Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Das Büro von biologischen und Umweltforschung unterstützt Forschung im ORNL Center für strukturelle Molekularbiologie (CSMB) und Bio-SANS mit Einrichtungen, unterstützt durch die wissenschaftlichen Nutzer Einrichtungen Division, Office Basic Energiewissenschaften, US Department der Energie. Strukturarbeiten am Membranproteine im Labor Lieberman wurde von NIH (DK091357, GM095638) unterstützt und NSF (0845445).

1. vorbereiten und ein Neutron Facility Strahlzeit und Instrument Vorschlag einreichen
<ol><li>Finden Sie Online-Ressourcen zur Identifizierung von Neutronen-Streuung Einrichtungen, die allgemeine Neutron Lichtstrahl Zeit Benutzerzugriff, wie Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Eine Karte der Neutron-Einrichtungen und Informationen über Neutronenforschung weltweit ist online verfügbar. Beachten Sie 46 , dass diese Einrichtungen in der Regel regelmäßige Aufforderungen zur Einreichung von Vo...

Strukturbiologie Forscher nutzen Sie ergänzende strukturelle Techniken wie Lösung Streuung, Biochemische und strukturelle Details (z. B. Größe und Form) von Biomolekülen in Lösung zu erhalten. SANS ist eine besonders attraktive Technik zur Bestimmung geringer Auflösung Strukturen von Membranproteinen, ein Schwerpunkt der modernen Strukturbiologie und Biochemie. SANS erfordert Mengen der gereinigten Proteine vergleichbar mit denen von kristallographischen Studien (1 mg/Probe). Die vor kurzem wachsende kommerzielle ...

Membranproteine sind um schätzungsweise 30 % aller Gene1 codiert und repräsentieren eine deutliche Mehrheit der Ziele für die modernen Arzneimitteln. 2 diese Proteine führen eine Vielzahl von lebenswichtigen Zellfunktionen,3 aber trotz ihrer Fülle und ihrer Bedeutung – nur etwa 1 % der gesamten Strukturen hinterlegt in der Forschung Collaboratory für strukturelle Bioinformatik (RCSB) Protein darstellen Daten Bank. 4 aufgrund ihrer teilweise hydrophoben Natur, Strukturaufklärung von Proteinen, Membrane-springen überaus schwierig wurde. 5 , 6 , 7
Wie viele biophysikalische Techniken Monodisperse Partikel in Lösung für die Messung erforderlich, wurde Membranproteine von native Membranen zu isolieren und stabilisiert diese Proteine in eine lösliche Mimik der native Membranen ein aktives Gebiet der Forschung in den letzten Jahren Jahrzehnten. 8 , 9 , 10 diese Untersuchungen zur Entwicklung der vielen neuartigen AMPHIPHILE Baugruppen führten zu solubilisieren Membranproteine, wie Nanodiscs,11,12,13 Bicelles14,15 und Amphipols. 16 , 17 bleibt jedoch die Verwendung von Reinigungsmittel Micellen einer der am weitesten verbreitete und einfache Ansätze für die Erfüllung der Anforderungen der Löslichkeit eines gegebenen Proteins. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 leider gibt es kein einziges Reinigungsmittel oder magische Mischung von Reinigungsmitteln derzeit, die alle Membranproteine gerecht wird; Diese Bedingungen müssen daher empirisch für die individuellen Anforderungen jedes Protein kontrolliert werden. 26 , 27
Reinigungsmittel selbst-zusammenbauen in Lösung über ihre kritischen Micelle Konzentration zu aggregieren Strukturen Mizellen genannt. Mizellen bestehen aus vielen Waschmittel Monomere (in der Regel im Bereich von 20-200) mit hydrophoben Alkyl-Ketten bilden eine Micelle Kern- und hydrophilen Kopfgruppen angeordnet in einem Micelle Shell Layer mit Blick auf das wässrige Lösungsmittel. Das Verhalten von Waschmitteln und Micelle Bildung wurde von Charles Tanford in Der hydrophobe Effekt,28 und Größen klassisch beschrieben und Formen von Micellen aus häufig verwendeten Reinigungsmittel in Membran-Protein-Studien wurden mit kleinen Winkel Streuung charakterisiert. 29 , 30 Waschmittel Organisation über Membranproteine wurde ebenfalls untersucht, und die Bildung von Protein-Reinigungsmittel-komplexen (PDCs) dürfte mit Waschmittel Moleküle, die rund um das Protein in einer Anordnung, die das ordentliche Waschmittel ähnelt Mizellen. 31
