Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

L'ufficio di biologico e la ricerca ambientale sostenuto la ricerca di ORNL centro per biologia molecolare strutturale (CSMB) e Bio-SANS utilizzando strutture supportati dalla divisione scientifica di strutture utente, Office di base energia scienze, dipartimento di di energia. Opere strutturali su proteine di membrana nel laboratorio di Lieberman sono stata sostenuta da NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).

1. preparare e presentare una proposta di strumento e tempo fascio di neutroni Facility
<ol><li>Consultare le risorse online per l'identificazione di strutture di scattering di neutroni che forniscono l'accesso di utente generale neutroni fascio tempo, come ad esempio Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mappa di neutroni strutture e informazioni sulla ricerca di neutroni in tutto il mondo è disponibile online. 46 essere consapevoli del fatto che queste strutture sono in genere regolari inviti...

I ricercatori di biologia strutturale sfruttano tecniche strutturali complementari come soluzione dispersione per ottenere dettagli biochimici e strutturali (ad esempio, forma e dimensioni complessive) da biomolecole in soluzione. SANS è una tecnica particolarmente attraente per la determinazione di strutture di bassa risoluzione delle proteine di membrana, un focus di nucleo della moderna biologia strutturale e biochimica. SANS richiede quantità di proteine purificate paragonabili a quelli degli studi cristallografici...

