Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

המשרד של ביולוגי, המחקר הסביבתי נתמכת מחקר במרכז של ORNL ביולוגיה מולקולרית מבנית (CSMB), ביו-SANS באמצעות מתקני נתמך על ידי מדעי משתמש מתקני החלוקה, Office Basic אנרגיה למדעים, מחלקת אותנו של אנרגיה. עבודה מבניים על קרום חלבונים במעבדה ליברמן בתמיכתם NIH (DK091357, GM095638), ה-NSF (0845445).

1. להכין ולהגיש ניוטרון מתקן קרן ושעה כלי הצעה
<ol><li>התייעץ עם משאבים מקוונים לזיהוי ניוטרון פיזור מתקנים המאפשרים כללי למשתמש ניוטרון קרן זמן גישה, כגון אוק רידג הלאומית מעבדה (ORNL). מפה של נייטרונים מתקני ומידע אודות ניוטרון מחקר ברחבי העולם זמין באינטרנט. 46 להיות מודע כי מתקנ?...

החוקרים בביולוגיה מבנית לנצל משלימים טכניקות מבניים כמו פתרון פיזור להשיג פרטים הביוכימי ומבניים (כגון הכולל גודל וצורה) של מולקולות בפתרון. SANS הוא טכניקה אטרקטיביים במיוחד לצורך קביעת מבנים ברזולוציה נמוכה של קרום חלבונים, מוקד הליבה של ביולוגיה מבנית מודרנית וביוכימיה. SANS דורשת כמויות...

קרום חלבונים מקודדים של % 30 המשוערת של גנים כל1 , מייצגים את רוב מטרות עבור תרופות מרפא מודרניים חזקים. 2 חלבונים אלה לבצע מגוון רחב של פונקציות חיוני הסלולר,3 אך למרות שפע וחשיבות שלהם – מייצג רק כ 1% של מבנים הכולל שהופקדו Collaboratory המחקר עבור חלבון ביואינפורמטיקה מבנית (RCSB) בנק מידע. 4 בשל טבעם הידרופובי חלקית, נחישות מבנית של חלבוני ממברנה מכורך כבר מאוד מאתגר. 5 , 6 , 7
טכניקות רבות biophysical דרוש monodisperse חלקיקים בתמיסה למדידה, בידוד מהחלבונים ממברנה מקורית ממברנות וייצוב חלבונים אלה ב לחקות מסיסים של הממברנות מקורי היה שטח פעיל של מחקר האחרונים עשורים. 8 , 9 , 10 חקירות אלה הובילו לפיתוח של הרכבות amphiphilic הרומן רבים solubilize קרום חלבונים, כגון nanodiscs,11,12,bicelles13 ,14,15 , amphipols. 16 , 17 . עם זאת, השימוש הקזאין דטרגנט נשאר לאחת הגישות הנפוצות ביותר וברור מספק את הדרישות מסיסות של חלבון נתון. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . למרבה הצער, אין סבון יחיד או תערובת הקסם של דטרגנטים כיום קיימת המקיים את כל החלבונים ממברנה; לפיכך, התנאים האלה בטח מדעית שיוקרנו הדרישות הייחודיות של כל חלבון. 26 , 27
חומרי ניקוי עצמי להרכיב בפתרון מעל שלהם ריכוז קריטי מיצלה למבנים צבירה טופס שנקרא הקזאין. הקזאין המורכבות הרבה מונומרים דטרגנט (בדרך כלל בטווח שבין 20-200) עם שרשראות הידרופוביות אלקיל ויוצרים גרעין מיצלה וקבוצות ראש הידרופילית מסודרים בשכבה מעטפת מיצלה מול הממס מימית. ההתנהגות של חומרי ניקוי, היווצרות מיצלה שתיארנו בסגנון קלאסי על ידי צ'ארלס Tanford אפקט הידרופובי,28 , גדלים, צורות של הקזאין של דטרגנטים נפוץ במחקרים חלבון ממברנה היה מאופיין באמצעות פיזור זווית קטנה. 29 , 30 דטרגנט הארגון על קרום חלבונים גם נחקר, וצפויה היווצרות של חלבונים-דטרגנט מתחמי (שיתפקדו) עם מולקולות דטרגנט המקיפים את החלבון בהסדר הדומה הנוזל מסודר הקזאין. 31
