Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

L’Office of Biological and Environmental Research appuyé la recherche au centre de ORNL pour biologie moléculaire structurale (CSMB) et Bio-SANS en utilisant les équipements pris en charge par le scientifique à la Division des installations, le Bureau des Sciences fondamentales de l’énergie, le département américain de l’énergie. Travaux structurels sur les protéines de la membrane dans le laboratoire de Lieberman a été soutenu par les NIH (DK091357, GM095638) et NSF (0845445).

1. préparer et soumettre un Neutron installation faisceau temps Instrument et proposition
<ol><li>Consulter les ressources en ligne pour l’identification des installations de diffusion de neutrons qui fournissent l’utilisateur générale neutrons faisceau temps accès, tels que l’Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Une carte des installations de neutrons et d’informations sur la recherche de neutrons dans le monde entier est disponible en ligne. 46 , sachez que ces installations ont g...

Chercheurs de biologie structurale tirer parti des techniques structurelles complémentaires comme solution de diffusion pour obtenir des détails biochimiques et structurales (tels que la taille globale et la forme) de molécules en solution. SANS est une technique particulièrement attractive pour la détermination des structures de faible résolution des protéines membranaires, un objectif de base de biochimie et de biologie structurale moderne. SANS nécessite des quantités de protéines purifiées comparables à c...