Proteine di membrana sono codificati di circa il 30% di tutti i geni1 e rappresentano una forte maggioranza di bersagli per farmaci medicinali moderni. 2 queste proteine svolgono una vasta gamma di funzioni cellulari vitali,3 ma nonostante la loro abbondanza e importanza — rappresentano solo circa l'1% del totale strutture depositato nel Research Collaboratory per bioinformatica strutturale (RCSB) proteina Banca dati. 4 a causa della loro natura parzialmente idrofobo, determinazione strutturale delle proteine di membrana-limita è stato estremamente impegnativo. 5 , 6 , 7
Come molte tecniche biofisiche richiedono particelle monodisperse in soluzione per la misurazione, isolando le proteine di membrana dalle membrane native e queste proteine in un mimic solubile delle membrane native di stabilizzazione è stato un'area attiva di ricerca negli ultimi decenni. 8 , 9 , 10 queste indagini hanno portato allo sviluppo di molti romanzo anfifilici assembly per solubilizzare le proteine di membrana, come nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 e amphipols. 16 , 17 tuttavia, l'uso di detergenti micelle rimane uno degli approcci più comuni e semplici per soddisfare le esigenze di solubilità di una data proteina. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 purtroppo, nessun singolo detersivo o la magica miscela di detergenti attualmente esiste che soddisfa tutte le proteine di membrana; così, queste condizioni devono essere schermate empiricamente per le esigenze specifiche di ogni proteina. 26 , 27
Detergenti, auto-assemblarsi in soluzione sopra loro concentrazione micellare critica per formare le strutture aggregati chiamate micelle. Micelle sono composte di molti monomeri detergente (in genere che vanno da 20-200) con catene idrofobiche alchiliche formando un nucleo di micelle e gruppi testa idrofiliche disposti in uno strato di guscio micella affrontando il solvente acquoso. Il comportamento di detergenti e formazione di micelle è stato classicamente descritto da Charles Tanford in The effetto idrofobico,28 e dimensioni e forme delle micelle dai detergenti comunemente utilizzati negli studi di proteine di membrana sono stati caratterizzata mediante scattering ad angolo piccolo. 29 , 30 organizzazione detersivo sulle proteine di membrana è stato anche studiato, e la formazione di complessi proteina-detergente (PDC) è previsto con detergente molecole circostanti la proteina in un arrangiamento che ricorda il detergente pulito micelle. 31
Uno ha aggiunto vantaggio nell'utilizzo di detergenti è che le proprietà di micella risultante possono essere manipolate incorporando altri detergenti. Molti detergenti per mostre di miscelazione ideale, e selezionare proprietà delle micelle miste possono anche essere prevedute dal componenti e rapporto di miscelazione. 22 tuttavia, la presenza di detersivo può ancora presentare sfide per caratterizzazioni biofisiche contribuendo al segnale complessivo. Ad esempio, con tecniche di dispersione della luce e raggi x, segnale da detersivo in PDC è praticamente indistinguibile dalla proteina. 32 le indagini con singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM) in genere si basano su particelle intrappolate (congelate); dettagli strutturali della proteina sono ancora oscurati da taluni detersivi o un'alta concentrazione di detersivo che aggiunge allo sfondo. 33 approcci alternativi verso interpretando la completa struttura PDC (compreso il detersivo) sono state fatte attraverso metodi computazionali che cercano di ricostruire il detersivo intorno una proteina di membrana determinato. 34
Per il caso di scattering di neutroni, la disposizione di nucleo-guscio di detersivo nella micella produce un fattore di forma che contribuisce alla dispersione osservata. Fortunatamente, i componenti della soluzione possono essere alterati tale che non contribuiscono alla dispersione osservata netta. Questo processo di "contrasto di corrispondenza" si ottiene sostituendo deuterio per l'idrogeno ottenere una densità di lunghezza di dispersione che corrisponde a quello dello sfondo (buffer). Deve essere considerate una scelta giudiziosa di detergente (con controparti deuterati disponibile) e il loro rapporto di miscelazione. Per detergente micelle, questa sostituzione può essere eseguita usando un detersivo con lo stesso gruppo di testa ma avendo una catena alchilica deuterato (d-coda invece di h-coda). Dato che i detergenti sono ben miscelati,35 loro aggregati avrà una densità di lunghezza di dispersione è la frazione molare ponderata medio dei due componenti (h-code e d-code). Quando questo contrasto medio è coerenza con quella del gruppo di testa, le strutture di aggregazione uniforme possono essere abbinate completamente per rimuovere tutti i contributi alla dispersione osservata.
Presentiamo qui un protocollo per manipolare il contrasto di neutroni di micelle detergente incorporando molecole chimicamente identici detersivi con catene alchiliche deuterio-etichettati. 19 , 36 , 37 ciò consente il completo contrasto simultaneo di corrispondenza della micella core e shell, che è una capacità unica di scattering di neutroni. 35 , 38 con questo significativamente raffinato livello di dettaglio, contrasto di corrispondenza può attivare studi altrimenti irrealizzabile di strutture di proteine di membrana. Inoltre, questo approccio di contrasto di corrispondenza potrebbe essere esteso ad altri sistemi che coinvolgono detergente, come polimero cambio reazioni39 e olio-acqua disperdenti,40 o anche altri agenti solubilizzanti, quali bicelles,41 nanodiscs,42 o blocco di copolimeri. 43 A approccio simile come delineato in questo manoscritto, ma impiegando una singola specie di detersivo con sostituzioni di deuterio parziale sul gruppo alchilico catena e/o di testa, è stato recentemente pubblicato. 37 mentre questo può essere previsto per migliorare la distribuzione casuale di idrogeno e deuterio in tutto il detersivo rispetto all'approccio qui presentato, il numero limitato di posti disponibili sul detersivo per sostituzione e in due fasi detergente sintesi necessari pone ulteriori sfide per l'esame.
I passaggi 1 e 2 del protocollo descritto di seguito spesso si sovrappongono poiché esperimento iniziale pianificazione deve essere fatto per presentare una proposta di qualità. Tuttavia, la presentazione delle proposte è considerato qui come il primo passo per sottolineare che questo processo deve essere iniziato in anticipo un esperimento di neutroni. Si noti inoltre che un passaggio dei prerequisiti, che dovrebbe essere dimostrato dalla proposta, è di avere la caratterizzazione biochimica e fisica (tra cui purezza e stabilità) del campione sostiene la necessità per gli studi di neutroni. Una discussione generale di small-angle neutron scattering (SANS) è oltre la portata di questo articolo. Un'introduzione breve ma completa è disponibile nella Caratterizzazione di materiali da Kaufmann,44 e una soluzione completa di libro concentrata sul biologica small-angle scattering è stata recentemente pubblicata l'opera di riferimento. 45 ulteriori letture consigliate sono riportate nella sezione discussione. Scattering di piccolo angolo utilizza il così chiamato vettore di dispersione Q come la quantità centrale che descrive il processo di dispersione. In questo articolo utilizza la definizione ampiamente accettata Q = 4 π sin (θ) / λ, dove θ è la metà dell'angolo tra fascio in ingresso e sparso e λ è la lunghezza d'onda della radiazione neutronica in Angstrom. Esistono altre definizioni che uso diverso simboli come di ' per il vettore di dispersione e che possono variare di un fattore 2 π o utilizzando nanometri al posto di Angstrom (Vedi anche la discussione di Figura 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

