Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
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La oficina de biológicos y la investigación ambiental apoyan la investigación en el centro del ORNL para Biología Molecular estructural (CSMB) y Bio-SANS utilizando el apoyo de la división de instalaciones de usuario científica, oficina de ciencias básicas de energía, del Departamento de la energía. Trabajo estructural en las proteínas de membrana en el laboratorio de Lieberman ha sido apoyado por los NIH (DK091357, GM095638) y NSF (0845445).

1. preparar y presentar una propuesta de instrumento y neutrones instalación haz tiempo
<ol><li>Consultar recursos en línea para identificar servicios de dispersión de neutrones que acceso usuario general neutrón viga tiempo, como laboratorio nacional de Oak Ridge (ORNL). Mapa de neutrón instalaciones e información sobre la investigación del neutrón en todo el mundo está disponible en línea. 46 ten en cuenta que estas instalaciones tienen convocatorias periódicas de propuestas; determ...

Investigadores de biología estructural, aprovechando técnicas estructurales complementarias como dispersión de la solución para obtener los datos bioquímicos y estructurales (tales como tamaño y forma) de biomoléculas en solución. SANS es una técnica particularmente atractiva para determinar estructuras de proteínas de membrana de baja resolución, un centro de atención de la moderna biología estructural y bioquímica. SANS requiere cantidades de proteínas purificadas comparables a las de los ensayos cristal...