Les protéines membranaires sont codées par environ 30 % de tous les gènes1 et représentent une forte majorité des cibles pour des médicaments modernes. 2 ces protéines effectuent un large éventail de fonctions cellulaires vitales,3 mais en dépit de leur abondance et leur importance, ne représentent qu’environ 1 % du totales structures déposées dans le Research Collaboratory Structural Bioinformatics (RCSB) protéine Banque de données. 4 en raison de leur caractère hydrophobe partiellement, détermination structurale des protéines membranaires a été extrêmement difficile. 5 , 6 , 7
Comme beaucoup de techniques biophysiques nécessite monodispersés particules en solution pour la mesure, isoler des protéines de la membrane des membranes natives et la stabilisation de ces protéines dans un imitateur soluble des membranes natives a été un sujet de recherche active au cours des dernières décennies. 8 , 9 , 10 ces investigations ont conduit au développement de nombreuses nouvelles amphiphiles assemblées de solubiliser les protéines membranaires, comme nanodiscs, bicelles de11,12,13 ,14,15 et amphipols. 16 , 17 cependant, l’utilisation de détergents micelles reste une des approches plus courantes et les plus simples pour satisfaire aux exigences de la solubilité d’une protéine donnée. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 malheureusement, aucun détergent unique ou mélange magique de détergents n’existe actuellement qui satisfait à toutes les protéines de la membrane ; ainsi, ces conditions doivent être empiriquement dépistage pour les besoins uniques de chaque protéine. 26 , 27
Détergents s’auto-assembler en solution au-dessus de leur concentration micellaire critique pour former des structures agrégées appelées micelles. Les micelles sont composés de nombreux monomères détergents (qui vont généralement de 20 à 200) avec chaînes alkyl hydrophobe, formant un noyau de micelles et les groupes de tête hydrophiles en une couche de coquille de micelle face à solvant aqueux. Le comportement de détergents et de la formation des micelles a été classiquement décrite par Charles Tanford dans L’effet hydrophobe, de28 et de tailles et formes des micelles de détergents couramment utilisés dans les études de protéines membranaires ont été caractérisé à l’aide de petits angles diffusion. 29 , 30 organisme de détergent sur les protéines de la membrane a également été étudiée, et la formation des complexes protéine-détergent (PDC) est prévue avec les molécules de détergent entourant la protéine dans un arrangement qui ressemble à du détergent pur micelles. 31
On a ajouté avantage dans l’utilisation de détergents est que les propriétés de micelle qui en résulte peuvent être manipulées en incorporant d’autres détergents. De nombreux détergents pièce mélange idéal, et sélectionnez Propriétés de micelles mixtes peuvent même être prédites par les composants et le ratio de mélange. 22 Toutefois, la présence de détergent peut encore présentent des défis pour la caractérisation biophysique en contribuant au signal global. Par exemple, avec des rayons x et des techniques de diffusion de la lumière, signal de détergent dans le PDC est pratiquement impossible à distinguer de protéine. 32 enquêtes avec particule cryo microscopie électronique (cryo-EM) s’appuient généralement sur des particules (congelés) pris au piège ; des détails de structure de la protéine sont toujours cachés par certains détergents ou une forte concentration de détergent qui ajoute à l’arrière-plan. 33 autres approches vers l’interprétation de la structure complète de PDC (y compris le détergent) ont été faites par des méthodes de calcul qui cherchent à reconstruire le détergent autour d’une protéine de membrane donnée. 34
Dans le cas de la diffusion des neutrons, l’arrangement de noyau-enveloppe de détergent dans la micelle produit un facteur de forme qui contribue à la dispersion observée. Heureusement, les composants de la solution peuvent être modifiées telle qu’ils ne contribuent pas à la dispersion observée nette. Ce processus de « contraste correspondant » est réalisé en remplaçant le deutérium de l’hydrogène atteindre une densité de longueur de diffusion qui correspond à celle de l’arrière-plan (tampon). Un choix judicieux de détergent (avec des homologues deutérés disponibles) et de leur ratio de mélange doivent être considérés. Pour détergents micelles, cette substitution peut être effectuée à l’aide d’un détergent avec le même groupe de tête mais comportant une chaîne alkyle deutéré (d-queue au lieu de h-queue). Étant donné que les détergents sont bien mélangés,35 leurs agrégats aura une densité de longueur de diffusion qui est la fraction molaire pondérée moyen des deux composantes (h-queues et d-queues). Lorsque ce contraste moyen correspond à celle du groupe de tête, les structures globales uniformes peuvent être entièrement assorties pour supprimer toutes les contributions à la dispersion observée.
Nous présentons ici un protocole visant à manipuler le contraste de neutrons des micelles détergents en incorporant des molécules de détergent chimiquement identiques avec des chaînes alkyles marqués au deutérium. 19 , 36 , 37 cette façon contraste simultané complet correspondant de micelle principale et de la coquille, qui est une capacité unique de diffusion des neutrons. 35 , 38 avec ce niveau sensiblement raffiné de détail, contraste correspondant peut activer sinon irréalisables études des structures des protéines membranaires. En outre, cette approche contraste équivalente pourrait être étendue à d’autres systèmes impliquant détergent comme polymère échange réactions39 et huile-eau dispersants,40 ou même d’autres agents solubilisants, tels que bicelles,41 nanodiscs,42 ou bloc copolymères. 43 A approche similaire tel que décrit dans ce manuscrit, mais en employant une seule espèce de détergent avec des substitutions de deutérium partielle sur le groupe alkyle de chaîne et/ou de la tête, a été récemment publié. 37 alors que cela est susceptible d’améliorer la répartition aléatoire de l’hydrogène et de deutérium dans le détergent par rapport à l’approche présentée ici, le nombre limité de postes disponibles sur le détergent de substitution et en deux étapes synthèse de détergent nécessaire pose des défis supplémentaires aux fins d’examen.
Les étapes 1 et 2 du protocole détaillés ci-dessous souvent se chevauchent car la première expérience de planification doit être faite pour présenter une proposition de qualité. Cependant, la proposition est considérée ici comme la première étape à souligner que ce processus doit être démarré bien avant une expérience de neutrons. Il est à noter également qu’une étape préalable, ce qui devrait être démontrée par la proposition, est d’avoir la caractérisation biochimique et physique (y compris la pureté et la stabilité) de l’échantillon soutenant la nécessité d’études de neutrons. Une discussion générale de neutrons de petits angles de diffusion (San) est abordée dans cet article. Une introduction brève mais complète est disponible dans l’ouvrage de référence, Caractérisation des matériaux par Kaufmann,44 et une solution complète de manuels ciblée sur biologique petits angles de diffusion a été publié récemment. 45 autres lectures recommandées est donnée dans la section « Discussion ». Diffusion petits angles utilise le vecteur de diffusion que l'on appelle Q la quantité central qui décrit le processus de diffusion. Cet article reprend la définition généralement acceptée Q = 4π sin (θ) / λ, où θ est la moitié l’angle entre le faisceau entrant et épars et λ est la longueur d’onde du rayonnement neutronique en angströms. Autres définitions existent qu’utilisation différente symboles tels que les de ' pour le vecteur de diffusion et qui peuvent différer par un facteur 2π ou à l’aide de nanomètres au lieu de Angstrom (voir aussi la discussion de la Figure 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