Lo strumento di dispersione biologica ad angolo piccolo neutrone al High-Flux isotopo reattore di Oak Ridge National Laboratory è dedicato allo studio di materiali biologici, biocarburanti lavorazione e materiali bio-ispirato che coprono nanometro a scale di lunghezza di micrometro. I metodi presentati qui per indagare le proprietà fisiche (cioè, dimensioni e forma) delle proteine di membrana (qui, MmIAP, del intramembrane aspartil proteasi da Methanoculleus marisnigri) in soluzioni di formazione di micelle sono detergenti particolarmente adatto per questo strumento di scattering ad angolo piccolo neutrone, tra gli altri. Altre tecniche di caratterizzazione biofisica sono ostacolati dalla loro incapacità di affrontare i contributi detersivi in una struttura di complesso proteina-detergente. Accesso al laboratorio di Bio-Deuteration fornisce inoltre funzionalità uniche per la preparazione di coltivazioni su larga scala e che esprimono le proteine deuterio-etichettati per una maggiore dispersione del segnale dalla proteina. Mentre questa tecnica non fornisce dettagli strutturali in alta risoluzione, il divario di conoscenza strutturale per le proteine di membrana contiene molte zone indirizzabile di ricerca senza risoluzione vicino-atomica. Ad esempio, queste aree includono la determinazione degli Stati oligomerici, formazione complessa, cambiamenti conformazionali durante perturbazione ed eventi di chiusura/apertura. Queste indagini possono essere facilmente realizzate attraverso applicazioni di questo metodo.

Una proposta di tempo e strumento di fascio chiaramente dovrebbe trasmettere tutte le informazioni necessarie per il Comitato di revisione in modo che può essere fatta una valutazione valida dell'esperimento proposto. Comunicazione con un NSS è altamente consigliata per gli utenti inesperti. il NSS può valutare fattibilità iniziale e presentazione delle proposte Guida per enfatizzare la fattibilità, la sicurezza e il potenziale per la scienza ad alto impatto. Le informazioni fornite ...

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Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrasto-Matching detergente in esperimenti di Scattering di neutroni Small-Angle per Ab Initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana

Questo protocollo viene illustrato come ottenere un modello a bassa risoluzione ab-initio e dettagli strutturali di una proteina di membrana detergente-solubilizzato in soluzione mediante scattering di neutroni piccolo angolo con contrasto-corrispondenza del detergente.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle proteine integrali della membrana come lo stato oligomerico, le loro dimensioni, la forma complessiva e la struttura a bassa risoluzione in soluzione. Gli studi di soluzione delle proteine di membrana richiedono molecole stabilizzanti come i detergenti. Questa tecnica ha il vantaggio di rende invisibili i detergenti ed evidenzia il segnale della proteina della membrana.Le implicazioni di questa tecnica si estendono a molte domande di ricerca biologica e medica perché oltre 1/3 delle proteine risiedono in membrane in cui svolgono molte funzioni cellulari vitali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di etichettatura del deuterio e di scattering neutronico sono difficili da apprendere perché pochissime istituzioni offrono formazione su queste tecniche. Per iniziare, determinare densità di lunghezza di dispersione neutronica o S SLD utilizzando l'applicazione web MULCh, moduli per l'analisi dei dati di variazione del contrasto.Aprire il modulo di contrasto facendo clic sul contrasto nel riquadro di spostamento sinistro. Fornire il testo per un titolo di progetto e immettere i dettagli seguenti per due componenti come subunità uno e subunità due. Immettere la formula molecolare per ogni componente nella casella di testo della formula.Quindi immettere il volume in angstrom cubici per ogni componente nella casella sotto il volume. Infine, immettere i dettagli per i componenti del buffer. Fare clic su invia per eseguire i calcoli del contrasto neutronico.Viene generata una pagina dei risultati che fornisce una tabella della densità della lunghezza di dispersione e dei punti di corrispondenza del contrasto, nonché formule per determinare questi parametri a una determinata percentuale di D2O nel buffer. Esaminare i parametri di dispersione con particolare attenzione ai punti di corrispondenza del contrasto dei componenti. Far crescere le cellule E.coli che ospitano un vettore di espressione induttibile per la sequenza proteica bersaglio in mezzo LB a una densità ottica a 600 nanometri o OD 600 di circa uno.Adattare le cellule E.coli al deuterio etichettato medio prima di scalare per l'espressione sovrastante di una proteina deuterata diluire la coltura LB da uno a 20 millilitri su tre di mezzo minimo. Dopo essere cresciuto fino a un OD 600 di circa uno, ripetere da una a 20 diluizioni utilizzando un supporto minimo contenente 50, 75 e 100%D2O. Una volta adattato, continua a coltivare la coltura in un bioreattore per aumentare la resa della massa cellulare deuterata.Con l'aumento del contenuto D2O, i tassi di crescita diminuiranno. Procedere alla raccolta, alla lisciga e alla purificazione delle cellule come descritto nel protocollo di testo. Successivamente equilibrare una colonna di esclusione delle dimensioni con più di due volumi di colonna di buffer di scambio finale utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce.Dopo aver iniettato il campione, eseguire la colonna in frazioni isolate corrispondenti alla proteina di interesse. Riservare un'aliquota di buffer abbinato per lo scattering neutronico ad angolo ridotto o la sottrazione di fondo SANS. Per raccogliere i dati SANS, caricare prima campioni e buffer nelle celle al quarzo.Dopo aver fatto in modo che l'otturatore del fascio sia chiuso, avvicinarsi all'area dell'ambiente del campione e posizionare le celle al quarzo nel cambio campione. Registrare la posizione del changer di esempio per ogni cella di esempio. Controllare l'area e assicurarsi che il percorso del fascio sia privo di ostruzioni prima di lasciare l'area dell'ambiente campione.Quindi aprire l'otturatore del fascio. Eseguire un'analisi della tabella per la raccolta automatica dei dati. Seguire le istruzioni per il funzionamento dello strumento fornite dallo scienziato dello scattering neutronico.Usa il software Mantid Plot e lo script Python per la riduzione dei dati SANS da un'immagine 2D a un grafico 1D. A tale fine, accedere al cluster di analisi remota ed eseguire il plottaggio Mantid dalla riga di comando. Quindi aprire lo script di riduzione utente fornito e inserire i numeri di scansione o l'identificazione corrispondenti per l'esempio in coppie di buffer nell'elenco appropriato.Eseguire lo script per generare dati ridotti come file di testo a quattro colonne nel percorso specificato. Fate clic con il pulsante destro del mouse sull'apposito spazio di lavoro e sul plottaggio Mantid e selezionate traccia con errori per un esame iniziale dei profili di dispersione. Scarica la suite di software ATSAS e utilizza PRIMUS per il plottaggio dei dati, il ridimensionamento e la sottrazione del buffer e l'analisi guinier.Avviare l'applicazione di analisi dei dati ATSAS, SAS e caricare i file di dati ridotti corrispondenti alla coppia di esempi e buffer. Per ridimensionare correttamente il buffer, selezionare l'intervallo di dati in Q alto in cui entrambi i profili sono simili in piano e fare clic sul pulsante scala che si trova sotto la scheda operazioni. Aumentare l'intervallo di dati per visualizzare tutti i punti, fare clic su sottrai per eseguire questa operazione.Eseguire un'analisi