Eine hinzugefügte Vorteil bei der Verwendung von Reinigungsmitteln ist, dass die resultierenden Micelle Eigenschaften bearbeitet werden können, durch die Integration von anderen Waschmitteln. Viele Waschmittel weisen ideale mischen, und wählen Sie Eigenschaften von gemischten Micellen können sogar vorhergesagt werden, von den Komponenten und Verhältnis zu mischen. 22 jedoch kann das Vorhandensein von Waschmittel noch für biophysikalische Charakterisierungen Herausforderungen beitragen, das gesamte Signal. Signal von Waschmittel in der PDC ist beispielsweise mit Röntgen- und Lichtstreuung Techniken, praktisch nicht von Protein. 32 Untersuchungen mit einzelnen Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) verlassen in der Regel auf eingeschlossene Partikel (gefroren); strukturelle Details des Proteins sind noch verdeckt durch bestimmte Reinigungsmittel oder eine hohe Konzentration des Reinigungsmittels, der Hintergrund verleiht. 33 alternative Ansätze zur Interpretation der vollen PDC-Struktur (inklusive Waschmittel) durch Berechnungsmethoden wurden unternommen, die darauf abzielen, das Waschmittel um einen bestimmten Membranprotein zu rekonstruieren. 34
Für den Fall der Neutronenstreuung produziert die Kern-Schale-Anordnung der Reinigungsmittel in der Micelle einen Formfaktor die beobachtete Streuung beiträgt. Glücklicherweise können Lösungskomponenten geändert werden, so dass sie nicht zu den net beobachtete Streuung beitragen. Dabei "Kontrast passend" erfolgt durch Substitution von Deuterium für Wasserstoff, eine Streuung Länge Dichte zu erreichen, die den Hintergrund (Puffer) übereinstimmt. Eine vernünftige Auswahl an Reinigungsmittel (mit verfügbaren deuterierte Gegenstücke) und ihr Verhältnis zu mischen müssen berücksichtigt werden. Für Waschmittel Micellen kann diese Substitution mit einem Waschmittel mit der gleichen Kopf Gruppe aber eine deuterierte Alkyl Kette (d-Tail statt h-Tail) durchgeführt werden. Da das Waschmittel gut gemischt sind,35 ihrer Aggregate haben eine Streuung Länge Dichte, die Mole-Fraktion gewichtete Durchschnitt der beiden Komponenten (h-Schwänzen und d-Tails). Wenn diese durchschnittliche Kontrast mit derjenigen der Kopfgruppe konsistent ist, können einheitlichen aggregierten Strukturen voll abgestimmt werden, um alle Beiträge zu beobachtete Streuung zu entfernen.
Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, um das Neutron Kontrast von Waschmittel Micellen zu manipulieren, durch den Einbau von chemisch identisch Waschmittel Moleküle mit Deuterium-Label Alkyl-Ketten. 19 , 36 , 37 das komplette Simultankontrast Anpassung der Micelle Kern und Schale, die eine einzigartige Fähigkeit der Neutronenstreuung ist erlaubt. 35 , 38 mit dieser deutlich verfeinert Detailebene, passender Kontrast aktivieren kann sonst nicht machbar Studien von Membran-Protein-Strukturen. Darüber hinaus könnte dieser Kontrast-matching-Ansatz auf andere Systeme mit Waschmittel wie Polymer Austausch Reaktionen39 und Öl-Wasser-Dispergiermittel,40 oder sogar andere solubilizing Mittel, wie Bicelles,41 ausgeweitet werden Nanodiscs,42 oder Block-Copolymere. 43 A ähnlicher Ansatz wie in dieser Handschrift, aber mit einer einzigen Waschmittel Spezies mit teilweise Deuterium Substitutionen auf die Alkylgruppe Kette und/oder Kopf wurde vor kurzem veröffentlicht. 37 während dies erwartet werden kann, um die zufällige Verteilung von Wasserstoff und Deuterium in das Waschmittel zu verbessern im Vergleich zu der hier vorgestellte Ansatz der begrenzten Anzahl der verfügbaren Positionen auf das Waschmittel für Substitution und in zwei Schritten Waschmittel Synthese benötigt zusätzliche Herausforderungen für die Prüfung.
