Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

O escritório de biológica e investigação ambiental apoiaram pesquisa do ORNL centro de Biologia Molecular estrutural (CSMB) e Bio-SANS usando recursos suportados pela divisão de instalações científicas usuário, escritório de ciências básicas de energia, departamento dos EUA de energia. O trabalho estrutural em proteínas de membrana no laboratório de Lieberman foi apoiado pelo NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).

1. preparar e apresentar um nêutron instalação feixe tempo e proposta de instrumento
<ol><li>Consulte os recursos online para identificar instalações de dispersão de nêutrons que fornecem acessar de tempo de feixe de nêutrons usuário geral, como Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mapa de nêutrons facilidades e informações sobre pesquisa de nêutrons em todo o mundo está disponível online. 46 estar ciente de que estas instalações têm tipicamente regulares convites à apresenta...

Pesquisadores de biologia estrutural aproveitam técnicas estruturais complementares como espalhamento da solução para obter detalhes bioquímicos e estruturais (como forma e tamanho total) de biomoléculas em solução. SANS é uma técnica particularmente atraente para a determinação de estruturas de baixa resolução de proteínas de membrana, um foco central de Bioquímica e biologia estrutural moderna. SANS requer quantidades de proteínas purified comparáveis dos ensaios cristalográficos (1 mg/amostra). A dis...