Proteínas de membrana están codificadas por aproximadamente el 30% de todos los genes1 y representan una gran mayoría de objetivos de medicamentos modernos. 2 estas proteínas realizan una amplia gama de funciones celulares vitales,3 pero a pesar de su abundancia e importancia — sólo representan alrededor del 1% de estructuras total depositado en la investigación Collaboratory para bioinformática estructural (RCSB) proteína Banco de datos. 4 debido a su naturaleza parcialmente hidrofóbica, determinación estructural de proteínas de membrana-limite ha sido sumamente difícil. 5 , 6 , 7
Como muchas técnicas biofísicas requieren monodispersa partículas en solución para la medición, aislamiento de proteínas de la membrana de las membranas nativas y estabilización de estas proteínas en un imitador soluble de las membranas nativas ha sido un área activa de investigación en los últimos décadas. 8 , 9 , 10 estas investigaciones han llevado al desarrollo de muchas asambleas de novela anfifílicos para solubilizar proteínas de membrana, tales como nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 y amphipols. 16 , 17 sin embargo, el uso de micelas de detergente sigue siendo uno de los enfoques más comunes y sencillos para satisfacer los requisitos de la solubilidad de una proteína determinada. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 por desgracia, no solo detergente mágica mezcla de detergentes actualmente existe o que cumpla con todas las proteínas de la membrana; así, estas condiciones deben ser defendidas empíricamente para los requerimientos únicos de cada proteína. 26 , 27
Detergentes uno mismo-montan en la solución por encima de su concentración micelar crítica para formar estructuras de agregados llamadas micelas. Micelas están compuestas de muchos monómeros detergentes (típicamente entre 20-200) con cadenas alkyl hidrofóbica formando un núcleo micelar e hidrofílicos grupos cabeza dispuestos en una capa de cáscara de micela hacia el disolvente acuoso. El comportamiento de la formación de la micela y los detergentes ha sido clásicamente descrito por Charles Tanford en El efecto hidrofóbico,28 y tamaños y formas de micelas de los detergentes comúnmente usados en estudios de proteínas de membrana han sido caracteriza usando dispersión de ángulo pequeño. 29 , 30 organización de detergente sobre las proteínas de la membrana también se ha estudiado, y se espera la formación de complejos de proteína-detergente (PDC) con las moléculas de detergente que rodean la proteína en un arreglo que se asemeja al detergente limpio micelas. 31
Añade una ventaja en el uso de detergentes es que las propiedades resultantes de la micela pueden manipularse mediante la incorporación de otros detergentes. Muchos detergentes exhiben mezcla ideal, y seleccione Propiedades de micelas mixtas se pueden incluso predecir de los componentes y la relación de la mezcla. 22 sin embargo, la presencia de detergente puede todavía presentar desafíos para caracterizaciones biofísicas contribuyendo a la señal total. Por ejemplo, con rayos x y técnicas de dispersión de la luz, la señal de detergente en el PDC es prácticamente indistinguible de la proteína. 32 investigaciones con microscopia del cryo-electrón de solo-partícula (cryo-EM) normalmente dependen de atrapadas partículas (congeladas); detalles estructurales de la proteína son todavía oscurecidos por ciertos detergentes o una alta concentración de detergente que se añade a un segundo plano. 33 enfoques alternativos para interpretar la estructura PDC completa (incluyendo el detergente) se han hecho a través de métodos computacionales que pretenden reconstruir el detergente alrededor de una proteína de membrana dada. 34
Para el caso de dispersión de neutrones, el arreglo de core-shell de detergente en la micela produce un factor de forma que contribuye a la dispersión observada. Afortunadamente, se pueden alterar componentes de la solución tal que no contribuyen a la dispersión observada neta. Este proceso de "coincidencia de contraste" se consigue sustituyendo el deuterio por hidrógeno alcanzar una densidad de longitud de dispersión que coincide con el del fondo (buffer). Deben considerarse una elección juiciosa del detergente (con contrapartes deuterados disponibles) y su proporción de la mezcla. De micelas de detergente, esta sustitución puede realizarse usando un detergente con el mismo grupo de cabeza pero con una cadena alquil deuterados (d-cola en lugar de h-cola). Puesto que los detergentes están bien mezclados,35 los agregados tendrán una densidad de longitud de dispersión que es la fracción molar ponderada promedio de los dos componentes (h-colas y colas de d). Cuando este contraste promedio es consistente con el grupo de cabeza, las estructuras agregadas uniforme pueden combinarse completamente para quitar todas las contribuciones a la dispersión observada.
Presentamos aquí un protocolo para manipular el contraste de neutrón de micelas de detergente mediante la incorporación de moléculas detergentes químicamente idénticas con cadenas alkyl marcado con deuterio. 19 , 36 , 37 esto permite completo contraste simultáneo que empareja del núcleo micelar y la cáscara, que es una capacidad única de dispersión de neutrones. 35 , 38 este significativamente refinado nivel de detalle, coincidencia de contraste permiten lo contrario inviables estudios de estructuras de proteínas de membrana. Además, este enfoque de contraste de coincidencia se podría extender a otros sistemas con detergente, como intercambio de polímero reacciones39 y aceite-agua dispersantes,40 o incluso otros agentes solubilizantes, como bicelles,41 nanodiscs,42 o bloque copolímeros. Enfoque similar 43 A como se describe en este manuscrito, pero empleando una sola especie de detergente con sustituciones parciales del deuterio en el grupo alquil de cadena o cabeza, se publicó recientemente. 37 mientras que esto puede ser para mejorar la distribución aleatoria de hidrógeno y deuterio en el detergente en comparación con el enfoque presentado aquí, el número limitado de posiciones disponibles en el detergente para sustitución y dos etapas síntesis de detergente necesaria plantea retos adicionales para su consideración.
Pasos 1 y 2 del protocolo que se detallan a continuación a menudo se superponen puesto que el experimento inicial planificación debe hacerse para presentar una propuesta de calidad. Sin embargo, la presentación de propuesta se considera aquí como el primer paso para destacar que este proceso debe comenzar antes de un experimento de neutrones. Cabe señalar que un paso necesario, que debe ser demostrado por la propuesta, es que la caracterización bioquímica y física (incluyendo la pureza y estabilidad) de la muestra apoya la necesidad de estudios de neutrones. Una discusión general de ángulo pequeño neutrón dispersión (SANS) está fuera del alcance de este artículo. Una introducción breve pero exhaustiva está disponible en la obra de referencia de Caracterización de materiales por Kaufmann,44 y una solución integral de libros de texto enfocada en biológico ángulo pequeño dispersión ha sido publicado recientemente. 45 más lectura recomendada es dada en la sección de discusión. Dispersión de ángulo pequeño utiliza el llamado vector de dispersión Q como la cantidad central que describe el proceso de dispersión. Este artículo utiliza la definición ampliamente aceptada Q = 4π pecado (θ) / λ, donde θ es la mitad el ángulo entre la viga entrante y dispersa y λ es la longitud de onda de la radiación de neutrón en Angstroms. Existen otras definiciones que uso diferentes símbolos tales como ' por el vector de dispersión y que puede variar por un factor 2π o mediante nanómetros en lugar de Angstrom (véase también discusión de la figura 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

