskemiddel, som tilføjer til baggrunden. 33 alternative tilgange mod tolkning fuld PDC struktur (herunder vaskemiddel) har gjort gennem beregningsmetoder, som søger at rekonstruere vaskemiddel omkring en given membran protein. 34
I tilfælde af neutron scattering producerer core-shell arrangement af vaskemiddel i micelle en formfaktor, som bidrager til den observerede spredning. Heldigvis kan løsningskomponenter ændres således, at de ikke bidrager til den netto observerede spredning. Denne "kontrast matching" processen er opnået ved at erstatte deuterium for brint til at opnå en spredning længde tæthed, som svarer til baggrunden (buffer). Et fornuftigt valg af vaskemiddel (med tilgængelige deutereret modstykker) og deres forhold til blanding skal tages i betragtning. For vaskemiddel micelles, kan denne substitution udføres ved hjælp af et rengøringsmiddel med samme hoved gruppe men at have en deutereret alkyl kæde (d-hale i stedet for h-hale). Da vaske-og rengøringsmidler er godt blandet,35 deres aggregater har en spredning længde tæthed, der er den mole-brøkdel vægtet gennemsnit af de to komponenter (h-haler og d-haler). Når denne gennemsnitlige kontrast er i overensstemmelse med den hoved gruppe, kan de ensartede samlede strukturer matches fuldt ud for at fjerne alle bidrag til observerede spredning.
Vi præsenterer her en protokol for at manipulere neutron kontrasten af vaskemiddel micelles ved at indarbejde kemisk identiske vaskemiddel molekyler med deuterium-mærket alkyl kæder. 19 , 36 , 37 dette tillader komplet samtidige kontrast matchende micelle kerne og shell, som er en unik evne til neutron spredning. 35 , 38 med dette væsentligt raffinerede detaljer, kontrast matchende kan aktivere ellers umuligt at gennemføre undersøgelser af membran proteinstrukturer. Derudover kunne denne kontrast-matching tilgang udvides til andre systemer, der omfatter vaskemiddel, såsom polymer exchange reaktioner39 og olie-vand dispergeringsmidler,40 eller endog andre solubilizing stoffer, såsom bicelles,41 nanodiscs,42 eller blok copolymere. 43 A lignende tilgang som skitseret i dette manuskript, men beskæftiger en enkelt vaskemiddel arter med delvis deuterium erstatningsvarer med alkyl kæde og/eller hoved gruppe, blev for nylig offentliggjort. 37 mens dette kan forventes at forbedre den tilfældige fordeling af brint og deuterium hele vaskemiddel i forhold til den fremgangsmåde, der præsenteres her, det begrænsede antal ledige stillinger på vaskemiddel til substitution og to-trins vaskemiddel syntese kræves udgør yderligere udfordringer for at vurdere.
