Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Den kontor av biologiska- och miljöforskning stöds forskning vid ORNL'S Center för strukturella molekylärbiologi (CSMB) och Bio-SANS med faciliteter som stöds av vetenskapliga användaren faciliteter Division, Office av grundläggande Energivetenskaper, US Department av energi. Strukturella arbete på membranproteiner i Lieberman labbet har stötts av NIH (DK091357, GM095638) och NSF (0845445).

1. förbereda och lämna in en Neutron anläggning Beam tid och Instrument förslag
<ol><li>Konsultera online-resurser för att identifiera neutron scattering faciliteter som tillhandahåller allmänna neutron beam tid användaråtkomst, såsom Oak Ridge National Laboratory (ORNL). En karta över neutron faciliteter och information om neutron forskning över hela världen är tillgänglig online. 46 vara medveten om att dessa anläggningar normalt har regelbunden förslagsinfordringar. Detta avg...

Strukturbiologi forskare dra nytta av kompletterande strukturella metoder såsom lösning scattering få biokemiska och strukturella detaljer (t.ex. övergripande storleken och formen) från biomolekyler i lösning. SANS är en särskilt attraktiv teknik för bestämning av membranproteiner strukturer på låg upplösning, en kärna fokus modern strukturell biologi och biokemi. SANS kräver mängder renade proteiner jämförbara med kristallografiska studier (1 mg/prov). Den nyligen växande kommersiella tillgången av h...

Membranproteiner är kodade med uppskattningsvis 30% av alla gener1 och utgör en stark majoritet av mål för moderna läkemedel. 2 dessa proteiner utför ett brett spektrum av vitala cellulära funktioner,3 men trots deras överflöd och betydelse — endast utgör cirka 1 procent av totala strukturer deponeras i forsknings Collaboratory struktur Bioinformatik (RCSB) protein Data banken. 4 på grund av deras delvis hydrofoba karaktären, strukturella bestämning av membran-bundna proteiner har varit oerhört utmanande. 5 , 6 , 7
Eftersom många biofysiska tekniker kräver monodisperse partiklar i lösningen för mätning, har isolera membranproteiner från infödda membran och stabilisera dessa proteiner i en löslig härma av infödda membran varit ett aktivt område av forskning under de senaste årtiondena. 8 , 9 , 10 det undersökningarna har lett till utvecklingen av många roman amfifila församlingar till solubilize membranproteiner, såsom nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 och amphipols. 16 , 17 , användning av rengöringsmedel miceller förblir dock en av de vanligaste och enkla metoderna för att tillfredsställa löslighet kraven i ett visst protein. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 tyvärr ingen enda tvättmedel eller magiska blandning av rengöringsmedel för närvarande finns som uppfyller alla membranproteiner; Således måste dessa villkor undersökas empiriskt för de unika kraven i varje protein. 26 , 27
Rengöringsmedel montera själv i lösning över deras kritiska micelle koncentration att bilda sammanlagda strukturer kallas miceller. Miceller består av många tvättmedel monomerer (vanligtvis mellan 20-200) med hydrofoba alkyl kedjor bildar en micelle kärna och hydrofil huvud grupper ordnade i ett micelle skallager inför det vattenbaserade lösningsmedlet. Uppförandet av tvättmedel och micelle bildning klassiskt har beskrivits av Charles Tanford i Det hydrofoba effekten,28 och storlekar och former av miceller från vanliga tvättmedel i membran protein studier har varit kännetecknas med liten vinkel spridning. 29 , 30 tvättmedel organisation om membranproteiner har också undersökts, och bildandet av protein-tvättmedel komplex (PDC) förväntas med tvättmedel molekyler kring proteinet i ett arrangemang som liknar den snyggt diskmedel miceller. 31
