Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Office av biologiske og miljøforskning støttes forskning på ORNL'S Center for strukturelle molekylærbiologi (CSMB) og Bio-SANS bruker fasiliteter støttes av vitenskapelige bruker fasiliteter divisjon, Office for energi basalfag, US Department energi. Strukturelle arbeidet på membran proteiner i Lieberman lab har blitt støttet av NIH (DK091357, GM095638) og NSF (0845445).

1. forberede og sende en Neutron anlegget strålen tid og Instrument forslag
<ol><li>Se elektroniske ressurser for å identifisere neutron spredning fasiliteter som gir generelt bruker neutron strålen tilgang, for eksempel Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Kart over neutron fasiliteter og informasjon om neutron forskning verdensomspennende er tilgjengelig online. 46 være oppmerksom på at disse anleggene vanligvis har vanlig utlysninger; Dette bestemmer når neste strålen gang vil være t...

Strukturell biologi forskere utnytte komplementære strukturelle teknikker som løsning spredning å hente biokjemiske og strukturelle detaljer (som størrelsen og form) fra biomolecules i løsningen. SANS er en spesielt attraktivt teknikk for å bestemme lav oppløsning strukturer av membran proteiner, en kjerne fokus på moderne strukturell biologi og biokjemi. SANS krever mengder renset proteiner sammenlignbare med krystallografisk forsøk (1 mg/sampling). Nylig voksende kommersielle tilgjengeligheten av høy renhetsg...

Membran proteiner er kodet av anslagsvis 30% av alle gener1 og representerer en sterk flertallet av mål for moderne medisinsk narkotika. 2 disse proteinene utfører en rekke viktige cellulære funksjoner,3 men til tross for sine overflod og betydning, representerer bare ca 1% av totale strukturer avsatt i forskning Collaboratory for strukturelle bioinformatikk (RCSB) Protein Data Bank. 4 deres delvis hydrofobe naturen strukturelle fastsettelse av membran-bundet proteiner har vært meget utfordrende. 5 , 6 , 7
Som mange Biofysiske teknikker krever monodisperse partikler i løsningen for måling, har isolere membran proteiner fra innfødte membraner og stabilisere disse proteinene i en løselig etterligne av innfødte membraner vært et aktivt område av forskning i siste tiår. 8 , 9 , 10 disse undersøkelsene har ført til utviklingen av mange romanen amphiphilic samlinger til solubilize membran proteiner, slik som nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 og amphipols. 16 , 17 men bruk av vaskemiddel micelles fortsatt en av de vanligste og enkel tilnærmingene for å oppnå løselighet kravene til et bestemt protein. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 dessverre ingen enkelt vaskemiddel magisk blanding av vaskemidler ikke finnes eller som tilfredsstiller alle membran proteiner; Dermed må disse forholdene bli empirisk vist for de unike kravene hver protein. 26 , 27
Vaskemidler montere selv i løsning over deres kritisk micelle konsentrasjon skjemaet samlede strukturer kalt micelles. Micelles består av mange vaskemiddel monomerer (vanligvis varierer fra 20-200) med hydrofobe alkyl kjeder danner en micelle kjerne og hydrofile hodet grupper ordnet i et micelle ytterlag overfor vandig løsemiddelet. Virkemåten til vaskemidler og micelle formasjon har blitt klassisk beskrevet av Charles Tanford The hydrofobe,28 og størrelser og former av micelles fra vanlige vaskemidler i membranen protein studier har vært preget med liten vinkel spredning. 29 , 30 vaskemiddel organisasjon om membran proteiner også har vært studert, og dannelsen av protein-rengjøringsmiddel komplekser (PDC) forventes med vaskemiddel molekyler rundt protein i en ordning som ligner pen vaskemiddel micelles. 31