L’instrument de diffusion de neutrons de petits angles biologique au haut Flux Isotope réacteur du Oak Ridge National Laboratory est dédié à l’étude des biomatériaux, biocarburants de traitement et les matériaux bio-inspirés couvrant nanomètre à échelles de micromètre de longueur. Les méthodes présentées ici pour étudier les propriétés physiques (p. ex., la taille et la forme) des protéines membranaires (ici, MmIAP, une protéase d’aspartyl intramembranaires de Methanoculleus marisnigri) dans les solutions micellaires formant des détergents sont bien adapté pour cet instrument de diffusion de neutrons de petits angles, entre autres. Autres techniques de caractérisation biophysique sont gênées par leur incapacité à régler les contributions de détergent dans une structure complexe de protéine-détergent. En outre, l’accès au laboratoire Bio-deutération fournit des capacités uniques pour la préparation des cultures à grande échelle et exprimant des protéines marquées du deutérium pour le signal de diffusion accrue de la protéine. Tandis que cette technique ne fournit pas de détails structuraux à haute résolution, ce manque de connaissances structurale des protéines membranaires contient plusieurs zones adressables de recherche sans nécessiter de résolution atomique près. Par exemple, ces domaines incluent la détermination des États oligomériques, formation d’un complexe, des changements conformationnels durant la perturbation et les événements de pliage/dépliage. Ces enquêtes peuvent être facilement exécutées via des applications de cette méthode.

Une proposition d’instrument et de temps de faisceau doit exprimer clairement toutes les informations nécessaires au Comité de surveillance ainsi qu’une évaluation valable de l’expérience proposée peut être faite. Communication avec un NSS est fortement recommandée pour les utilisateurs inexpérimentés. Le SNRS peut évaluer la faisabilité initiale et soumission de proposition de guide pour souligner la faisabilité, la sécurité et le potentiel de fort impact science. Les...

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Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Correspondance de contraste de détergent dans les expériences de diffusion de neutrons de petits angles pour l’analyse structurale de protéines membranaires et la modélisation de Ab Initio