En tillsatt fördelen i att använda rengöringsmedel är att de resulterande micelle egenskaperna kan manipuleras genom att införliva andra rengöringsmedel. Många rengöringsmedel uppvisar perfekt blandning, och välj egenskaper av blandade miceller kan även förutsägas från komponenter och förhållandet mellan blandning. 22 men förekomsten av rengöringsmedel kan fortfarande presenterar utmaningar för biofysiska karakteriseringar genom att bidra till den övergripande signalen. Exempelvis med röntgen och ljusspridning tekniker är signalen från tvättmedel i PDC praktiskt taget omöjlig att skilja från protein. 32 utredningar med singel-particle kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) normalt förlitar sig på instängd (fryst) partiklar; strukturella Detaljer av proteinet är fortfarande skyms av vissa tvättmedel eller en hög koncentration av tvättmedel som läggs till i bakgrunden. 33 alternativa metoder mot tolka full PDC-strukturen (inklusive tvättmedel) har gjorts genom beräkningsmetoder som syftar till att rekonstruera tvättmedel runt en given membranprotein. 34
För fallet av neutronspridning producerar core-shell arrangemanget av tvättmedel i micelle en formfaktor som bidrar till den observerade spridningen. Lyckligtvis kan komponenter ändras så att de inte bidrar till netto observerade spridningen. ”Kontrast matchande” processen uppnås genom att ersätta deuterium för vätgas att uppnå en scattering längd täthet som matchar bakgrunden (buffert). Ett klokt val av tvättmedel (med tillgängliga deutererade motsvarigheter) och deras förhållande av blandning måste beaktas. För tvättmedel miceller, kan denna substitution utföras med ett rengöringsmedel med samma huvud grupp men har en deutererade alkyl kedja (d-svans i stället för h-tail). Eftersom tvätt är väl blandade,35 deras aggregat har en spridning längd täthet som är den mole-fraktionen vägt genomsnitt av de två komponenterna (h-svansar och d-tails). När denna genomsnittliga kontrast är konsistent med gruppen huvud, kan de enhetliga sammanlagda strukturerna matchas helt för att ta bort alla bidrag till observerade spridning.
Vi presenterar här ett protokoll för att manipulera tvättmedel miceller neutron kontrast genom att införliva kemiskt identiska tvättmedel molekyler med deuterium-märkt alkyl kedjor. 19 , 36 , 37 Detta möjliggör komplett samtidig kontrast matchning av micelle kärna och skal, som är en unik funktion av neutronspridning. 35 , 38 med denna betydligt raffinerade detaljnivå, kontrast matchande kan aktivera annars omöjligt studier av protein membranstrukturer. Dessutom skulle denna kontrast-matchande strategi kunna utvidgas till andra system med rengöringsmedel, såsom polymer exchange reaktioner39 och olja-vatten dispergeringsmedel,40 eller även andra solubilizing medel, såsom bicelles,41 nanodiscs,42 eller block sampolymerer. 43 A liknande tillvägagångssätt som beskrivs i detta manuskript, men sysselsätter en enda tvättmedel art med partiell deuterium substitutioner på alkyl kedja eller huvud grupp, publicerades nyligen. 37 även om detta kan förväntas förbättra den slumpmässiga fördelningen av väte och deuterium i hela tvättmedel jämfört med den strategi som presenteras här, det begränsade antalet tillgängliga positioner på tvättmedel för substitution och tvåstegsverifiering rengöringsmedel syntes krävs poser ytterligare utmaningar för bedömningen.