Trin 1 og 2 i protokollen detaljeret nedenfor ofte overlapper da indledende forsøg planlægning skal gøres for at forelægge et forslag til kvalitet. Dog forslag indsendelse betragtes her som det første skridt til at understrege, at denne proces bør indledes god tid en neutron eksperiment. Det bør også bemærkes, at en forudsætning skridt, som skal påvises ved forslaget, er at have biokemiske og fysiske karakterisering (herunder renhed og stabilitet) af prøven støtter behovet for neutron undersøgelser. En generel diskussion af små-angle neutron spredning (SANS) er uden for rammerne af denne artikel. En kort men grundig introduktion er tilgængelig i opslagsværk Karakterisering af materialer af Kaufmann,44 og en omfattende lærebog fokuseret på biologiske små-vinkel løsning spredning er for nylig blevet offentliggjort. 45 yderligere anbefalet læsning er givet i afsnittet diskussion. Lille vinkel spredning bruger den såkaldte spredning vektor Q som den centrale mængde, der beskriver spredning processen. I denne artikel bruges det bredt accepteret definition Q = 4π synd (θ) / λ, hvor θ er halv vinkel mellem indgående og spredt stråle og λ er bølgelængden af neutron stråling i oxidlag. Andre definitioner findes at bruge forskellige symboler som 's' for spredning vektor, og som kan variere med en faktor 2π eller ved hjælp af nanometer i stedet for Ångstrøm (Se også diskussion af figur 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

Det biologiske small angle neutron scattering instrument på High-Flux isotop reaktor af Oak Ridge National Laboratory er dedikeret til undersøgelse af biologiske materialer, biobrændstof forarbejdning og bio-inspirerede materialer der dækker nanometer til mikrometer længdeskalaer. De metoder, der præsenteres her for undersøger fysiske egenskaber (dvs. størrelse og form) af membranproteiner (her, MmIAP, en intramembrane aspartyl protease fra Methanoculleus marisnigri) i løsninger af micelle-dannende rengøringsmidler er velegnet til denne lille-angle neutron scattering instrument, blandt andre. Andre biofysiske karakterisering teknikker er hæmmet af deres evne til at løse de vaskemiddel bidrag i en protein-vaskemiddel kompleks struktur. Derudover giver adgang til Bio-Deuteration Lab unikke muligheder for at forberede store udlæg til planteavl og udtrykker deuterium-mærket proteiner for øget spredning signal fra protein. Mens denne teknik giver ikke strukturelle detaljer i høj opløsning, den strukturelle videnskløften på Membranproteiner indeholder mange adresserbare områder af forskning uden at kræve nær atomic opløsning. For eksempel, omfatter disse områder bestemmelse af oligomere stater, kompleks dannelse, konformationelle ændringer under undertrykkelse af netbårne og folde/udfoldelsen begivenheder. Disse undersøgelser kan udføres let gennem anvendelser af denne metode.

En stråle tid og instrument forslag bør klart viderebringe alle oplysninger, der kræves til anmeldelse udvalget, så en gyldig vurdering af den foreslåede eksperiment kan foretages. Kommunikation med en NSS er meget foreslået for uerfarne brugere. NSS kan vurdere indledende feasibility og guide forslag forelægges understrege gennemførlighed, sikkerhed og potentialet for high-impact videnskab. Oplysningerne i forslaget bør omfatte baggrundsinformation og konteksten for betydningen ...

Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-matche vaskemiddel i små-Angle Neutron Scattering eksperimenter for membran Protein strukturel analyse og Ab Initio modellering

Denne protokol demonstrerer hvordan man kan opnå en lav opløsning ab initio model og strukturelle detaljerne i et vaskemiddel-solubilized membran protein i løsning ved hjælp af små-angle neutron scattering med kontrast-matche vaskemiddel.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om integreret membran proteiner såsom oligomeric tilstand, deres størrelse, overordnede form og lav opløsning struktur i opløsning. Løsningsundersøgelser af membranproteiner kræver stabilisering af molekyler som rengøringsmidler. Denne teknik har den fordel, at den gør rengøringsmidler usynlige og fremhæver signalet fra membranproteinet.Konsekvenserne af denne teknik strækker sig til mange biologiske og medicinske forskningsspørgsmål, fordi over 1/3 af proteiner bor i membraner, hvor de udfører mange vitale cellulære funktioner. Visuel demonstration af denne metode er afgørende, da deuterium mærkning og neutron spredning skridt er vanskelige at lære, fordi meget få institutioner tilbyder uddannelse i disse teknikker. Til at begynde, bestemme neutron spredning længde tætheder eller SLDs ved hjælp af web-applikationEN MULCh, moduler til analyse af kontrast variation data.