Schritte 1 und 2 des Protokolls unten oft überschneiden sich da erstes Experiment Planung erfolgen muss, um eine Qualität Vorschlag zu unterbreiten. Antragstellung gilt jedoch hier als der erste Schritt zu betonen, dass dieser Prozess im Vorfeld ein Neutron-Experiment gestartet werden soll. Anzumerken ist, dass ein erforderlicher Schritt, der durch den Vorschlag nachgewiesen werden sollte, ist, biochemischen und physikalischen Charakterisierung (einschließlich Reinheit und Stabilität) der Probe die Notwendigkeit Neutron Untersuchungen zu unterstützen. Eine allgemeine Diskussion über kleine Winkel Neutronen-Streuung (SANS) sprengt den Rahmen dieses Artikels. Eine kurze, aber gründliche Einführung gibt es in der Referenzarbeit, die Charakterisierung der Materialien von Kaufmann,44 und eine umfassende Lehrbuch konzentrierte sich auf biologische kleine Winkel Lösung Streuung vor kurzem veröffentlicht worden. 45 weitere Buchempfehlungen ist im Abschnitt Diskussion gegeben. Kleine Winkel Streuung verwendet die so genannten Streuung Vektor Q als zentrale Menge, die die Streuung Prozess beschreibt. Dieser Artikel verwendet die allgemein akzeptierte Definition Q = 4π Sünde (θ) / λ, wo θ halbe Winkel zwischen eingehenden und verstreuten Strahl und λ ist ist die Wellenlänge der Neutronenstrahlung in Angström. Andere Definitionen existieren, verwenden Sie verschiedene wie z. Symbole b. die "für die Streuung Vektor, und dass durch einen Faktor 2π oder mithilfe von Nanometern anstelle von Angstrom abweichen kann (siehe auch Diskussion der Abbildung 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

Das biologische Small-Angle Neutron Streuung Instrument in der High-Flux-Isotope Reaktor des Oak Ridge National Laboratory ist widmet sich der Erforschung der biologischen Materialien, Biokraftstoff, die Verarbeitung und Bioinspirierte Materialien für Nanometer Mikrometer Längenskalen. Für die Untersuchung der physikalischer Eigenschaften (z.B. Größe und Form) von Membranproteinen hier vorgestellten Methoden (hier, MmIAP, eine Intramembrane Aspartyl-Protease aus Methanoculleus Marisnigri) in Lösungen von Micelle bildenden Reinigungsmittel sind gut geeignet für dieses kleine Winkel Neutronen-Streuung Instrument, unter anderem. Ndere biophysikalische Charakterisierung sind durch ihre Unfähigkeit, die Waschmittel Beiträge in einer komplexen Struktur von Protein-Reinigungsmittel Adresse behindert. Darüber hinaus bietet Zugriff auf die Bio-Deuterierung Labor einzigartige Fähigkeiten für die Vorbereitung der großflächige Anbau und Deuterium-markierten Proteine für verbesserte streusignal aus dem Protein zum Ausdruck zu bringen. Während diese Technik bietet keine strukturelle Details in hoher Auflösung, die strukturelle Wissenslücke für Membranproteine enthält viele adressierbare Bereiche der Forschung ohne in der Nähe von atomarer Auflösung. Beispielsweise enthalten diese Bereiche Bestimmung der Oligomere Staaten, Komplexbildung, Konformationsänderungen bei Störung und Faltung/Entfaltung Ereignisse. Diese Untersuchungen können leicht durch Anwendungen dieser Methode erreicht werden.