אחד הוסיף היתרון בשימוש חומרי ניקוי היא כי ניתן לטפל המאפיינים מיצלה הנוצרת על-ידי שילוב חומרי ניקוי אחרות. חומרי ניקוי רבים שהפגינו ערבוב אידיאלי, אפילו ניתן לחזות בחר מאפייני הקזאין מעורבות מן הרכיבים ואת יחס של ערבוב. 22 . עם זאת, הנוכחות של דטרגנט יכול עדיין להציג אתגרים אפיוני biophysical בתרומה לחברה האות הכללית. לדוגמה, עם צילום רנטגן וטכניקות פיזור אור, האיתות דטרגנט ב PDC הוא כמעט להבחין מגניחותיה חלבון. 32 חקירות עם מיקרוסקופ יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרונים (הקפאה-EM) בדרך כלל לסמוך על לכוד חלקיקים (קפואים); פרטים מבניים של החלבון מעורפלים. עדיין דטרגנטים מסוימים או ריכוז גבוה של חומרי ניקוי המוסיף הרקע. 33 גישות חלופיות לקראת פענוח המבנה PDC מלאה (כולל הנוזל) נעשו באמצעות שיטות אשר מבקשים לשחזר הנוזל סביב חלבון ממברנה נתון. 34
במקרה של פיזור ניוטרון, הסידור ליבה-קליפה של דטרגנט בתוך מיצלה מייצרת גורם טופס אשר תורמת פיזור התצפיות. למרבה המזל, ניתן לשנות רכיבי פתרון כזה כי הם לא תורמים פיזור התצפיות נטו. תהליך זה "חדות התאמת" מושגת על ידי החלפת דאוטריום מימן להשיג צפיפות אורך פיזור המתאים של הרקע (מאגר). יש לקחת בחשבון בחירה הביוספירה של דטרגנט (עם עמיתיהם deuterated זמין) ואת היחס של ערבוב. עבור הקזאין דטרגנט, החלפה זו יכולה להתבצע באמצעות חומר ניקוי עם אותה הקבוצה בראש אבל העובדה שרשרת אלקיל deuterated (d-הזנב במקום h-הזנב). מאז חומרי ניקוי היטב מעורבת,35 אגרגטים שלהם יש צפיפות אורך פיזור זה השבר-השומה משוקלל ממוצע של שני הרכיבים (h-פלי ו d-פלי). כאשר זה הניגוד הממוצע של ראש הקבוצה, המבנים צבירה במדים ניתן להתאים באופן מלא כדי להסיר את כל התרומות כדי פיזור התצפיות.
אנו מציגים כאן פרוטוקול לתמרן את הניגוד ניוטרון של דטרגנט הקזאין על-ידי שילוב מולקולות דטרגנט מבחינה כימית זהה עם התווית על-ידי דאוטריום אלקיל שרשראות. 19 , 36 , 37 זה מתיר מהניגודים סימולטני התאמת מיצלה core ו- shell, אשר היא יכולת ייחודית של פיזור ניוטרון. 35 , 38 עם רמת פירוט מעודן באופן משמעותי, התאמת ניגודיות יכול לאפשר לימודים אחרת ישים מבני חלבון ממברנה. בנוסף, גישה זו התאמת ניגודיות אפשרות להאריך למערכות אחרות הקשורות דטרגנט, כגון פולימר חילופי תגובות39 ו שמן מים dispersants,40 או אפילו סוכנים אחרים, solubilizing, כגון bicelles,41 copolymers nanodiscs,42 או לחסום. גישה דומה 43 א כמתואר כתב יד זה, אבל העסקת זן דטרגנט יחיד עם החלפות חלקיות דאוטריום-אלקיל שרשרת ו/או ראש הקבוצה, יצא לאור לאחרונה. 37 בזמן זה צפויים לשפר את התפלגות אקראית של מימן, דאוטריום בכל רחבי הנוזל לעומת הגישה המובאת כאן, מספר מוגבל של משרות פתוחות על החומר ניקוי עבור החלפת ושני שלבים סינתזה דטרגנט נדרש מציבה אתגרים נוספים בתמורה.