En ekstra fordel i bruker rengjøringsmidler er at de resulterende micelle egenskapene kan manipuleres ved å innlemme andre vaskemidler. Mange vaskemidler utstilling ideell blanding, og velg egenskaper av blandet micelles selv kan forutsies fra komponenter og forholdet mellom miksing. 22 men tilstedeværelsen av vaskemiddel kan fortsatt presentere utfordringer for Biofysiske karakteristikkene ved å bidra til det totale signalet. For eksempel røntgen og lysspredning teknikker er signal fra vaskemiddel i PDCEN nesten utvisket fra protein. 32 undersøkelser med enkelt-partikkel cryo-elektronmikroskop (cryo-EM) vanligvis stole på fanget (frossen) partikler; strukturelle detaljer i protein er fremdeles skjult av visse vaskemidler eller en høy konsentrasjon av vaskemiddel som legger til bakgrunnen. 33 alternative tilnærminger mot tolke full PDC strukturen (inkludert vaskemiddel) er gjort gjennom beregningsorientert metoder som søker å rekonstruere smuss rundt et gitt membran protein. 34
For tilfelle av neutron spredning produserer core-shell ordningen av vaskemiddel i micelle en formfaktor som bidrar til den observerte spredningen. Heldigvis kan løsningskomponenter endres slik at de ikke bidrar til netto observert spredning. Denne "kontrast matchende" prosessen oppnås ved å erstatte deuterium for hydrogen for å oppnå en spredning lengde tetthet som samsvarer med bakgrunnen (buffer). Et fornuftig valg av vaskemiddel (med tilgjengelig deuterated kolleger) og deres forhold blanding må vurderes. For vaskemiddel micelles, kan denne erstatningen utføres bruk et vaskemiddel med samme leder gruppen, men har en deuterated alkyl kjede (d-halen i stedet for h-tail). Siden vaskemidler er godt blandet,35 sine aggregater vil ha en spredning lengde tetthet som er en føflekk-brøkdel vektet gjennomsnitt av de to komponentene (h haler og d haler). Når denne gjennomsnittlig kontrast er konsekvent med at gruppen leder, samsvarer uniform samlet strukturer fullt for å fjerne alle bidrag til observert spredning.
Vi presenterer her en protokoll for å manipulere neutron kontrasten vaskemiddel micelles ved å innlemme kjemisk identisk vaskemiddel molekyler med deuterium-merket alkyl kjeder. 19 , 36 , 37 Dette tillater samtidig kontrast matching av micelle kjernen og shell, som er en unik evne neutron spredningsprosent. 35 , 38 med denne betydelig raffinert detaljnivå, kontrast matchende kan aktivere ellers unfeasible studier membran proteinstrukturer. I tillegg kan denne kontrast som utvides til andre systemer som involverer vaskemiddel, som polymer exchange reaksjoner39 og olje-vann dispergeringsmidler,40 eller til andre solubilizing stoffer, som bicelles,41 nanodiscs,42 eller blokker copolymers. 43 A lignende tilnærming som beskrevet i dette manuskriptet, men ansette én vaskemiddel Art med delvis deuterium erstatninger for alkyl kjede og/eller leder gruppen, ble nylig publisert. 37 mens dette kan forventes å forbedre tilfeldig fordeling av hydrogen og deuterium gjennom smuss sammenlignet tilnærmingen som presenteres her, begrenset antall tilgjengelige plasseringer i vaskemiddel for substitusjon og to-trinns vaskemiddel syntese kreves positurer flere utfordringer for vurdering.