El instrumento de dispersión biológica small-angle neutron en el alto flujo isótopo Reactor de Oak Ridge National Laboratory se dedica a la investigación de materiales biológicos, biocombustible procesado y materiales Bioinspirados cubriendo nanómetro a escalas de la longitud del micrómetro. Los métodos presentados aquí para investigar las propiedades físicas (es decir, tamaño y forma) de proteínas de membrana (aquí, MmIAP, una intramembranosas aspartil proteasa de Methanoculleus marisnigri) en soluciones de formación de micelas son detergentes adecuado de este instrumento de dispersión de ángulo pequeño neutrón, entre otros. Otras técnicas de caracterización biofísica se ven obstaculizados por su incapacidad para abordar las contribuciones detergentes en una estructura compleja de proteína-detergente. Además, el acceso al laboratorio Bio-grado de deuteración ofrece capacidades únicas para la preparación de cultivos a gran escala y expresión de proteínas marcado con deuterio para mayor dispersión de la señal de la proteína. Mientras que esta técnica no proporciona los detalles estructurales en alta resolución, la brecha de conocimiento estructural de proteínas de la membrana contiene muchas zonas direccionables de investigación sin necesidad de resolución atómica cerca. Por ejemplo, estas áreas incluyen la determinación de los Estados, formación de complejos, cambios conformacionales durante la perturbación y eventos plegar/desplegar. Estas investigaciones se pueden lograr fácilmente a través de aplicaciones de este método.

Una propuesta de instrumento y tiempo de viga debe transmitir claramente toda la información necesaria al Comité de revisión para que se puede hacer una evaluación válida del experimento propuesto. Comunicación con un NSS es altamente sugerido para usuarios inexpertos. El SNA puede evaluar viabilidad inicial y presentación de propuesta de guía para enfatizar el potencial para la ciencia de alto impacto, viabilidad y seguridad. La información proporcionada en la propuesta debe inc...

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Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Coincidencia de contraste detergente en Small-Angle Neutron Scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado Ab Initio