שלבים 1 ו- 2 של פרוטוקול שיפורטו להלן לעתים קרובות חופפים מאז תכנון הניסוי הראשוני חייב להיעשות להגיש הצעה איכות. עם זאת, הצעת הגשה נחשב כאן בתור הצעד הראשון כדי להדגיש כי תהליך זה אמורה להתחיל הרבה לפני ניסוי ניוטרון. יש גם לציין כי צעד דרישה מוקדמת, אשר צריך ניתן להדגים על ידי ההצעה, הוא שתהיה הביוכימי ופיזית אפיון (כולל טוהר ויציבות) הדגימה התומכים בצורך לימודי ניוטרון. דיון כללי של זווית קטנה ניוטרון פיזור (SAN) חורג מהיקף מאמר זה. הקדמה קצרה אך יסודי זמין העבודה הפניה ואפיון של חומרים על ידי קאופמן,44 וספר לימוד ממוקד ביולוגי זווית קטנה פתרון מקיף פיזור שפורסם לאחרונה. 45 עוד המלצה לקריאה ניתנת במקטע דיון. זווית קטנה פיזור משתמש הווקטור פיזור שנקרא Q הכמות המרכזי המתאר את תהליך פיזור. מאמר זה משתמש בהגדרת נפוצה ומקובלת Q = חטא 4π (θ באמצעות) / λ, איפה θ באמצעות חצי הזווית בין קרן פזורים ונכנסות λ הוא אורך הגל של הקרינה ניוטרון ב אנגסטרום. הגדרות אחרות קיים שימוש שונה סמלים כגון של ' עבור וקטור פיזור, וכי עשויים להשתנות על ידי 2π פקטור או באמצעות ננומטר במקום אנגסטרום (ראה גם הדיון איור 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

המכשיר פיזור ביולוגי ניוטרון זווית קטנה במעבדה גבוהה השטף איזוטופ הכור של אלון רכס הלאומי מוקדש החקירה של חומרים ביולוגיים, biofuel עיבוד וחומרים בהשראה ביו כיסוי ננומטר ל מיקרומטר פיסיקליות. השיטות המובאות כאן על חקירת תכונות פיזיקליות (קרי, גודל וצורה) של קרום חלבונים (כאן, MmIAP, פרוטאז aspartyl intramembrane מן Methanoculleus marisnigri) בפתרונות של יוצרי מיצלה חומרי ניקוי? מתאים היטב לכלי פיזור זה זווית קטנה ניוטרון, בין היתר. טכניקות אחרות אפיון biophysical הם מוגבל בשל חוסר היכולת שלהם כדי לטפל דטרגנט סיועה של מבנה מורכב אבקת חלבון. בנוסף, גישה למעבדה ביו-Deuteration מספק יכולות ייחודיות הכנת cultivations בקנה מידה גדול ולבטא את התווית על-ידי דאוטריום חלבונים לאות פיזור משופר של החלבון. בזמן זה טכניקה אינו מספק פרטים מבניים ברזולוציה, הפער בידע מבניים קרום חלבונים מכיל הרבה תחומי המחקר למיעון ללא צורך ברזולוציה ליד-אטומית. לדוגמה, אזורים אלה לכלול נחישות של מדינות oligomeric, היווצרות מורכבות, שינויים הסתגלותי במהלך ההפרעות, קיפול/התגלגלות אירועים. חקירות אלה ניתן להשיג בקלות באמצעות יישומים של שיטה זו.

הצעה וזמן מכשיר קרן ברור צריך להעביר את כל המידע הדרוש לוועדה סקירה כך הערכה חוקית של הניסוי המוצע יכול להתבצע. תקשורת עם תוכנית השירות NSS הוא הציע מאוד עבור משתמשים לא מנוסים. תוכנית השירות NSS יכול להעריך היתכנות ראשונית ואת מדריך הקרן כדי להדגיש היתכנות, בטיחות, ואת הפוט?...

Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג דגם ברזולוציה נמוכה ab initio ופרטים מבנית של חלבון הממברנה solubilized-חומרי ניקוי בתמיסה באמצעות פיזור ניוטרון זווית קטנה עם התאמת ניגודיות של הנוזל.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על חלבוני קרום אינטגרליים כגון המצב האוליגומרי, גודלם, הצורה הכוללת ומבנה ברזולוציה נמוכה בפתרון. מחקרי פתרון של חלבוני קרום דורשים ייצוב מולקולות כמו חומרי ניקוי. לטכניקה זו יש יתרון שהיא הופכת חומרי ניקוי לבלתי נראים ומדגישה את האות מחלבון הממברנה.ההשלכות של טכניקה זו להרחיב שאלות מחקר ביולוגי ורפואי רבים כי מעל 1/3 של חלבונים שוכנים ממברנות שבו הם מבצעים פונקציות תאיות חיוניות רבות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו תיוג deuterium וצעדי פיזור נויטרונים קשה ללמוד כי מעט מאוד מוסדות מציעים הכשרה בטכניקות אלה. כדי להתחיל, לקבוע צפיפות אורך פיזור נויטרונים או SLDs באמצעות יישום האינטרנט MULCh, מודולים לניתוח של נתוני וריאציית ניגודיות.