Trinn 1 og 2 av protokollen vises nedenfor ofte overlapper siden første eksperiment planlegging må gjøres for å sende inn en kvalitet forslag. Men forslaget innlevering regnes som første skritt for å understreke at denne prosessen skal startes forveien en neutron eksperiment. Det bør også bemerkes at en forutsetning, som bør bli demonstrert av forslaget, er å ha biokjemiske og fysiske karakterisering (inkludert renhet og stabilitet) av prøven støtte behovet for Nøytron studier. En generell diskusjon om liten vinkel neutron spredning (San) er utenfor omfanget av denne artikkelen. En kort, men grundig innføring er tilgjengelig i den referanse arbeidet Karakterisering av materialer av Kaufmann,44 og en omfattende lærebok fokusert på biologiske liten vinkel løsning spredning er nylig publisert. 45 ytterligere anbefalt lesing er gitt under diskusjon. Liten vinkel spredning bruker såkalte spredning vektoren Q som sentrale antallet som beskriver spredning. Denne artikkelen bruker allment akseptert definisjon Q = 4π synd (θ) / λ, der θ er halvparten vinkelen mellom innkommende og spredt stråle og λ er bølgelengdeområdet av neutron stråling i Ångstrøm. Andre definisjoner finnes at bruk forskjellige symboler som er "for spredning vektoren, og at avvike ved en faktor 2π eller nanometer i stedet for Angstrom (se diskusjon av Figur 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

Biologiske liten vinkel neutron spredning apparatet med høy-Flux isotop reaktoren i Oak Ridge National Laboratory er dedikert til etterforskningen av biologisk materiale, biodrivstoff behandling og bio-inspirert materialer dekker nanometer til mikrometer lengde skalaer. Metodene presenteres her for å undersøke fysiske egenskaper (dvs. størrelse og form) av membran proteiner (her, MmIAP, en intramembrane aspartyl protease fra Methanoculleus marisnigri) i løsninger av micelle-forming vaskemidler er velegnet for liten vinkel neutron spredning instrumentet, blant andre. Andre Biofysiske karakterisering teknikker er hindret av deres manglende evne til å løse vaskemiddel bidragene i en protein-rengjøringsmiddel kompleks struktur. Dessuten gir tilgang til Bio-deuterasjon (deuterering) Lab unike muligheter for utarbeidelse store nærområdet og uttrykke deuterium-merket proteiner for forbedret spredning signalet fra protein. Mens denne teknikken gir ikke strukturelle detaljer i høy oppløsning, strukturelle kunnskapen hullet for membran proteiner inneholder mange adresserbare områder av forskning uten nær Atom løsning. For eksempel omfatter disse områdene fastsettelse av oligomeric stater, komplekse formasjon, conformational endringer under forstyrrelsene og folding/unfolding arrangementer. Disse undersøkelsene kan lett oppnås gjennom programmer av denne metoden.

Strålen tid og instrument forslag skal tydelig formidle all informasjon nødvendig til gjennomgangen komiteen slik at en gyldig vurdering av foreslåtte eksperimentet kan gjøres. Kommunikasjon med en NSS er svært foreslått for uerfarne brukere. NSS kan vurdere første gjennomførbarhet og guide forslag innlevering å understreke gjennomførbarhet, sikkerhet og potensialet for høy effekt vitenskap. Informasjonen i forslaget bør inkludere bakgrunnsinformasjon og kontekst for betydning...

Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-samsvarende vaskemiddel i liten vinkel Neutron spredning eksperimenter for membran Protein strukturell analyse og Ab Initio modellering

Denne protokollen demonstrerer hvordan å få en lav oppløsning ab initio modell og strukturelle detaljer i et vaskemiddel-solubilized membran protein i løsning med liten vinkel neutron spredning med kontrast-matching av vaskemiddel.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om integrerte membranproteiner som oligomerisk tilstand, deres størrelse, generelle form og lavoppløsningsstruktur i løsningen. Løsningsstudier av membranproteiner krever stabilisering av molekyler som vaskemidler. Denne teknikken har fordelen at det gjør vaskemidler usynlige og fremhever signalet fra membranproteinet.Implikasjonene av denne teknikken strekker seg til mange biologiske og medisinske forskningsspørsmål fordi over 1/3 av proteiner ligger i membraner hvor de utfører mange vitale cellulære funksjoner. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk som deuterium merking og nøytron spredning trinn er vanskelig å lære fordi svært få institusjoner tilbyr opplæring i disse teknikkene. For å begynne, bestemme nøytron spredning lengde tettheter eller SLDs ved hjelp av web-applikasjonen MULCh, moduler for analyse av kontrast variasjon data.Åpne kontrastmodulen ved å klikke kontrasten i den venstre navigasjonsruten. Gi tekst for en prosjekttittel, og skriv inn detaljene nedenfor for to komponenter som underenhet én og underenhet to. Skriv inn den molekylære formelen for hver komponent i formeltekstboksen.Skriv deretter inn volumet i kubikkangstrom for hver komponent i boksen under volum. Til slutt angir du detaljene for bufferkomponenter. Klikk send for å utføre nøytronkontrastensberegningene.Det genereres en resultatside som inneholder en tabell med punktlengdetetthet og kontrastst samsvarspunkter, samt formler for å bestemme disse parameterne til en gitt prosentandel av D2O i bufferen. Se gjennom spredningsparametrene med særlig oppmerksomhet til komponentkontrasts samsvarspunktene. Vokse E.coli celler som inneholder en induserbar uttrykk vektor for målet protein sekvens i LB medium til en optisk tetthet på 600 nanometer eller OD 600 av omtrent en.Tilpass E.coli-celler til deuterium merket medium før du skalerer opp for overuttrykk av et deuterert protein ved å fortynne LB-kulturen en til 20 i tre milliliter minimalt medium. Etter å ha vokst til en OD 600 av omtrent en, gjenta en til 20 fortynninger ved hjelp av minimal medium som inneholder 50, 75 og 100% D2O. Når den er tilpasset, fortsett å dyrke kulturen i en bioreaktor for å øke utbyttet av deuterated cellemasse.Etter hvert som D2O-innholdet økes, vil veksten avta. Fortsett å høste, lyse og rense celler som beskrevet i tekstprotokollen. Neste likevekt en størrelse ekskludering kolonne med større enn to kolonnevolumer av endelig utveksling buffer ved hjelp av en rask protein flytende kromatografi system.Etter å ha injisert prøven, kjør kolonnen i isolerende fraksjoner som tilsvarer proteinet av interesse. Reserver en aliquot av matchet buffer for små vinkel nøytron spredning eller SANS bakgrunn subtraksjon. For å samle sans data, først laste prøver og buffere i kvartsceller.Når du har sikret deg at strålelukkeren er lukket, nærmer du deg prøvemiljøområdet og plasserer kvartscellene i prøveveksleren. Registrer eksempelvekslerposisjonen for hver eksempelcelle. Kontroller området og sørg for at strålebanen er fri for hindring før du forlater prøvemiljøområdet.Åpne deretter strålelukkeren. Utfør en tabellskanning etter automatisert datainnsamling. Følg instruksjonene for instrumentdrift levert av nøytronspraksjonsforskeren.Bruk Mantid Plot programvare og Python script for reduksjon av SANS data fra et 2D-bilde til en 1D-tomt. Hvis du vil gjøre dette, logger du på klyngen for ekstern analyse og utfører Mantid-plottet fra kommandolinjen. Åpne deretter det angitte brukerreduksjonsskriptet og plasser de tilsvarende skannenumrene eller identifikasjonen for eksemplet i bufferpar i den aktuelle listen.Utfør skriptet for å generere reduserte data som en tekstfil med fire kolonner på den angitte plasseringen. Høyreklikk på riktig arbeidsplass og Mantid tomten og velg plott med feil for en innledende undersøkelse av spredningsprofilene. Last ned ATSAS programvarepakken og bruke PRIMUS for data plotting, buffer skalering og subtraksjon og Guinier analyse.Start ATSAS, SAS dataanalyseprogrammet og last inn de reduserte datafilene som svarer til eksempel- og bufferparet. Hvis du vil skalere bufferen riktig, velger du dataområdet ved høy Q der begge profilene er like flate og klikker på skalaknappen under kategorien operasjoner. Øk dataområdet for å vise alle punktene, klikk trekk fra for å utføre denne operasjonen.Utfør en Guinier-analyse av bufferen som trekkes fra eksempeldata ved hjelp av analysefanen i SAS-dataanalyseprogrammet. Kontroller at riktig fil er valgt i listen, og klikk radius av gyration. Et automatisert forsøk på å utføre en Guinier-passform vil bli gitt ved å klikke på den automatiske RG-knappen.Utvid dataområdet som brukes til å inkludere alle de lave Q-dataene, og begynn å begrense dataområdet ved