Ein Strahl Zeit und Instrument Vorschlag sollte eindeutig vermitteln alle Informationen benötigt, um die Review Committee, dass eine gültige vorgeschlagene Experiment beurteilt werden können. Kommunikation mit einem NSS ist für unerfahrene Anwender dringend empfohlen. Die NSS kann erste Machbarkeit und Führer Antragstellung, Machbarkeit, Sicherheit und das Potenzial für hohe Schlagzähigkeit Wissenschaft betonen beurteilen. Die Angaben in dem Vorschlag gehören Hintergrundinformatio...

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Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie ein Modell mit niedriger Auflösung ab-initio und Strukturdetails Waschmittel solubilisiert Membranprotein in Lösung mit kleinen Winkel Neutronenstreuung mit Kontrast-matching des Waschmittels zu erhalten.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über integrale Membranproteine wie den oligomeren Zustand, ihre Größe, Gesamtform und niedrige Auflösung Struktur in Lösung zu beantworten. Lösungsstudien von Membranproteinen erfordern stabilisierende Moleküle wie Waschmittel. Diese Technik hat den Vorteil, dass sie Waschmittel unsichtbar macht und das Signal des Membranproteins hervorhebt.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf viele biologische und medizinische Forschungsfragen, da über 1/3 der Proteine in Membranen liegen, wo sie viele lebenswichtige zelluläre Funktionen ausführen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Deuterium-Etikettierungs- und Neutronenstreuungsschritte schwer zu erlernen sind, da nur sehr wenige Institutionen Schulungen in diesen Techniken anbieten. Bestimmen Sie zunächst Neutronenstreuungslängendichten oder SLDs mithilfe der Webanwendung MULCh, Modulen zur Analyse von Kontrastvariationsdaten.Öffnen Sie das Kontrastmodul, indem Sie im linken Navigationsbereich auf Kontrast klicken. Geben Sie Text für einen Projekttitel an, und geben Sie die folgenden Details für zwei Komponenten als Untereinheit eins und Untereinheit zwei ein. Geben Sie die Molekularformel für jede Komponente in das Formeltextfeld ein.Geben Sie dann das Volumen in kubischen Angstroms für jede Komponente in das Feld unterhalb des Volumens ein. Geben Sie schließlich die Details für Pufferkomponenten ein. Klicken Sie auf Senden, um die Neutronenkontrastberechnungen durchzuführen.Es wird eine Ergebnisseite generiert, die eine Tabelle mit Streulängendichte und Kontrastübereinstimmungspunkten sowie Formeln zum Bestimmen dieser Parameter zu einem beliebigen Prozentsatz von D2O im Puffer bereitstellt. Überprüfen Sie die Streuparameter unter besonderer Berücksichtigung der Übereinstimmungspunkte des Komponentenkontrasts. Wachsen Sie E.coli-Zellen, die einen induzierbaren Expressionsvektor für die Zielproteinsequenz im LB-Medium auf eine optische Dichte von 600 Nanometern oder OD 600 von etwa einem enthalten.Passen Sie E.coli-Zellen an Deuterium-markiertes Medium an, bevor Sie sich für die Überexpression eines deuterated Proteins vergrößern, indem Sie die LB-Kultur ein bis 20 in drei Milliliter neines Mediums verdünnen. Nach dem Wachstum auf eine OD 600 von etwa einem, wiederholen Sie die ein bis 20 Verdünnungen mit minimalen Medium mit 50, 75 und 100%D2O. Nach der Anpassung, weiter die Kultur in einem Bioreaktor wachsen, um die Ausbeute der deuterated Zellmasse zu erhöhen.Wenn der D2O-Gehalt erhöht wird, werden die Wachstumsraten sinken. Fahren Sie mit der Ernte, Lyse und Reinigung der Zellen fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes gleicht eine Größenausschlussspalte mit mehr als zwei Spaltenvolumina des endgültigen Austauschpuffers mithilfe eines schnellen Proteinflüssigkeitschromatographiesystems aus.Führen Sie die Säule nach der Injektion der Probe