פתח את מודול החדות על-ידי לחיצה על חדות הממוקמת בחלונית הניווט הימנית. ספק טקסט עבור כותרת פרוייקט והזן את הפרטים שלהלן עבור שני רכיבים כיוניית משנה אחת וכותרת משנה שתיים. הזן את הנוסחה המולקולרית עבור כל רכיב בתיבת הטקסט של הנוסחה.לאחר מכן הזן את אמצעי האחסון באנגסטרום מעוקב עבור כל רכיב בתיבה שמתחת לאמצעי האחסון. לבסוף, הזן את הפרטים עבור רכיבי מאגר. לחץ על שלח כדי לבצע את חישובי ניגודיות הנייטרונים.נוצר דף תוצאות המספק טבלה של צפיפות אורך פיזור ונקודות התאמה של ניגודיות וכן נוסחה לקביעת פרמטרים אלה בכל אחוז נתון של D2O במאגר. סקור את הפרמטרים המתפזרים עם תשומת לב מיוחדת לנקודות ההתאמה של ניגודיות הרכיבים. לגדל תאי E.coli מחסה וקטור ביטוי בלתי ניתן לחיסון עבור רצף חלבון היעד במדיום LB לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר או OD 600 של אחד בקירוב.להתאים תאי E.coli כדי deuterium שכותרתו בינוני לפני קנה המידה עבור ביטוי יתר של חלבון deuterated על ידי דילול תרבות LB אחד עד 20 בשלושה מיליליטר של מדיום מינימלי. לאחר גידול OD 600 של אחד בקירוב, חזור על אחד עד 20 דילולים באמצעות מדיום מינימלי המכיל 50, 75, ו 100%D2O. לאחר הסתגלות, להמשיך לגדל את התרבות ב bioreactor כדי להגדיל את התשואה של מסת תאים deuterated.ככל שתוכן ה-D2O יגדל, שיעורי הצמיחה יירדו. המשך לקצור, lyse ולטהר תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הבא לצייד עמודת אי-הכללת גודל עם יותר משני נפחי עמודות של מאגר החלפה סופי באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה.לאחר הזרקת המדגם, הפעל את העמודה בשברים מבודדים המתאימים לחלבון המעניין. שמור aliquot של מאגר תואם עבור פיזור נויטרונים בזווית קטנה או חיסור רקע SANS. כדי לאסוף נתוני SANS, טען תחילה דגימות ומאגרים בתאי קוורץ.לאחר הבטחת סגירת תריס הקרן, התקרבו לאזור הסביבה לדוגמה והצבו את תאי הקוורץ במחליף הדגימה. רשום את מיקום המחליף לדוגמה עבור כל תא לדוגמה. בדוק את האזור וודא כי נתיב הקרן נקי מחסימה לפני שתעזוב את אזור הסביבה לדוגמה.ואז לפתוח את תריס הקרן. ביצוע סריקת טבלה עבור איסוף נתונים אוטומטי. בצע את ההוראות לפעולת מכשיר המסופק על ידי מדען פיזור נויטרונים.השתמש בתוכנת Mantid Plot ובקובץ Script של Python להפחתת נתוני SANS מתדמית דו-מימדית להתוויה חד-מימדית. לשם כך, היכנס לאשכול הניתוח המרוחק והבצע את העלילה של Mantid מתוך שורת הפקודה. לאחר מכן פתח את קובץ ה- Script של הפחתת המשתמש שסופק והצב את מספרי הסריקה או הזיהוי המתאימים עבור הדוגמה בזוגות מאגרים ברשימה המתאימה.בצע את קובץ ה- Script כדי ליצור נתונים מופחתים כקובץ טקסט בן ארבע עמודות במיקום שצוין. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מרחב העבודה המתאים ועל העלילה של Mantid ובחר התוויה עם שגיאות לבדיקה ראשונית של הפרופילים המתפזרים. הורד את חבילת התוכנה של ATSAS ולהשתמש PRIMUS עבור התוויית נתונים, שינוי קנה מידה של מאגר וחיסור וניתוח Guinier.הפעל את היישום ATSAS, יישום ניתוח נתונים SAS וטען את קבצי הנתונים המופחתים המתאימים לצמד הדוגמה והמאגר. כדי לשנות את קנה המידה של המאגר כראוי, בחר את טווח הנתונים ב- Q גבוה שבו שני הפרופילים דומים בדירה ולחץ על לחצן קנה המידה הממוקם תחת הכרטיסיה פעולות. הגדל את טווח הנתונים כדי להציג את כל הנקודות, לחץ על הפחת כדי לבצע פעולה זו.