Åbn kontrastmodulet ved at klikke på kontrast, der er placeret i venstre navigationsrude. Angiv tekst til en projekttitel, og angiv nedenstående oplysninger for to komponenter som underenhed en og underenhed to. Angiv molekylærformlen for hver komponent i formeltekstfeltet.Derefter indtastes volumen i kubiske angstroms for hver komponent i boksen under volumen. Endelig skal du angive detaljerne for bufferkomponenter. Klik på Send for at udføre neutronkontrastberegningerne.Der oprettes en resultatside, der indeholder en tabel over spredningslængdetæthed og kontrastmatchpunkter samt formler til bestemmelse af disse parametre ved en given procentdel af D2O i bufferen. Gennemgå spredningsparametrene med særlig vægt på komponentkontrastmatchpunkterne. Dyrk E.coli celler huser en induceret udtryksvektor for målet protein sekvens i LB medium til en optisk tæthed på 600 nanometer eller OD 600 af ca én.Tilpas E.coli celler til deuterium mærket medium før skalere op for over udtryk for et deutereret protein ved at fortynde LB kultur en til 20 i tre milliliter minimal medium. Efter dyrkning til en OD 600 på ca. én gentages den ene til 20 fortyndinger ved hjælp af minimalt medium indeholdende 50, 75 og 100% D2O. Når tilpasset, fortsætte med at dyrke kulturen i en bioreaktor for at øge udbyttet af deutereret cellemasse.Efterhånden som D2O-indholdet øges, vil vækstraterne falde. Fortsæt med at høste, lyse og rense celler som beskrevet i tekstprotokollen. Næste ækvilibrer en størrelse udelukkelse kolonne med større end to kolonne mængder af endelige udveksling buffer ved hjælp af en hurtig protein flydende kromatografi system.Efter injektion af prøven køres kolonnen i isolerede fraktioner, der svarer til det pågældende protein. Reserver en aliquot matchet buffer til lille vinkel neutron spredning eller SANS baggrund subtraktion. Hvis du vil indsamle SANS-data, skal du først indlæse prøver og buffere i kvartsceller.Når du har sørget for, at strålelukkeren er lukket, nærmer du dig prøvemiljøområdet, og kvartscellerne anbringes i prøveskifteren. Posten for eksempelskifterpositionen for hver eksempelcelle. Kontroller området, og sørg for, at strålevejen er fri for forhindringer, før du forlader prøvemiljøområdet.Åbn derefter strålelukkeren. Udføre en tabelscanning til automatiseret dataindsamling. Følg anvisningerne for instrumentdrift fra neutronspedaktionsforskeren.Brug Mantid Plot software og Python script til reduktion af SANS data fra et 2D-billede til en 1D plot. Det kan du gøre ved at logge på fjernanalyseklyngen og udføre Mantid-plot fra kommandolinjen. Åbn derefter det angivne brugerreduktionsscript, og placer de tilsvarende scanningsnumre eller identifikation for eksemplet i bufferpar på den relevante liste.Udfør scriptet for at generere reducerede data som en tekstfil med fire kolonner på den angivne placering. Højreklik på den relevante arbejdsplads og Mantid plot og vælg plot med fejl for en indledende undersøgelse af spredning profiler. Download ATSAS-softwarepakken, og brug PRIMUS til dataplottning, bufferskalering og subtraktion og Guinier-analyse.Start ATSAS- og SAS-dataanalyseprogrammet, og indlæs de reducerede datafiler, der svarer til eksempel- og bufferparret. Hvis du vil skalere bufferen korrekt, skal du vælge dataområdet ved højt Q, hvor begge profiler er ens, fladt, og klikke på skalaknappen under fanen Operationer. Forøg dataområdet for at få vist alle punkter, klik på træk for at udføre denne handling.Udfør en Guinier-analyse af de bufferudtruberede eksempeldata ved hjælp af analysefanen i SAS-dataanalyseprogrammet. Sørg for, at den korrekte fil er valgt på listen, og klik på gyrationens radius. Et automatiseret forsøg på at udføre en Guinier pasform vil blive leveret ved at klikke på auto RG-knappen.Udvid det dataområde, der