Proteínas da membrana são codificadas por um estimado de 30% de todos os genes1 e representam uma forte maioria de alvos para drogas medicinais modernos. 2 estas proteínas executam uma grande variedade de funções celulares vitais,3 mas apesar da sua abundância e importância — representam apenas cerca de 1% do totais estruturas depositados na organização da pesquisa para proteína de Bioinformática estrutural (RCSB) Banco de dados. 4 devido à sua natureza parcialmente hidrofóbica, determinação estrutural de proteínas de membrana-limite tem sido extremamente desafiador. 5 , 6 , 7
Como muitas técnicas biofísicas exigem monodisperso partículas em solução para medição, isolando as proteínas de membrana de membranas nativas e estabilizar estas proteínas em um mímico solúvel das membranas nativas tem sido uma área ativa de pesquisa em recentes décadas. 8 , 9 , 10 estas investigações levaram ao desenvolvimento de muitos conjuntos de romance anfifílica para solubilizar as proteínas de membrana, tais como nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 e amphipols. 16 , 17 no entanto, o uso de detergentes micelas continua a ser uma das abordagens mais comuns e simples para satisfazer os requisitos de solubilidade de uma determinada proteína. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 -infelizmente, nenhum único detergente ou mistura mágica de detergentes existe atualmente que satisfaça todas as proteínas de membrana; assim, estas condições devem ser empiricamente selecionadas para os requisitos exclusivos de cada proteína. 26 , 27
Detergentes auto-montagem na solução acima da concentração crítica micelle para formar estruturas agregadas chamadas micelas. Micelas são compostas de muitos monômeros detergentes (normalmente variando de 20-200) com cadeias alquila hidrofóbicas, formando um núcleo micelle e grupos cabeça hidrofílicos, dispostos em uma camada de casca micelle enfrentando o solvente aquoso. O comportamento de detergentes e formação micela foi classicamente descrito por Charles Tanford em O efeito hidrofóbico,28 e tamanhos e formas das micelas de detergentes usados em estudos de proteínas de membrana têm sido caracteriza-se usando o pequeno ângulo espalhamento. 29 , 30 organização de detergente sobre as proteínas de membrana também tem sido estudada, e a formação de complexos proteína-detergente (PDCs) é esperada com moléculas de detergente em torno da proteína em um arranjo que se assemelha o detergente puro micelas. 31
Um adicionado a vantagem em usar detergentes é que as propriedades de micela resultante podem ser manipuladas, incorporando outros detergentes. Muitos detergentes exibem uma mistura ideal, e selecione Propriedades de micelas mistas nem podem ser previstas a partir os componentes e a proporção de mistura. 22 no entanto, a presença de detergente pode ainda apresentar desafios para caracterizações biofísicos, contribuindo para o sinal global. Por exemplo, com raio-x e técnicas de espalhamento de luz, sinal de detergente no PDC é praticamente indistinguível da proteína. 32 investigações com single-particle cryo-microscopia (cryo-EM) normalmente contam com partículas (congeladas) presas; detalhes estruturais da proteína ainda são obscurecidos por determinados detergentes ou uma alta concentração de detergente, que acrescenta ao fundo. 33 abordagens alternativas para interpretar a estrutura completa do PDC (incluindo o detergente) foram feitas através de métodos computacionais que visam reconstruir o detergente em torno de uma proteína de membrana determinado. 34
Para o caso de dispersão de nêutrons, o arranjo de núcleo-casca de detergente no micelle produz um fator de forma que contribui para a dispersão observada. Felizmente, componentes de solução podem ser alterados, tal que eles não contribuem para a dispersão líquida observada. Este processo de "correspondência de contraste" é conseguido pela substituição de deutério de hidrogênio obter uma densidade de comprimento de dispersão que corresponde do fundo (tampão). Uma escolha criteriosa de detergente (com contrapartes deuterados disponíveis) e sua proporção de mistura devem ser considerados. Para detergentes micelas, essa substituição pode ser realizada usando um detergente com o mesmo grupo de cabeça mas tendo uma cadeia deuterado (d-cauda em vez de h-cauda). Uma vez que os detergentes são bem misturados,35 seus agregados terá uma densidade de comprimento de dispersão que é a fração molar-ponderada média dos dois componentes (h-caudas e d-caudas). Quando este contraste médio é consistente com a do grupo principal, as estruturas de agregação uniformes podem ser correspondidas totalmente para remover todas as contribuições para dispersão observada.
Apresentamos aqui um protocolo para manipular o contraste de nêutrons de micelas detergentes pela incorporação de moléculas de detergente quimicamente idênticas com cadeias alquila deutério-rotulados. 19 , 36 , 37 isto permite completo contraste simultâneo de correspondência do micelle núcleo e casca, que é um recurso exclusivo de dispersão de nêutrons. 35 , 38 com este significativamente refinado nível de detalhe, correspondência de contraste pode habilitar caso contrário inviáveis estudos de estruturas de proteínas de membrana. Além disso, esta abordagem de correspondência de contraste pode ser estendida para outros sistemas que envolvem detergente, como polímero troca reações dispersantes óleo-água e39 ,40 ou até mesmo outros agentes solubilizante, tais como bicelles,41 nanodiscs,42 ou bloco de copolímeros. 43 A abordagem semelhante como descrito neste manuscrito, mas empregando uma única espécie de detergente com substituições de deutério parcial sobre o grupo alquila de cadeia e/ou cabeça, foi recentemente publicada. 37 enquanto isso pode ser esperado para melhorar a distribuição aleatória de hidrogênio e deutério em todo o detergente em comparação com a abordagem apresentada aqui, o número limitado de posições disponíveis sobre o detergente para substituição e em duas etapas síntese de detergente necessário coloca desafios adicionais para a consideração.
As etapas 1 e 2 do Protocolo detalhado abaixo muitas vezes sobrepõem-se desde o planejamento do experimento inicial deve ser feito para apresentar uma proposta de qualidade. No entanto, a apresentação de proposta é considerada aqui como o primeiro passo para enfatizar que esse processo deve ser iniciado bem antes de um experimento de nêutrons. Também deve ser notado que um passo pré-requisito, que deve ser demonstrado pela proposta, é a caracterização bioquímica e física (incluindo pureza e estabilidade) da amostra apoiando a necessidade de estudos de nêutrons. Uma discussão geral do ângulo pequeno neutrão espalhamento (SANS) está além do escopo deste artigo. Uma introdução breve, mas completa está disponível na obra de referência, Caracterização de materiais por Kaufmann,44 e uma abrangente livro focado em pequeno ângulo solução biológica dispersando recentemente tem sido publicado. 45 -mais leitura recomendada é dado na seção de discussão. Dispersão de ângulo pequeno usa o vetor de dispersão chamado Q como a quantidade de central que descreve o processo de espalhamento. Este artigo usa a definição amplamente aceita Q = 4π sin (θ) / λ, onde θ é meio o ângulo entre o feixe de entrada e dispersado e λ é o comprimento de onda da radiação de nêutron em Angstroms. Outras definições existem que uso diferentes símbolos tais como está ' para o vetor de dispersão e que podem diferir por um fator 2 π ou usando nanômetros no lugar de Angstrom (Veja também a discussão da Figura 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

O instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo biológico no alto fluxo Isotope Reactor de Oak Ridge National Laboratory dedica-se à investigação de materiais biológicos, processamento de biocombustíveis e materiais bio-inspirado cobrindo nanômetros para escalas de comprimento do micrômetro. Os métodos apresentados aqui para investigar propriedades físicas (ou seja, o tamanho e forma) de proteínas de membrana (aqui, MmIAP, um intramembrane aspartil protease de Methanoculleus marisnigri) em soluções de formação de micela detergentes são well-suited para este instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo, entre outros. Outras técnicas de caracterização biofísica são prejudicadas por sua incapacidade de abordar as contribuições de detergente em uma estrutura complexa de proteína-detergente. Além disso, o acesso ao laboratório de Bio-Deuteration fornece recursos exclusivos para a preparação de cultivos em grande escala e expressando proteínas deutério-labeled pelo sinal de maior dispersão da proteína. Enquanto esta técnica não fornece detalhes estruturais em alta resolução, a lacuna de conhecimento estrutural para proteínas de membrana contém muitas áreas endereçáveis de pesquisa sem a necessidade de resolução atômica perto. Por exemplo, estas áreas incluem a determinação dos Estados oligoméricos, a formação do complexo, a mudanças conformacionais durante a perturbação e eventos de dobradura/revelação. Estas investigações podem ser facilmente realizadas através de aplicações deste método.

Uma proposta de tempo e instrumento de feixe claramente deve transmitir todas as informações necessárias para o Comitê de revisão para que uma avaliação válida do experimento proposto pode ser feita. Comunicação com um NSS é altamente recomendada para usuários inexperientes. O NSS podem avaliar a viabilidade inicial e apresentação de proposta de guia para enfatizar o potencial para a ciência de alto impacto, segurança e viabilidade. As informações fornecidas na proposta ...

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Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