Guinier dei dati di esempio sottratti dal buffer utilizzando la scheda analisi dell'applicazione di analisi dei dati SAS. Assicurarsi che il file corretto sia selezionato nell'elenco e fare clic sul raggio di rotazione. Un tentativo automatizzato di eseguire una vestibilità Guinier verrà fornito facendo clic sul pulsante RG automatico.Espandere l'intervallo di dati utilizzato per includere tutti i dati Q bassi e iniziare a restringere l'intervallo di dati togliendo punti Q elevati fino a quando il limite Q max per RG è inferiore a 1,3. Utilizzare il grafico dei residui per verificare che i dati siano lineari nell'intervallo di adattamento. Apportare piccole regolazioni alla regione di adattamento e monitorare la sensibilità di questi valori all'intervallo di dati utilizzati nell'adattamento.Ottenere la funzione di distribuzione di probabilità P di R nello gnomo. Avviare ora la distribuzione guidata della distanza all'interno della scheda analisi. Ottenere una buona vestibilità ai dati è essenziale per ottenere un modello di qualità.Determinare Dmax, la distanza interatomica massima all'interno della molecola. Stimare un valore per Dmax deselezionando la casella per forzare Rmax uguale a zero e immettendo un valore elevato per Dmax. La prima intercetta X nella trama di P di R produce questa stima.Apportare modifiche incrementali a questo valore Dmax e all'intervallo di dati utilizzato per il numero di punti utilizzati per ottimizzare lo gnomo adatto ai dati e alla curva P di R risultante. Avviare la creazione guidata forma PRIMUS dal pulsante dammif nella scheda analisi dell'analisi dei dati SAS e utilizzare una selezione manuale dei parametri. Definire la gamma Guinier dall'adattamento e procedere al passaggio successivo utilizzando i pulsanti di navigazione.Definite i valori di adattamento dal plottaggio P di R e procedete al passo successivo. Fornire parametri per il processo di modellazione ab initio. Quindi avviare il processo utilizzando il pulsante di commit.Sovrapporre e sovrapporre l'involucro finale sans con un modello ad alta risoluzione correlato utilizzando supcomb all'interno di ATSAS. Inserire una copia del modello PDB ad alta risoluzione da adattare all'inviluppo SANS nella directory di lavoro. Quindi eseguire supcomb dalla riga di comando utilizzando i nomi dei file PDB come due argomenti con la struttura del modello elencata per prima.Infine visualizzare i risultati del modello ab initio utilizzando PyMOL, un programma di visualizzazione grafica molecolare 3D. Una volta sovrapposti l'inviluppo SANS e la struttura ad alta risoluzione, questi modelli possono essere visualizzati utilizzando qualsiasi programma di visualizzazione grafica molecolare. Viene visualizzata una panoramica del processo di visualizzazione PyMOL.Una volta aperti i file della struttura PDB in PyMOL, i modelli dovrebbero essere visibili nella finestra del visualizzatore PyMOL. Le rappresentazioni di ogni modello possono essere modificate utilizzando il pulsante S accanto a ciascun nome di file. Qui viene utilizzata una rappresentazione di superficie per l'inviluppo SANS e una rappresentazione cartoon viene utilizzata per la spina dorsale proteica del modello ad alta risoluzione.Una combinazione di colori adatta può essere selezionata tra le opzioni disponibili sotto il pulsante C. Per le catene proteiche, una colorazione a catena fornisce un gradiente di colore dal capolinea N a C per aiutare l'interpretazione. La trasparenza viene applicata alla rappresentazione superficiale per consentire una migliore visualizzazione della struttura proteica all'interno dell'involucro.Per le immagini di pubblicazione, è consigliato uno sfondo bianco. Una volta applicati questi segnali di visualizzazione, le strutture 3D possono essere esaminate facendo clic e trascinando la struttura. È possibile eseguire manipolazioni della rotazione e della traslazione della prospettiva e della molecola.Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di abbinare accuratamente il contrasto neutronico dei gruppi testa e coda del detergente con il solvente D2O H2O. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada all'esplorazione della struttura delle asparto proteasi intramembrane. Queste proteine sono coinvolte nella risposta immunitaria, nell'epatite C e nel morbo di Alzheimer.Non dimenticate che lavorare in laboratori biochimici e in impianti di fascio di neutroni può essere pericoloso. Precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale e seguire tutte le regole di sicurezza dell'impianto e i distacchi radiologici sono obbligatori durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combinando la cristallografia a raggi x con piccolo angolo x-ray Scattering per modellare le regioni non strutturate di Nsa1 da S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

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Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

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Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Cromatografia a scambio ionico (IEX) accoppiata alla diffusione della luce multi-angolo (MALS) per la caratterizzazione e la separazione delle proteine

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caratterizzazione delle proteine mediante cromatografia di dimensioni-esclusione accoppiata alla dispersione luminosa multi-angolo (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...