å ta bort høye Q-punkter til Q makstider RG-grensen er under 1,3. Bruk tomten med rester til å kontrollere at dataene er lineære i tilpasningsområdet. Foreta små justeringer i tilpasningsområdet og overvåk følsomheten til disse verdiene til dataområdet som brukes i passformen.Få sannsynlighetsfordelingsfunksjonen P av R i gnome. Start nå veiviseren for avstandsdistribusjon i analysefanen. Å få en god passform til dataene er avgjørende for å få en kvalitetsmodell.Bestem Dmax, den maksimale interatomiske avstanden i molekylet. Anslå en verdi for Dmax ved å fjerne merket i boksen for å tvinge Rmax er lik null og angi en stor verdi for Dmax. Den første X-avskjæringen i tomten til P of R gir dette estimatet.Gjør trinnvise endringer i denne Dmax-verdien, samt dataområdet som brukes til antall punkter som brukes til å optimalisere gnomen som passer til dataene og den resulterende P of R-kurven. Start primus-figurveiviseren fra dammif-knappen i analysefanen for SAS-dataanalyse og bruk et manuelt utvalg av parametere. Definer Guinier-området fra passformen, og gå videre til neste trinn ved hjelp av navigasjonsknappene.Definer tilpasningsverdier fra P of R-plottet, og gå videre til neste trinn. Angi parametere for ab initio-modelleringsprosessen. Start deretter prosessen ved hjelp av utføringsknappen.Overlegg og overlegg den endelige sans konvolutten med en relatert høyoppløselig modell ved hjelp av supcomb i ATSAS. Plasser en kopi av PDB-modellen med høy oppløsning for å passe til SANS-konvolutten i arbeidskatalogen. Deretter utfører du supcomb fra kommandolinjen ved hjelp av PDB-filnavnene som to argumenter med malstrukturen som er oppført først.Endelig visualisere ab initio modell resultater ved hjelp av PyMOL, en 3D molekylær grafikk visningsprogram. Når SANS konvolutt og høy oppløsning struktur har blitt lagt over, disse modellene kan visualiseres ved hjelp av noen molekylær grafikk visningsprogram. En oversikt over PyMOL-visualiseringsprosessen vises.Når PDB strukturfilene er åpnet i PyMOL, bør modellene være synlige i PyMOL-visningsvinduet. Representasjonene av hver modell kan endres ved hjelp av S-knappen ved siden av hvert filnavn. Her brukes en overflaterepresentasjon til SANS-konvolutten, og en tegneserierepresentasjon brukes til proteinbackboneen til høyoppløsningsmodellen.Et passende fargevalg kan velges fra alternativene som er tilgjengelige under C-knappen. For proteinkjeder gir en kjedebollefaring en fargegradient fra N til C terminus for å hjelpe tolkning. Gjennomsiktighet påføres overflaterepresentasjonen for å tillate bedre visualisering av proteinstrukturen i konvolutten.For publiseringsbilder anbefales en hvit bakgrunn. Når disse visualiseringssignalene er brukt, kan 3D-strukturene undersøkes ved å klikke og dra strukturen. Manipulasjoner av perspektivet og molekylrotasjon og oversettelse kan utføres.Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å nøyaktig matche nøytronkontrasten til vaskemiddelhode- og halegruppene med D2O H2O-løsningsmidlet. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for å utforske strukturen av intramembrane asparto proteaser. Disse proteinene er involvert i immunresponsen, hepatitt C og Alzheimers sykdom.Ikke glem at det kan være farlig å jobbe i biokjemiske laboratorier og ved nøytronstråleanlegg. Forholdsregler som bruk av personlig verneutstyr og følge alle sikkerhetsregler og radiologiske innlegg er obligatoriske mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Kombinere Røntgenkrystallografi med liten vinkel X-Ray spredning modell ustrukturert regioner i Nsa1 fra S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskjellige dimensjoner bruke automatisert krystallisering kombinert med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning av vaskemiddel-sensitive interaksjoner mellom membran proteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle studier av makromolekyler i løsning med liten vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionebytte kromatografi (IEX) koblet til multi-Angle lysspredning (MALS) for proteiner og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner etter størrelses-ekskludering kromatografi koblet til multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...