in Isolatfraktionen aus, die dem Protein von Interesse entsprechen. Reservieren Sie ein Aliquot des übereinstimmenden Puffers für die Kleinwinkel-Neutronenstreuung oder SANS-Hintergrundsubtraktion. Um SANS-Daten zu sammeln, laden Sie zunächst Proben und Puffer in Quarzzellen.Nachdem Sie sichergestellt haben, dass der Balkenverschluss geschlossen ist, nähern Sie sich dem Probenumgebungsbereich und legen Sie die Quarzzellen in den Probenwechsler. Zeichnen Sie die Position des Probenwechslers für jede Beispielzelle auf. Überprüfen Sie den Bereich, und stellen Sie sicher, dass der Balkenweg frei von Hindernissen ist, bevor Sie den Probenumgebungsbereich verlassen.Öffnen Sie dann den Balkenverschluss. Führen Sie einen Tabellenscan für die automatisierte Datenerfassung aus. Befolgen Sie die Anweisungen für den Instrumentenbetrieb des Neutronenstreuers.Verwenden Sie Mantid Plot-Software und Python-Skript für die Reduzierung von SANS-Daten von einem 2D-Bild auf ein 1D-Plot. Melden Sie sich dazu beim Remoteanalysecluster an und führen Sie das Mantid-Plot über die Befehlszeile aus. Öffnen Sie dann das bereitgestellte Benutzerreduktionsskript und platzieren Sie die entsprechenden Scannummern oder Identifikationen für die Probe in Pufferpaaren in der entsprechenden Liste.Führen Sie das Skript aus, um reduzierte Daten als vierspaltende Textdatei am angegebenen Speicherort zu generieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den entsprechenden Arbeitsbereich und das Mantid-Plot und wählen Sie das Diagramm mit Fehlern für eine erste Untersuchung der Streuprofile aus. Laden Sie die ATSAS-Software-Suite herunter und verwenden Sie PRIMUS für Datenplotierung, Pufferskalierung und Subtraktion sowie Guinier-Analyse.Starten Sie die ATSAS-, SAS-Datenanalyseanwendung und laden Sie die reduzierten Datendateien, die dem Beispiel- und Pufferpaar entsprechen. Um den Puffer richtig zu skalieren, wählen Sie den Datenbereich bei hoch Q aus, in dem beide Profile in flacher Ebene ähnlich sind, und klicken Sie auf die Skalierungsschaltfläche unter der Registerkarte Operationen. Erhöhen Sie den Datenbereich, um alle Punkte anzuzeigen, klicken Sie auf Subtrahieren, um diesen Vorgang auszuführen.Führen Sie eine Guinier-Analyse der puffersubtrahierten Beispieldaten mithilfe der Registerkarte Analyse der SAS-Datenanalyseanwendung durch. Stellen Sie sicher, dass die richtige Datei in der Liste ausgewählt ist, und klicken Sie auf den Kreiselradius. Ein automatisierter Versuch, eine Guinier-Passung durchzuführen, wird durch Klicken auf die Auto RG-Schaltfläche bereitgestellt.Erweitern Sie den Datenbereich, der verwendet wird, um alle niedrigen Q-Daten einzubeziehen, und beginnen Sie mit der Eingrenzung des Datenbereichs, indem Sie hohe Q-Punkte wegnehmen, bis die Q-maximale RG-Grenze unter 1,3 liegt. Verwenden Sie das Diagramm der Residuen, um zu überprüfen, ob die Daten im Anpassungsbereich linear sind. Nehmen Sie kleine Anpassungen am Anpassungsbereich vor, und überwachen Sie die Empfindlichkeit dieser Werte für den in der Anpassung verwendeten Datenbereich.Erhalten Sie die Wahrscheinlichkeitsverteilungsfunktion P von R in gnome. Starten Sie nun den Entfernungsverteilungs-Assistenten auf der Registerkarte Analyse. Eine gute Anpassung an die Daten ist für die Erzielung eines Qualitätsmodells unerlässlich.Bestimmen Sie Dmax, den maximalen interatomaren Abstand innerhalb des Moleküls. Schätzen Sie einen Wert für Dmax, indem Sie das Kontrollkästchen deaktivieren, um Rmax zu erzwingen, gleich Null, und einen großen Wert für Dmax eingeben. Das erste X-Abfangen im Plot von P von R ergibt diese Schätzung.Nehmen Sie inkrementelle Änderungen an diesem Dmax-Wert sowie den Datenbereich vor, der für die Anzahl