בצע ניתוח Guinier של המאגר חיסור נתונים לדוגמה באמצעות הכרטיסיה ניתוח של יישום ניתוח נתונים SAS. ודא שהקובץ המתאים נבחר ברשימה ולחץ על רדיוס של gyration. ניסיון אוטומטי לבצע התאמה Guinier יסופקו על ידי לחיצה על כפתור RG אוטומטי.הרחב את טווח הנתונים המשמשים לכלול את כל נתוני Q הנמוכים והתחל לצמצם את טווח הנתונים על-ידי לקיחת נקודות Q גבוהות עד שמגבלת ה- Q max times RG נמוכה מ- 1.3. השתמש בהתוויה של שאריות כדי לוודא שהנתונים הם ליניאריים בטווח מתאים. בצע התאמות קטנות באזור ההתאמה ונטר את הרגישות של ערכים אלה לטווח הנתונים המשמשים להתאמה.השג את פונקציית התפלגות ההסתברות P של R בגמד. כעת הפעל את אשף הפצת המרחקים בכרטיסיה ניתוח. קבלת התאמה טובה לנתונים חיונית להשגת מודל איכותי.לקבוע Dmax, המרחק הבין אטומי המרבי בתוך המולקולה. הערכת ערך עבור Dmax על-ידי ביטול הסימון של התיבה כדי לכפות Rmax שווה לאפס והזנת ערך גדול עבור Dmax. יירוט X הראשון בעלילה של P של R מניב הערכה זו.בצע שינויים מצטברים בערך Dmax זה, כמו גם בטווח הנתונים המשמשים עבור מספר הנקודות המשמשות למיטוב התאמה שלgnome לנתונים ועקומת P של R המתקבלת. הפעל את אשף הצורות של PRIMUS מלחצן dammif בכרטיסיה ניתוח נתוני SAS ולהשתמש בבחירה ידנית של פרמטרים. הגדר את טווח Guinier מההתקף והמשך לשלב הבא באמצעות לחצני הניווט.הגדר ערכי התאמה מהתוויה P of R והמשך לשלב הבא. ספק פרמטרים עבור תהליך מידול ab initio. לאחר מכן הפעל את התהליך באמצעות לחצן Commit.שכבת-על ו-superimpose המעטפה הסופית sans עם מודל קשור ברזולוציה גבוהה באמצעות supcomb בתוך ATSAS. מקם עותק של מודל PDB ברזולוציה גבוהה כך שיתאים למעטפת SANS בספריית העבודה. לאחר מכן בצעו supcomb ממשרת הפקודה באמצעות שמות הקבצים PDB כשני ארגומנטים כאשר מבנה התבנית רשום תחילה.לבסוף לדמיין את תוצאות מודל ab initio באמצעות PyMOL, תוכנית צפייה בגרפיקה מולקולרית 3D. לאחר מעטפת SANS ומבנה ברזולוציה גבוהה כבר עלו, מודלים אלה ניתן לדמיין באמצעות כל תוכנית צפייה בגרפיקה מולקולרית. מוצגת סקירה כללית של תהליך הפריט החזותי של PyMOL.לאחר שקבצי מבנה PDB נפתחו ב- PyMOL, הדגמים צריכים להיות גלויים בחלון מציג PyMOL. ניתן לשנות את הייצוגים של כל דגם באמצעות לחצן S לצד כל שם קובץ. כאן משמש ייצוג משטח עבור מעטפת SANS וייצוג קריקטורה משמש עבור עמוד השדרה של החלבון של מודל ברזולוציה גבוהה.ניתן לבחור ערכת צבעים מתאימה מתוך האפשרויות הזמינות תחת לחצן C. עבור שרשראות חלבון, צביעה קשת שרשרת מספק שיפוע צבע מ N כדי C שליחות כדי לסייע בפרשנות. שקיפות מוחלת על ייצוג פני השטח כדי לאפשר הדמיה טובה יותר של מבנה החלבון בתוך המעטפה.עבור תמונות פרסום, מומלץ להשתמש ברקע לבן. לאחר החלת רמזי הדמיה אלה, ניתן לבחון את המבנים תלת-מימדיים על-ידי לחיצה וגרירה של המבנה. מניפולציות של פרספקטיבה סיבוב מולקולה ותרגום יכול להתבצע.בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להתאים במדויק את הניגוד נויטרונים של קבוצות ראש וזנב דטרגנט עם ממס D2O H2O. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחקר המבנה של פרוטאזות אספרטו תוך-ממברן. חלבונים אלה מעורבים בתגובה החיסונית, הפטיטיס C ואלצהיימר המחלה.אל תשכחו שעבודה במעבדות ביוכימיות ובמתקנים של קרן נויטרונים עלולה להיות מסוכנת. אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי וביצוע כל כללי הבטיחות במתקן ופרסומים רדיולוגיים הם חובה בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...