Este protocolo demonstra como obter um modelo de baixa resolução ab initio e detalhes estruturais de uma proteína de membrana detergente-solubilizado em solução usando dispersão de nêutrons de ângulo pequeno com correspondência de contraste do detergente.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre proteínas de membrana integral, como o estado oligomerico, seu tamanho, forma geral e estrutura de baixa resolução na solução. Estudos de solução de proteínas de membrana requer moléculas estabilizadoras como detergentes. Essa técnica tem a vantagem de que torna os detergentes invisíveis e destaca o sinal da proteína da membrana.As implicações dessa técnica se estendem a muitas questões de pesquisa biológica e médica porque mais de 1/3 das proteínas residem em membranas onde realizam muitas funções celulares vitais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a rotulagem de deutério e as etapas de dispersão de nêutrons são difíceis de aprender porque pouquíssimas instituições oferecem treinamento nessas técnicas. Para começar, determine densidades de comprimento de dispersão de nêutrons ou SLDs usando o aplicativo web MULCh, módulos para a análise de dados de variação de contraste.Abra o módulo de contraste clicando em contraste localizado no painel de navegação esquerdo. Forneça texto para um título de projeto e insira os detalhes abaixo para dois componentes como subunnit um e subunit dois. Digite a fórmula molecular de cada componente na caixa de texto da fórmula.Em seguida, digite o volume em angstroms cúbicos para cada componente na caixa abaixo do volume. Por fim, digite os detalhes para componentes de buffer. Clique em enviar para realizar os cálculos de contraste de nêutrons.Uma página de resultados é gerada que fornece uma tabela de densidade de comprimento de dispersão e match points de contraste, bem como fórmulas para determinar esses parâmetros em qualquer porcentagem de D2O no buffer. Revise os parâmetros de dispersão com especial atenção aos match points de contraste do componente. Crescer células E.coli abrigando um vetor de expressão indutível para a sequência proteica alvo em meio LB para uma densidade óptica a 600 nanômetros ou OD 600 de aproximadamente um.Adapte as células E.coli ao deutério rotulado de meio antes de escalar para a expressão excessiva de uma proteína deuterada diluindo a cultura LB de um a 20 em três mililitros de meio mínimo. Depois de crescer para um OD 600 de aproximadamente um, repita o de uma a 20 diluições usando meio mínimo contendo 50, 75 e 100% D2O. Uma vez adaptado, continue crescendo a cultura em um bioreator para aumentar o rendimento da massa celular deuterada.À medida que o conteúdo D2O é aumentado, as taxas de crescimento diminuirão. Proceder à colheita, lise e purificação de células conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida equilibre uma coluna de exclusão de tamanho com volumes maiores que duas colunas de buffer de troca final usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida.Após injetar a amostra, execute a coluna em frações isoladas correspondentes à proteína de interesse. Reserve uma alíquota de tampão compatível para dispersão de nêutrons de pequeno ângulo ou subtração de fundo SANS. Para coletar dados sans, primeiro carregar amostras e buffers em células de quartzo.Depois de garantir que o obturador do feixe esteja fechado, aproxime-se da área do ambiente da amostra e coloque as células de quartzo no trocador de amostras. Regisso destaque para cada célula amostral. Verifique a área e certifique-se de que o caminho do feixe está livre de obstrução antes de sair da área do ambiente da amostra.Em seguida, abra o obturador do feixe. Execute uma varredura de tabela para coleta automatizada de dados. Siga as instruções para a operação do instrumento fornecidas pelo cientista de dispersão de nêutrons.Use o software Mantid Plot e o script Python para a redução dos dados SANS de uma imagem 2D para um plot 1D. Para isso, faça login no cluster de análise remota e execute o plano Mantid da linha de comando. Em seguida, abra o script de redução do usuário fornecido e coloque os números de varredura correspondentes ou identificação para a amostra em pares de buffer na lista apropriada.Execute o script para gerar dados reduzidos como um arquivo de texto de quatro colunas no local especificado. Clique com o botão direito do mouse no espaço de trabalho apropriado e no enredo mantid e selecione plot com erros para um exame inicial dos perfis de dispersão. Baixe o conjunto de software ATSAS e use o PRIMUS para plotagem de dados, escala de buffer e subtração e análises de Guinier.Inicie o aplicativo de análise de dados ATSAS, SAS e carregue os arquivos de dados reduzidos correspondentes ao par de amostras e buffer. Para dimensionar o buffer corretamente, selecione a faixa de dados em Q alto, onde ambos os perfis são semelhantes em plano e clique no botão de escala localizado sob a guia de