Ce protocole montre comment obtenir un modèle basse résolution ab initio et des détails de structure d’une protéine de membrane solubilisée détergent en solution par la diffusion des neutrons de petits angles avec filtrage de contraste du détergent.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur les protéines membranaires intégrales telles que l’état oligomérique, leur taille, leur forme globale et leur structure à basse résolution en solution. Les études de solution des protéines membranaires nécessitent la stabilisation de molécules comme les détergents. Cette technique a l’avantage de rendre les détergents invisibles et met en évidence le signal de la protéine membranaire.Les implications de cette technique s’étendent à de nombreuses questions de recherche biologique et médicale parce que plus de 1/3 des protéines résident dans des membranes où elles remplissent de nombreuses fonctions cellulaires vitales. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’étiquetage du deutérium et de diffusion des neutrons sont difficiles à apprendre parce que très peu d’institutions offrent une formation sur ces techniques. Pour commencer, déterminez les densités de longueur de diffusion neutronique ou les MDS à l’aide de l’application Web MULCh, modules pour l’analyse des données de variation de contraste.Ouvrez le module de contraste en cliquant sur le contraste situé dans le volet de navigation gauche. Fournissez du texte pour un titre de projet et entrez les détails ci-dessous pour deux composants comme sous-unité un et sous-unité deux. Entrez la formule moléculaire pour chaque composant dans la boîte de texte de formule.Entrez ensuite le volume dans des angstroms cubiques pour chaque composant de la boîte en dessous du volume. Enfin, entrez les détails des composants tampons. Cliquez sur soumettre pour effectuer les calculs de contraste neutronique.Une page de résultats est générée qui fournit un tableau de la densité de la longueur de diffusion et des points de correspondance de contraste ainsi que des formules pour déterminer ces paramètres à un pourcentage donné de D2O dans le tampon. Examinez les paramètres de diffusion avec une attention particulière aux points de correspondance de contraste des composants. Cultiver des cellules E.coli abritant un vecteur d’expression inductible pour la séquence protéique cible dans le milieu LB à une densité optique à 600 nanomètres ou OD 600 d’environ un.Adapter les cellules E.coli au deutérium étiqueté moyen avant de passer à l’expression d’une protéine délétérée en diluant la culture LB d’un à 20 millilitres de milieu minimal. Après avoir augmenté à un OD 600 d’environ un, répéter l’une à 20 dilutions en utilisant un milieu minimal contenant 50, 75, et 100%D2O. Une fois adapté, continuer à cultiver la culture dans un bioréacteur pour augmenter le rendement de la masse cellulaire stérilisé.À mesure que la teneur en D2O sera augmentée, les taux de croissance diminueront. Procéder à la récolte, la lyse et purifier les cellules comme décrit dans le protocole texte. Equilibrer ensuite une colonne d’exclusion de taille avec plus de deux volumes de colonne de tampon d’échange final à l’aide d’un système de chromatographie liquide protéique rapide.Après l’injection de l’échantillon, exécutez la colonne en fractions d’isolement correspondant à la protéine d’intérêt. Réservez un aliquot de tampon assorti pour la diffusion neutronique à petit angle ou la soustraction sans fond. Pour recueillir des données SANS, chargez d’abord des échantillons et des tampons dans les cellules de quartz.Après s’être assuré que l’obturateur du faisceau est fermé, approchez de la zone de l’environnement de l’échantillon et placez les cellules de quartz dans le changeur d’échantillon. Enregistrez la position de changeur d’échantillon pour chaque cellule d’échantillon. Vérifiez la zone et assurez-vous que le chemin du faisceau est exempt d’obstruction avant de quitter la zone de l’environnement de l’échantillon.Ensuite, ouvrez l’obturateur de faisceau. Exécutez une analyse de table pour la collecte automatisée de données. Suivez les instructions pour le fonctionnement des instruments fournies par le scientifique de diffusion des neutrons.Utilisez le logiciel Mantid Plot et le script Python pour réduire les données SANS d’une image 2D à une intrigue 1D. Pour ce faire, connectez-vous au cluster d’analyse à distance et exécutez le tracé Mantid à partir de la ligne de commande. Ouvrez ensuite le script de réduction utilisateur fourni et placez les numéros d’analyse ou l’identification correspondants pour l’échantillon en paires tampons dans la liste appropriée.Exécutez le script pour générer des données réduites sous forme de fichier texte à quatre colonnes dans l’emplacement spécifié. Cliquez à droite sur l’espace de travail approprié et l’intrigue Mantid et sélectionnez l’intrigue avec des erreurs pour un examen initial des profils de diffusion. Téléchargez la suite logicielle ATSAS et utilisez PRIMUS pour la traçage des données, la mise à l’échelle tampon et la soustraction et l’analyse Guinier.Lancez l’application d’analyse de données ATSAS, SAS et chargez les fichiers de données réduits correspondant à la paire d’échantillons et de tampons. Pour bien mettre à l’échelle le tampon, sélectionnez la plage de données à Q élevé où les deux profils sont similaires en plat et cliquez sur le bouton échelle situé sous l’onglet opérations. Augmentez la plage de données pour afficher tous les points, cliquez sur soustraire pour effectuer cette opération.Effectuer une analyse Guinier des données de l’échantillon soustrait tampon à l’aide de l’onglet analyse de l’application d’analyse de données SAS. Assurez-vous que le fichier approprié est sélectionné dans la liste et cliquez sur le rayon de gyration. Une tentative automatisée d’effectuer un ajustement Guinier sera fournie en cliquant sur le bouton RG automatique.