bruges til at medtage alle de lave Q-data, og begynd at indsnævre dataområdet ved at fjerne høje Q-punkter, indtil Q-max-tidsgrænsen RG er under 1,3. Brug restområdet til at kontrollere, at dataene er lineære i tilpasningsområdet. Foretag små justeringer af det område, der passer, og overvåg disse værdiers følsomhed over for det dataområde, der bruges i pasformen.Hent sandsynlighedsfordelingsfunktionen P af R i gnome. Start nu guiden Afstandsfordeling under fanen Analyse. Det er vigtigt at opnå en god tilpasning til dataene for at opnå en kvalitetsmodel.Bestem Dmax, den maksimale interatomare afstand inden for molekylet. Anslå en værdi for Dmax ved at fjerne markeringen i feltet for at tvinge Rmax lig med nul og indtaste en stor værdi for Dmax. Den første X-aflytning i plottet af P af R giver dette skøn.Foretag trinvise ændringer af denne Dmax-værdi samt det dataområde, der bruges til det antal punkter, der bruges til at optimere gnome-pasformen til dataene og den resulterende P af R-kurve. Start guiden PRIMUS figur fra dammif-knappen under analysefanen for SAS-dataanalyse, og brug et manuelt udvalg af parametre. Definer Guinier-området fra pasformen, og fortsæt til næste trin ved hjælp af navigationsknapperne.Definer fit-værdier fra P af R-plottet, og fortsæt til næste trin. Angiv parametre for ab initio modelleringsprocessen. Start derefter processen ved hjælp af bekræftelsesknappen.Overlejring og overlejr den endelige sans kuvert med en relateret høj opløsning model ved hjælp af supcomb i ATSAS. Placer en kopi af PDB-modellen med høj opløsning, der passer til SANS-konvolutten, i arbejdsmappen. Udfør derefter supcomb fra kommandolinjen ved hjælp af PDB-filnavnene som to argumenter med skabelonstrukturen angivet først.Endelig visualisere ab initio model resultater ved hjælp af PyMOL, en 3D molekylær grafik visning program. Når SANS kuvert og høj opløsning struktur er blevet overlejret, kan disse modeller visualiseres ved hjælp af enhver molekylær grafik visning program. Der vises en oversigt over PyMOL-visualiseringsprocessen.Når PDB struktur filer er blevet åbnet i PyMOL, modellerne skal være synlige i PyMOL fremviser vinduet. Repræsentationerne for hver model kan ændres ved hjælp af S-knappen ud for hvert filnavn. Her bruges en overfladerepræsentation til SANS-konvolutten, og en tegneserierepræsentation bruges til proteins rygraden i modellen med høj opløsning.Der kan vælges et passende farveskema blandt de indstillinger, der er tilgængelige under C-knappen. For proteinkæder giver en kædebue farve en farvegradient fra N til C-terminus til fortolkning af støtten. Der anvendes gennemsigtighed på overfladerepræsentationen for at muliggøre en bedre visualisering af proteinstrukturen i konvolutten.Til publikationsbilleder anbefales en hvid baggrund. Når disse visualiseringsindikatorer er blevet anvendt, kan 3D-strukturerne undersøges ved at klikke og trække i strukturen. Manipulationer af perspektivet og molekylerotation og oversættelse kan udføres.Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske at nøjagtigt matche neutronkontrasten mellem vaskemiddelhovedet og halegrupperne med D2O H2O-opløsningsmidlet. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for at udforske strukturen af intramembrane asparto proteaser. Disse proteiner er involveret i immunrespons, hepatitis C og Alzheimers sygdom.Glem ikke, at arbejde i biokemiske laboratorier og på neutron stråle faciliteter kan være farligt. Forholdsregler såsom at bære personlige værnemidler og følge alle facilitetssikkerhedsregler og radiologiske posteringer er obligatoriske, når du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere røntgenkrystallografi med lille vinkel X-Ray spredning til Model ustruktureret regioner af Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskellige dimensioner ved hjælp af automatiseret krystallisering kombineret med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionbytning kromatografi (IEX) koblet til multi-vinkel lysspredning (MALS) for Protein adskillelse og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering af proteiner efter størrelse-eksklusions kromatografi koblet til multi-vinkel Light spredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...