Name: contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Office biyolojik ve çevresel araştırma desteklenen araştırma ORNL'ın merkezi yapısal Moleküler Biyoloji (CSMB) ve biyografi-bilimsel Kullanıcı imkanları bölüm, temel enerji Bilimler Office, ABD Bakanlığı tarafından desteklenen özellikleri kullanarak SANS Enerji. Membran proteinlerinin Lieberman laboratuarında yapısal çalışmalarına NIH (DK091357, GM095638) tarafından desteklenen ve NSF (0845445).

1. hazırla ve bir nötron tesis ışın zaman ve enstrüman teklifi gönder
<ol><li>Genel Kullanıcı nötron ışın zaman erişim, gibi Oak Ridge National Laboratory (ORNL) sağlamak Nötron saçılma özellikleri belirlemek için online kaynaklarına başvurun. Nötron imkanları ve nötron araştırma dünya çapında hakkında bilgi çevrimiçi kullanılabilir. 46 bu tesisler genellikle normal görüşmeleri için teklif var unutmayın; Bu ne zaman sonraki ışın sırasında kullanılabil...

Yapısal biyoloji araştırmacılar biomolecules çözümünde biyokimyasal ve yapısal ayrıntılarını (örneğin, toplam boyut ve şekil) edinmek için çözüm saçılma gibi tamamlayıcı yapısal teknikleri yararlanmak. SANS belirlenmesi membran proteinlerinin düşük çözünürlüklü yapıları, modern yapısal biyoloji ve biyokimya bir çekirdek odak için özellikle çekici bir tekniktir. SANS saf protein crystallographic denemeler (1 mg/örnek) karşılaştırılabilir miktarda gerektirir. Yüksek saflıkta...