Este protocolo muestra cómo obtener un modelo de baja resolución ab initio y detalles estructurales de una proteína de membrana de detergente solubilizado en solución mediante dispersión de neutrones de ángulo pequeño con coincidencia de contraste del detergente.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las proteínas de membrana integral como el estado oligomérico, su tamaño, forma general y estructura de baja resolución en solución. Los estudios de soluciones de proteínas de membrana requieren estabilizar moléculas como detergentes. Esta técnica tiene la ventaja de que hace que los detergentes sean invisibles y resalta la señal de la proteína de membrana.Las implicaciones de esta técnica se extienden a muchas preguntas de investigación biológica y médica porque más de 1/3 de proteínas residen en membranas donde realizan muchas funciones celulares vitales. La demostración visual de este método es fundamental ya que el etiquetado de deuterio y los pasos de dispersión de neutrones son difíciles de aprender porque muy pocas instituciones ofrecen capacitación en estas técnicas. Para empezar, determine las densidades de longitud de dispersión de neutrones o SLD utilizando la aplicación web MULCh, módulos para el análisis de datos de variación de contraste.Abra el módulo de contraste haciendo clic en contraste situado en el panel de navegación izquierdo. Proporcione texto para un título de proyecto e introduzca los detalles siguientes para dos componentes como subunidad uno y subunidad dos. Introduzca la fórmula molecular para cada componente en el cuadro de texto de fórmula.A continuación, introduzca el volumen en angstroms cúbicos para cada componente en el cuadro de abajo del volumen. Por último, introduzca los detalles de los componentes de búfer. Haga clic en Enviar para realizar los cálculos de contraste de neutrones.Se genera una página de resultados que proporciona una tabla de densidad de longitud de dispersión y puntos de coincidencia de contraste, así como fórmulas para determinar estos parámetros en un porcentaje determinado de D2O en el búfer. Revise los parámetros de dispersión con especial atención a los puntos de coincidencia de contraste del componente. Cultivar células de E. coli que albergan un vector de expresión inducible para la secuencia de proteínas diana en medio LB a una densidad óptica a 600 nanómetros o OD 600 de aproximadamente uno.Adaptar las células de E. coli al medio de deuterio etiquetado antes de escalar para la expresión excesiva de una proteína deuterada diluyendo el cultivo de LB de uno a 20 en tres mililitros de medio mínimo. Después de crecer a un OD 600 de aproximadamente uno, repita la de una a 20 diluciones utilizando un medio mínimo que contenga 50, 75 y 100%D2O. Una vez adaptado, continuar creciendo el cultivo en un biorreactor para aumentar el rendimiento de la masa celular deuterated.A medida que aumenta el contenido de D2O, las tasas de crecimiento disminuirán. Proceder a la cosecha, lanse y purificar las células como se describe en el protocolo de texto. A continuación, equilibre una columna de exclusión de tamaño con volúmenes superiores a dos columnas de tampón de intercambio final utilizando un sistema de cromatografía líquida proteica rápida.Después de inyectar la muestra, ejecute la columna en fracciones aisladas correspondientes a la proteína de interés. Reserve una alícuota de búfer coincidente para la dispersión de neutrones de ángulo pequeño o la resta de fondo SANS. Para recopilar datos SANS, primero cargue muestras y búferes en celdas de cuarzo.Después de asegurarse de que el obturador del haz está cerrado, acérquese al área del entorno de la muestra y coloque las celdas de cuarzo en el cambiador de muestras. Registre la posición del cambiador de muestra para cada celda de muestra. Compruebe el área y asegúrese de que la trayectoria de la viga esté libre de obstrucciones antes de salir del área del entorno de la muestra.A continuación, abra el obturador de la viga. Ejecute un análisis de tabla para la recopilación automatizada de datos. Siga las instrucciones para el funcionamiento del instrumento proporcionadas por el científico de dispersión de neutrones.Utilice el software Mantid Plot y la secuencia de comandos de Python para la reducción de datos SANS de una imagen 2D a una gráfica 1D. Para ello, inicie sesión en el clúster de análisis remoto y ejecute el trazado Mantid desde la línea de comandos. A continuación, abra el script de reducción de usuario proporcionado y coloque los números de análisis o la identificación correspondientes para la muestra en pares de búferes en la lista adecuada.Ejecute el script para generar datos reducidos como un archivo de texto de cuatro columnas en la ubicación especificada. Haga clic con el botón derecho en el espacio de trabajo adecuado y en el trazado mantid y seleccione el trazado con errores para un examen inicial de los perfiles de dispersión. Descargue la suite de software ATSAS y utilice PRIMUS para el trazado de datos, el escalado y la resta de búferes y el análisis de Guinier.Inicie la aplicación de análisis de datos ATSAS, SAS y cargue los archivos de datos reducidos correspondientes al par de ejemplo y búfer. Para escalar el búfer correctamente, seleccione el rango de datos en Q alta donde ambos perfiles son similares en plano y haga clic en el botón de escala situado debajo de la pestaña de operaciones. Aumente el rango