Steg 1 och 2 i protokollet beskrivs nedan ofta överlappar varandra eftersom första försöket planering måste göras för att lägga fram ett förslag om kvalitet. Förslaget inlämning anses dock här som det första steget att betona att denna process bör inledas i god tid före en neutron experiment. Det bör också noteras att ett nödvändigt steg, som ska styrkas med förslaget, är att ha biokemiska och fysikaliska karakterisering (inklusive renhet och stabilitet) av provet stödja behovet av neutron studier. En allmän diskussion av små-vinkel neutron scattering (SANS) är utanför ramen för denna artikel. En kort men grundlig introduktion finns i referensunderlag Karakterisering av material av Kaufmann,44 och en heltäckande lärobok fokuserade på biologiska small-angle lösning spridning har nyligen publicerats. 45 vidare Rekommenderad läsning ges i avsnittet diskussion. Liten vinkel scattering använder så kallade scattering vektorn Q som den centrala kvantitet som beskriver spridningen. Denna artikel använder allmänt accepterade definitionen Q = 4π synd (θ) / λ, där θ är halva vinkeln mellan inkommande och spridda balk och λ är våglängden av neutronstrålning i Ångström. Andra definitioner finns att använda olika symboler såsom 's' för spridning vektorn, och att skilja med en faktor 2π eller nanometer i stället för Ångström (se också diskussionen av figur 10).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

Det biologiska small-angle neutron scattering instrumentet på High-Flux isotopen reaktorn av Oak Ridge National Laboratory är tillägnad utredningen av biologiska material, biobränsle bearbetning och bio-inspirerade material som täcker nanometer till mikrometer längdskalor. De metoder som presenteras här för att utreda fysiska egenskaper (dvs., storlek och form) av membranproteiner (här, MmIAP, en intermembrana aspartyl proteashämmare från Methanoculleus marisnigri) i lösningar av micelle-bilda rengöringsmedel är väl lämpad för detta liten vinkel neutron scattering instrument, bland annat. Andra biofysiska karakterisering tekniker hindras av deras oförmåga att ta itu med tvättmedel bidragen i en protein-tvättmedel komplex struktur. Dessutom ger tillgång till Bio-Deuteration Lab unika möjligheter för att förbereda storskaliga odlingar och uttrycker deuterium-märkt proteiner för förbättrad spridning signal från proteinet. Medan detta teknik ger inte strukturella Detaljer på högupplösta, strukturella kunskapsluckorna för membranproteiner innehåller många adresserbara områden av forskning utan nära-atomär upplösning. Dessa områden omfattar exempelvis bestämning av Oligomera stater, komplexa bildande, konfirmerande förändringar under störning och vikning/utspelas händelser. Dessa undersökningar kan lätt åstadkommas genom tillämpningar av denna metod.

Beam tid och instrumentet förslag bör tydligt förmedla all information som behövs till utskottet för granskning så att en giltig bedömning av det föreslagna experimentet kan göras. Kommunikation med en NSS är bäst för oerfarna användare. NSS kan bedöma inledande genomförbarhet och guide förslag inlämning att betona genomförbarhet, säkerhet och risken för stor genomslagskraft vetenskap. Informationen i förslaget bör omfatta bakgrundsinformation och sammanhang för bet...

Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast-matchande tvättmedel i liten vinkel Neutron Scattering experiment för membran Protein strukturell analys och Ab Initio modellering

Detta protokoll visar hur du skaffar en lågupplöst rättsverkan modell och strukturella Detaljer för ett tvättmedel-solubilized membranprotein i lösningen med liten vinkel neutronspridning med kontrast-matchning av tvättmedel.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor om integral membran proteiner såsom oligomeric tillstånd, deras storlek, övergripande form och låg upplösning struktur i lösning. Lösningsstudier av membranproteiner kräver stabiliserande molekyler som rengöringsmedel. Denna teknik har fördelen att den gör tvättmedel osynliga och belyser signalen från membranproteinet.Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig till många biologiska och medicinska forskningsfrågor eftersom över 1/3 av proteiner finns i membran där de utför många vitala cellulära funktioner. Visuell demonstration av denna metod är kritisk eftersom deuteriummärkning och neutronspridningssteg är svåra att lära sig eftersom mycket få institutioner erbjuder utbildning i dessa tekniker. Till att börja bestämma neutron spridning längd tätheter eller SLDs med hjälp av webbapplikationen MULCh, moduler för analys av kontrast variation data.Öppna kontrastmodulen genom att klicka på kontrast som finns i det vänstra navigeringsfönstret. Ge text för en projektrubrik och ange detaljerna nedan för två komponenter som underenhet ett och underenhet två. Ange molekylformeln för varje komponent i formeltextrutan.Ange sedan volymen i kubisk ångström för varje komponent i rutan under volym. Ange slutligen detaljerna för buffertkomponenter. Klicka på skicka för att utföra beräkningarna neutron kontrast.En resultatsida genereras som ger en tabell över scattering längd densitet och kontrast match punkter samt formler för att fastställa dessa parametrar vid en viss andel av D2O i bufferten. Granska scattering parametrarna med särskild uppmärksamhet på komponentkontrast matchpunkter. Odla E.coli celler hysa ett inducerbart uttryck vektor för målet proteinsekvensen i LB medium till en optisk densitet vid 600 nanometer eller OD 600 av ungefär en.Anpassa E.coli celler till deuterium märkt medium före skala upp för över uttryck av ett deuterated protein genom att späda LB kulturen en till 20 i tre milliliter av minimalt medium. Efter att ha vuxit till en OD 600 på ungefär en, upprepa en till 20 utspädningar med minimalt medium som innehåller 50, 75 och 100%D2O. När den väl anpassats, fortsätta att odla kulturen i en bioreaktor för att öka avkastningen av deuterated cellmassa.Eftersom D2O-innehållet ökas kommer tillväxttakten att minska. Fortsätt att skörda, lyse och rena celler som beskrivs i textprotokollet. Nästa equilibrate en storlek uteslutning kolumn med större än två kolumn volymer av slutliga utbyte buffert med hjälp av en snabb protein vätskekromatografi system.Efter att ha injicerat provet, kör kolonnen i isolatfraktioner som motsvarar proteinet av intresse. Reservera en alikvot av matchad buffert för liten vinkel neutronspridning eller SANS bakgrund subtraktion. För att samla IN SANS-data, först ladda prover och buffertar i kvartsceller.När du har säkerställt att balken slutare är stängd, närma sig prov miljöområdet och placera kvartscellerna i prov växlaren. Registrera provändringspositionen för varje provcell. Kontrollera området och se till att strålbanan är fri från hinder innan du lämnar provmiljöområdet.Öppna sedan strålens slutare. Utför en tabellsökning för automatiserad datainsamling. Följ instruktionerna för instrumentdrift som neutronspridningsforskaren tillhandahåller.Använd Mantid Plot programvara och Python skript för minskning av SANS-data från en 2D-bild till en 1D-plot. För att göra det, logga in på fjärranalysklustret och kör Mantid-plot från kommandoraden. Öppna sedan det medföljande skriptet för användarreduktion och placera motsvarande scannummer eller identifiering för provet i buffertpar i lämplig lista.Utför skriptet för att generera förminskade data som en fyra kolumners textfil på den angivna platsen. Högerklicka på lämpligt arbetsutrymme och Mantid-plot och välj plot med fel för en första undersökning av spridningsprofilerna. Ladda ner ATSAS-programsviten och använd PRIMUS för dataplottning, buffertskalning och subtraktion och Guinier-analys.Starta ATSAS, SAS dataanalysapplikation och ladda de reducerade datafilerna som motsvarar prov- och buffertparet. Om du vill skala bufferten ordentligt väljer du dataområdet vid hög Q där båda profilerna är liknande i plan och klickar på skalningsknappen som finns under fliken operationer. Öka dataområdet för att visa alla punkter, klicka subtrahera för att utföra den här åtgärden.Utför en Guinier-analys av bufferten subtraherade exempeldata med analysfliken i SAS-dataanalysprogrammet. Var säker på att rätt fil är markerad i listan och klicka radie av gyration. Ett automatiserat försök att utföra en Guinier passform