der Punkte verwendet wird, die verwendet werden, um die Gnome-Anpassung an die Daten und die resultierende P-Kurve der R-Kurve zu optimieren. Starten Sie den PRIMUS-Shape-Assistenten über die Dammif-Schaltfläche auf der Registerkarte Analyse der SAS-Datenanalyse, und verwenden Sie eine manuelle Auswahl von Parametern. Definieren Sie den Guinier-Bereich von der Passung und fahren Sie mit den Navigationsschaltflächen zum nächsten Schritt fort.Definieren Sie Anpassungswerte aus dem P-Plot von R, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Geben Sie Parameter für den ab initio Modellierungsprozess an. Starten Sie dann den Prozess mit der Commit-Schaltfläche.Überlagern und überlagern Sie den endgültigen Sans-Umschlag mit einem zugehörigen hochauflösenden Modell, das Supcomb in ATSAS verwendet. Platzieren Sie eine Kopie des heuschlösen PDB-Modells, um an den SANS-Umschlag im Arbeitsverzeichnis anzupassen. Führen Sie dann supcomb von der Befehlszeile aus mit den PDB-Dateinamen als zwei Argumente mit der zuerst aufgeführten Vorlagenstruktur aus.Schließlich visualisieren Sie die Ergebnisse des ab initio-Modells mit PyMOL, einem 3D-Molekulargrafik-Anzeigeprogramm. Sobald der SANS-Umschlag und die hochauflösende Struktur überlagert wurden, können diese Modelle mit jedem molekularen Grafikanzeigeprogramm visualisiert werden. Eine Übersicht über den PyMOL-Visualisierungsprozess wird angezeigt.Sobald die PDB-Strukturdateien in PyMOL geöffnet wurden, sollten die Modelle im PyMOL-Viewer-Fenster sichtbar sein. Die Darstellungen jedes Modells können über die S-Schaltfläche neben jedem Dateinamen geändert werden. Hier wird eine Oberflächendarstellung für den SANS-Umschlag und eine Cartoon-Darstellung für das Protein-Backbone des hochauflösenden Modells verwendet.Aus den unter der C-Taste verfügbaren Optionen kann ein passendes Farbschema ausgewählt werden. Für Proteinketten bietet eine Kettenbogenfärbung einen Farbverlauf von N nach C Endstation, um die Interpretation zu unterstützen. Transparenz wird auf die Oberflächendarstellung angewendet, um eine bessere Visualisierung der Proteinstruktur innerhalb der Hülle zu ermöglichen.Für Publikationsbilder wird ein weißer Hintergrund empfohlen. Sobald diese Visualisierungshinweise angewendet wurden, können die 3D-Strukturen durch Anklicken und Ziehen der Struktur untersucht werden. Manipulationen der perspektivischen und Molekülrotation und -übersetzung können durchgeführt werden.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, den Neutronenkontrast der Waschmittelkopf- und Schwanzgruppen genau mit dem D2O H2O Lösungsmittel abzugleichen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Erforschung der Struktur der Intramembran-Asparto-Proteasen. Diese Proteine sind an der Immunantwort, Hepatitis C und Alzheimer-Krankheit beteiligt.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit in biochemischen Laboratorien und in Neutronenstrahlanlagen gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und die Befolgung aller Sicherheitsvorschriften und radiologischen Entsendungen sind bei der Durchführung dieses Verfahrens obligatorisch.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

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Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle Studien von Makromolekülen in Lösung mit kleinen Winkel Röntgenstreuung

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionenaustausch-Chromatographie (IEX) gekoppelt an Multiwinkel Lichtstreuung (MALS) für Protein Trennung und Charakterisierung

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Charakterisierung von Proteinen durch Größen-Ausschluss-Chromatographie gekoppelt an Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...