de datos para ver todos los puntos, haga clic en restar para realizar esta operación.Realice un análisis Guinier de los datos de muestra restados por búfer mediante la pestaña de análisis de la aplicación de análisis de datos SAS. Asegúrese de que el archivo adecuado está seleccionado en la lista y haga clic en el radio de giro. Se proporcionará un intento automatizado de realizar un ajuste Guinier haciendo clic en el botón auto RG.Amplíe el rango de datos utilizados para incluir todos los datos Q bajos y comience a reducir el rango de datos quitando puntos Q altos hasta que el límite Q max veces RG esté por debajo de 1.3. Utilice la gráfica de residuos para comprobar que los datos son lineales en el rango de ajuste. Realice pequeños ajustes en la región de ajuste y supervise la sensibilidad de estos valores al rango de datos utilizados en el ajuste.Obtenga la función de distribución de probabilidad P de R en gnome. Ahora inicie el asistente de distribución de distancia en la pestaña de análisis. La obtención de un buen ajuste a los datos es esencial para obtener un modelo de calidad.Determinar Dmax, la distancia interatómica máxima dentro de la molécula. Estimar un valor para Dmax desmarcando la casilla para forzar Rmax es igual a cero e introduciendo un valor grande para Dmax. La primera intercepción X en la gráfica de P de R produce esta estimación.Realice cambios incrementales en este valor Dmax, así como en el rango de datos utilizados para el número de puntos utilizados para optimizar el ajuste del gnomo a los datos y a la P resultante de la curva R. Inicie el asistente de formas PRIMUS desde el botón dammif de la pestaña de análisis de datos SAS y utilice una selección manual de parámetros. Defina el rango Guinier desde el ajuste y continúe hasta el siguiente paso utilizando los botones de navegación.Defina los valores de ajuste a partir de la gráfica P de R y continúe con el paso siguiente. Proporcione parámetros para el proceso de modelado ab initio. A continuación, inicie el proceso con el botón de confirmación.Superponer y superponer el sobre sans final con un modelo de alta resolución relacionado usando supcomb dentro de ATSAS. Coloque una copia del modelo PDB de alta resolución que se ajuste al sobre SANS en el directorio de trabajo. A continuación, ejecute supcomb desde la línea de comandos utilizando los nombres de archivo PDB como dos argumentos con la estructura de plantilla enumerada en primer lugar.Por último, visualice los resultados del modelo ab initio utilizando PyMOL, un programa de visualización de gráficos moleculares 3D. Una vez superpuesta la envolvente SANS y la estructura de alta resolución, estos modelos se pueden visualizar utilizando cualquier programa de visualización de gráficos moleculares. Se muestra una visión general del proceso de visualización PyMOL.Una vez que los archivos de estructura PDB se han abierto en PyMOL, los modelos deben ser visibles en la ventana del visor PyMOL. Las representaciones de cada modelo se pueden cambiar mediante el botón S situado junto a cada nombre de archivo. Aquí se utiliza una representación de superficie para el sobre SANS y se utiliza una representación de dibujos animados para la columna vertebral de proteínas del modelo de alta resolución.Se puede seleccionar un esquema de color adecuado entre las opciones disponibles bajo el botón C. Para las cadenas de proteínas, un colorante de arco de cadena proporciona un gradiente de color de N a C terminus para ayudar a la interpretación. La transparencia se aplica a la representación de la superficie para permitir una mejor visualización de la estructura proteica dentro de la envolvente.Para las imágenes de publicación, se recomienda un fondo blanco. Una vez aplicadas estas indicaciones de visualización, las estructuras 3D se pueden examinar haciendo clic y arrastrando la estructura. Se pueden realizar manipulaciones de la perspectiva y la rotación y traducción de moléculas.Al intentar este procedimiento es importante recordar hacer coincidir con precisión el contraste de neutrones de los grupos de cabeza y cola del detergente con el disolvente D2O H2O. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para explorar la estructura de las proteasas intramembrana asparto. Estas proteínas están implicadas en la respuesta inmune, hepatitis C y la enfermedad de Alzheimer.No olvide que trabajar en laboratorios bioquímicos y en instalaciones de haz de neutrones puede ser peligroso. Las precauciones tales como el uso de equipos de protección personal y el cumplimiento de todas las normas de seguridad de las instalaciones y las publicaciones radiológicas son obligatorias al realizar este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Cristales de proteína creciente con distintas dimensiones usando automatizado de cristalización juntada con In Situ dispersión ligera dinámica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Estudios estructurales de las macromoléculas en solución mediante dispersión de rayos-x de ángulo pequeño

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Cromatografía de intercambio iónico (IEX) acoplada a la dispersión de la luz de múltiples ángulo (MALS) para caracterización y separación de proteínas

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caracterización de proteínas por cromatografía de exclusión de tamaño acoplada a dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...