kommer att tillhandahållas genom att klicka på den automatiska RG-knappen.Utöka dataområdet som används för att inkludera alla de låga Q-data och börja minska dataområdet genom att ta bort höga Q-punkter tills Q max gånger RG-gränsen är under 1,3. Använd observationsområdet med rester för att kontrollera att data är linjära i passningsområdet. Gör små justeringar i området för passform och övervaka känsligheten hos dessa värden för det dataintervall som används i passformen.Erhåll sannolikhetsfördelningsfunktionen P av R i gnome. Nu startar avståndsfördelningsguiden inom analysfliken. Att få en bra passform till uppgifterna är avgörande för att få en kvalitetsmodell.Bestäm Dmax, det maximala interatomära avståndet inom molekylen. Uppskatta ett värde för Dmax genom att avmarkera rutan för att tvinga Rmax är lika med noll och ange ett stort värde för Dmax. Den första X-avlyssningen i handlingen i P av R ger denna uppskattning.Gör inkrementella ändringar i detta Dmax-värde samt det dataområde som används för antal punkter som används för att optimera gnomepassen till data och den resulterande P av R-kurvan. Starta formguiden för PRIMUS från dammif-knappen på analysfliken i SAS-dataanalys och använd ett manuellt urval av parametrar. Definiera Guinier-området från passformen och gå vidare till nästa steg med hjälp av navigeringsknapparna.Definiera lämpliga värden från P av R-plot och gå vidare till nästa steg. Tillhandahålla parametrar för ab initio-modelleringsprocessen. Inled sedan processen med hjälp av commit-knappen.Överlagra och överlagra den slutliga sans kuvert med en relaterad högupplöst modell med hjälp av supcomb inom ATSAS. Placera en kopia av den högupplösta PDB-modellen för att passa till SANS-kuvertet i arbetskatalogen. Sedan exekvera supcomb från kommandoraden med hjälp av FILB-filnamnen som två argument med mallstrukturen som anges först.Slutligen visualisera ab initio modellresultat med pymol, en 3D molekylär grafik visningsprogram. När SANS kuvert och högupplöst struktur har lagts ovanpå, kan dessa modeller visualiseras med hjälp av någon molekylär grafik visningsprogram. En översikt över PyMOL-visualiseringsprocessen visas.När PDB-strukturfilerna har öppnats i PyMOL ska modellerna synas i PyMOL-tittarfönstret. Representationerna av varje modell kan ändras med hjälp av S-knappen bredvid varje filnamn. Här används en ytrepresentation för SANS-kuvertet och en tecknad representation används för proteinstommen i högupplösningsmodellen.Ett lämpligt färgschema kan väljas bland de alternativ som finns under C-knappen. För proteinkedjor ger en kedjebågsfärg en färggradient från N till C ändstation till stödtolkning. Transparens appliceras på ytrepresentationen för att möjliggöra bättre visualisering av proteinstrukturen inom kuvertet.För publikationsbilder rekommenderas en vit bakgrund. När dessa visualiseringssignaler har tillämpats kan 3D-strukturerna undersökas genom att klicka och dra strukturen. Manipuler av perspektivet och molekylrotationen och översättningen kan utföras.Medan du försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att exakt matcha neutronkontrasten hos tvättmedelshuvud- och svansgrupper med D2O H2O-lösningsmedlet. Efter dess utveckling, banade denna teknik vägen för att utforska strukturen av intramembrane asparto proteaser. Dessa proteiner är involverade i immunsvaret, hepatit C och Alzheimers sjukdom.Glöm inte att det kan vara farligt att arbeta i biokemiska laboratorier och vid neutronstråleanläggningar. Försiktighetsåtgärder som att bära personlig skyddsutrustning och följa alla säkerhetsregler för anläggningen och radiologiska inlägg är obligatoriska när du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Att kombinera röntgenkristallografi med små Angle X-Ray Scattering att modellera ostrukturerade regioner av Nsa1 från S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisande av tvättmedel-känsliga samspelet mellan membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Jonbyteskromatografi (IEX) kopplat till multi-Angle ljusspridning (MALS) för Protein Separation och karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...