Élargissez la gamme de données utilisées pour inclure toutes les données Q faibles et commencez à réduire la plage de données en en prenant des points Q élevés jusqu’à ce que la limite de Q max times RG soit inférieure à 1,3. Utilisez la parcelle de résidus pour vérifier que les données sont linéaires dans la plage d’ajustement. Faites de petits ajustements à la région d’ajustement et surveillez la sensibilité de ces valeurs à la gamme de données utilisées dans l’ajustement.Obtenez la fonction de distribution de probabilité P de R dans le gnome. Maintenant, démarrez l’assistant de distribution à distance dans l’onglet analyse. L’obtention d’un bon ajustement aux données est essentielle à l’obtention d’un modèle de qualité.Déterminer Dmax, la distance interatomique maximale à l’intérieur de la molécule. Estimez une valeur pour Dmax en décochant la boîte pour forcer Rmax égale zéro et en entrant une grande valeur pour Dmax. La première interception X dans la parcelle de P de R donne cette estimation.Apporter des modifications incrémentielles à cette valeur Dmax ainsi qu’à la gamme de données utilisées pour le nombre de points utilisés pour optimiser l’ajustement du gnome aux données et à la courbe P de R qui en résulte. Démarrez l’assistant de forme PRIMUS à partir du bouton dammif sur l’onglet analyse de l’analyse des données SAS et utilisez une sélection manuelle des paramètres. Définissez la gamme Guinier de l’ajustement et passez à l’étape suivante à l’aide des boutons de navigation.Définissez les valeurs d’ajustement de la parcelle P de R et passez à l’étape suivante. Fournir des paramètres pour le processus de modélisation ab initio. Lancez ensuite le processus à l’aide du bouton commit.Superposez et superposez l’enveloppe finale sans avec un modèle haute résolution connexe à l’aide de supcomb dans ATSAS. Placez une copie du modèle PDB haute résolution pour être adapté à l’enveloppe SANS dans l’annuaire de travail. Exécutez ensuite supcomb à partir de la ligne de commande en utilisant les noms de fichiers PDB comme deux arguments avec la structure de modèle énumérée en premier.Enfin visualiser les résultats du modèle ab initio à l’aide de PyMOL, un programme de visualisation graphique moléculaire 3D. Une fois que l’enveloppe SANS et la structure haute résolution ont été superposées, ces modèles peuvent être visualisés à l’aide de n’importe quel programme de visualisation graphique moléculaire. Un aperçu du processus de visualisation PyMOL est affiché.Une fois que les fichiers de structure PDB ont été ouverts dans PyMOL, les modèles doivent être visibles dans la fenêtre de visionneuse PyMOL. Les représentations de chaque modèle peuvent être modifiées à l’aide du bouton S à côté de chaque nom de fichier. Ici, une représentation de surface est utilisée pour l’enveloppe SANS et une représentation de dessin animé est utilisée pour l’épine dorsale protéique du modèle haute résolution.Un schéma de couleurs approprié peut être sélectionné parmi les options disponibles sous le bouton C. Pour les chaînes protéiques, une coloration à arc à chaîne fournit un gradient de couleur du terminus N à C pour faciliter l’interprétation. La transparence est appliquée à la représentation de surface pour permettre une meilleure visualisation de la structure protéique dans l’enveloppe.Pour les images de publication, un fond blanc est recommandé. Une fois que ces repères de visualisation ont été appliqués, les structures 3D peuvent être examinées en cliquant et en faisant glisser la structure. Des manipulations de la perspective et de la rotation et de la traduction des molécules peuvent être effectuées.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de faire correspondre avec précision le contraste neutronique de la tête de détergent et les groupes de queue avec le solvant D2O H2O. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à l’exploration de la structure des protéases asparto intramembranes. Ces protéines sont impliquées dans la réponse immunitaire, l’hépatite C et la maladie d’Alzheimer.N’oubliez pas que travailler dans des laboratoires biochimiques et dans des installations à faisceaux de neutrons peut être dangereux. Des précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle et le suivi de toutes les règles de sécurité et des affichages radiologiques des installations sont obligatoires lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Recherche

Biochimie

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Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Détection de détergent-sensibles aux Interactions entre les protéines membranaires

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Exempt de calibration In Vitro la Quantification des protéines Homo-oligomérisation à l’aide d’instruments commerciaux et Open Source gratuit, logiciel d’analyse de luminosité

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Études structurale des macromolécules en Solution à l’aide de petite diffusion des rayons x Angle

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse de repliement des protéines, des transports et dégradation dans les cellules vivantes par radioactifs Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Chromatographie d’échange ionique (IEX) couplée à la diffusion de la lumière multi-angle (MALS) pour la caractérisation et la séparation de protéines

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caractérisation des protéines par chromatographie d'exclusion couplée à multi-angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...