operações. Aumente o intervalo de dados para visualizar todos os pontos, clique em subtrair para realizar esta operação.Realize uma análise guinier dos dados amostrais subtraídos do buffer usando a guia de análise do aplicativo de análise de dados SAS. Certifique-se de que o arquivo adequado está selecionado na lista e clique em raio de giro. Uma tentativa automatizada de realizar um ajuste Guinier será fornecida clicando no botão RG automático.Expanda a gama de dados usados para incluir todos os dados Q baixos e comece a reduzir o intervalo de dados tirando pontos Q altos até que o limite de RG máximo q esteja abaixo de 1,3. Use o gráfico de resíduos para verificar se os dados são lineares na faixa de ajuste. Faça pequenos ajustes na região de ajuste e monitore a sensibilidade desses valores à gama de dados utilizados no ajuste.Obtenha a função de distribuição de probabilidade P de R no gnomo. Agora inicie o assistente de distribuição de distância dentro da guia de análise. Obter um bom ajuste aos dados é essencial para a obtenção de um modelo de qualidade.Determine Dmax, a distância interatômica máxima dentro da molécula. Estime um valor para Dmax desmarcando a caixa para forçar Rmax igual a zero e digitando um grande valor para Dmax. A primeira interceptação X na trama de P de R rende esta estimativa.Faça alterações incrementais nesse valor Dmax, bem como a gama de dados utilizados para o número de pontos usados para otimizar o gnomo adequado aos dados e à curva P de R resultante. Inicie o assistente de forma PRIMUS a partir do botão dammif na guia de análise da análise de dados SAS e use uma seleção manual de parâmetros. Defina a gama Guinier desde o ajuste e prossiga para o próximo passo usando os botões de navegação.Defina valores de ajuste a partir do gráfico P de R e proceda para o próximo passo. Fornecer parâmetros para o processo de modelagem ab initio. Em seguida, inicie o processo usando o botão cometer.Sobreponha e sobreponha o envelope final sans com um modelo relacionado de alta resolução usando supcomb dentro do ATSAS. Coloque uma cópia do modelo PDB de alta resolução para caber no envelope SANS no diretório de trabalho. Em seguida, execute supcomb da linha de comando usando os nomes dos arquivos PDB como dois argumentos com a estrutura de modelo listada primeiro.Finalmente visualize os resultados do modelo ab initio usando o PyMOL, um programa de visualização de gráficos moleculares 3D. Uma vez que o envelope SANS e a estrutura de alta resolução tenham sido sobrepostos, esses modelos podem ser visualizados usando qualquer programa de visualização de gráficos moleculares. Uma visão geral do processo de visualização do PyMOL é mostrada.Uma vez que os arquivos de estrutura PDB tenham sido abertos em PyMOL, os modelos devem ser visíveis na janela do visualizador PyMOL. As representações de cada modelo podem ser alteradas usando o botão S ao lado de cada nome do arquivo. Aqui uma representação superficial é usada para o envelope SANS e uma representação de desenho animado é usada para a espinha dorsal da proteína do modelo de alta resolução.Um esquema de cores adequado pode ser selecionado entre as opções disponíveis no botão C. Para cadeias proteicas, uma coloração de chainbow fornece um gradiente de cor de n a c terminus para auxiliar a interpretação. A transparência é aplicada à representação superficial para permitir uma melhor visualização da estrutura proteica dentro do envelope.Para imagens de publicação, recomenda-se um fundo branco. Uma vez que essas pistas de visualização tenham sido aplicadas, as estruturas 3D podem ser examinadas clicando e arrastando a estrutura. Manipulações da perspectiva e rotação de moléculas e tradução podem ser realizadas.Ao tentar este procedimento é importante lembrar-se de combinar com precisão o contraste de nêutrons dos grupos de cabeça e cauda detergente com o solvente D2O H2O. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para explorar a estrutura de proteases intramembrana asparto. Essas proteínas estão envolvidas na resposta imune, hepatite C e doença de Alzheimer.Não se esqueça que trabalhar em laboratórios bioquímicos e em instalações de vigas de nêutrons pode ser perigoso. Precauções como usar equipamentos de proteção individual e seguir todas as regras de segurança das instalações e postagens radiológicas são obrigatórias durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Crescimento de cristais de proteína com dimensões distintas usando automatizado cristalização juntamente com In Situ Difusão dinâmica da luz

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Estudos estruturais de macromoléculas em solução usando o pequeno ângulo de espalhamento de raios-x

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Cromatografia de troca iónica (IEX) acoplada ao multi-ângulo espalhamento de luz (MALS) para caracterização e separação de proteínas

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...