Membran proteinlerinin tüm genler1 yaklaşık %30 tarafından kodlanmış ve hedefler modern tıbbi ilaçlar için güçlü bir çoğunluğu temsil. 2 bu proteinler hayati hücresel fonksiyonların3 ama onların bereket ve önem rağmen geniş bir dizi gerçekleştirmek — yalnızca toplam yapıları içinde araştırma Collaboratory Yapısal Biyoinformatik (RCSB) Protein için yatırılan yaklaşık % 1'i temsil Veri Bankası. 4 kısmen hidrofobik kendi doğası nedeniyle membran bağlı proteinler yapısal belirlenmesi son derece zorlu olmuştur. 5 , 6 , 7
Birçok biyofiziksel teknikleri ölçüm için çözüm monodisperse parçacıklar gerektiği, membran proteinlerinin yerli membranlar üzerinden yalıtma ve yerel membranlar çözünür bir taklit bu proteinler sabitleme bir etkin alan araştırma son olmuştur on yıl. 8 , 9 , 10 bu soruşturmalar birçok roman amfifilik derlemeler geliştirme için zar proteinleri, nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 gibi solubilize yol açmıştır ve amphipols. 16 , 17 ancak, deterjan micelles kullanımı belirli bir protein çözünürlük gereksinimlerinin karşılanması için en yaygın ve basit yaklaşımların türlerindendir. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 ne yazık ki, hiçbir tek deterjan veya deterjanlar sihirli karışımı tüm membran proteinlerinin karşılayan şimdilik; Böylece, bu koşullar her protein benzersiz gereksinimleri için ampirik olarak taranması gerekir. 26 , 27
Deterjanlar kendi kritik micelle konsantrasyon yukarıda çözümünde micelles denilen formu toplu yapıların için kendini topla. Micelles (genellikle 20-200 çeşitli) birçok deterjan monomerleri micelle çekirdek ve sulu solvent bakan bir micelle kabuk katmanda düzenlenmiş hidrofilik baş grupları oluşturan hidrofobik alkil zincirleri ile oluşur. Deterjanlar ve micelle oluşumu davranışını klasik Charles Tanford Hidrofobik etkisi,28 ve boyutları tarafından tarif edilmiştir ve micelles membran protein çalışmalarda yaygın olarak kullanılan deterjanlar gelen şekiller olmuştur küçük açı saçılma kullanarak karakterize. 29 , 30 deterjan örgüt membran proteinlerinin hakkında da eğitim gördü ve protein-deterjan kompleksleri (PDC) oluşumu ile deterjan molekülleri protein düzgün deterjan benzer bir düzenleme çevreleyen bekleniyor micelles. 31
Bir avantaj deterjanlar kullanarak elde edilen micelle özellikleri diğer deterjanlar dahil ederek manipüle eklenir. İdeal karıştırma birçok deterjanlar sergi ve karışık micelles seçme özellikleri bile bileşenleri ve karıştırma oranı tahmin. 22 ancak, deterjan varlığı hala sorunlar biyofiziksel karakterizasyonu için genel sinyal katkıda bulunarak mevcut. Örneğin, x-ışını ve ışık saçılım teknikleri ile deterjan PDC içinde sinyal protein neredeyse ayırt edilemez. 32 tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) ile araştırmalar genellikle kapana kısılmış (donmuş) parçacıkları üzerinde itimat; yapısal protein ayrıntılarını hala bazı deterjanlar veya arka planına ekler deterjan yüksek konsantrasyon tarafından gizlenmiş. 33 (deterjan da dahil olmak üzere) tam PDC yapısını yorumlama doğru alternatif yaklaşımlar deterjan verilen membran protein çevresinde yeniden inşa etmeye hesaplama yöntemleri ile yapılmıştır. 34
Nötron saçılma durum için deterjan micelle içinde çekirdek-kabuk düzenlenmesi için gözlenen saçılma katkıda bir form faktörü üretir. Neyse ki, öyle ki onlar için net gözlenen saçılma katılmazlar çözüm bileşenlerini değiştirilebilir. Bu "eşleşen kontrast" işlem döteryum için arka plan (arabellek) uygun bir saçılma uzunluğu yoğunluğu sağlamak hidrojen yerine kullanarak elde edilir. Deterjan (kullanılabilir deuterated meslektaşları ile) akıllıca bir seçim ve karıştırma onların oranı dikkate alınmalıdır. Deterjan micelles için bu ikame deuterated alkil zinciri (h-kuyruk yerine d-kuyruk) sahip ama aynı kafa grubu ile bir deterjan kullanarak gerçekleştirilir. Deterjanlar iyi karışık olduğundan,35 ağırlıklı köstebek-kesir bir saçılma uzunluğu yoğunluğu onların toplamları verir ortalama iki bileşenleri (h-kuyrukları ve d-kuyrukları). Bu ortalama kontrast baş grup ile tutarlı olduğunda, tek tip toplu yapıları tam olarak gözlenen saçılma tüm katkılar kaldırmak için eşleştirilir.
Burada döteryum etiketli alkil zincirlerle kimyasal olarak özdeş deterjan molekülleri içeren ile deterjan micelles nötron karşıtlığını değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. 19 , 36 , 37 bu micelle çekirdek ve Nötron saçılma benzersiz bir yetenektir kabuk tam eşzamanlı aksine eşleşen izin verir. 35 , 38 önemli ölçüde rafine bu ayrıntı düzeyiyle, kontrast eşleşen etkinleştirebilirsiniz membran protein yapıları Aksi takdirde olanaksız çalışmalar. Ayrıca, bu karşıtlık eşleştirme yaklaşım için diğer sistemleri polimer Satım reaksiyonlar39 ve yağ-su dispersant,40 veya bicelles,41 gibi solubilizing bile diğer ajanlar gibi deterjan içeren uzun olabilir nanodiscs,42 ya da blok kopolimerler. 43 A benzer yaklaşım bu el yazması, ancak kısmi döteryum kısaltmaları alkil zinciri ve/veya kafa grubu ile tek bir deterjan tür istihdam Seviyelendirilmiş olarak son zamanlarda yayınlandı. Bu hidrojen ve döteryum deterjan boyunca rasgele dağıtımını geliştirmek için beklenen süre 37 burada anlatılan yaklaşım ikame ve iki adım için deterjan kullanılabilir pozisyonlar sınırlı sayıda karşılaştırıldığında. deterjan sentez pozlar ek zorluklar dikkate için gerekli.
İlk deneme planlama bir kalite teklif için yapılması gereken bu yana adım 1 ve 2 kez aşağıda ayrıntılı Protokolü'nün üst üste. Ancak, öneri gönderme olarak kabul edilir bu işlemin de nötron deney öncesinde başlayan olduğunu vurgulamak için ilk adım olarak. Ayrıca göre teklif gösterdi, bir önkoşul adım nötron çalışmaları ihtiyacını destekleyen örnek (saflık ve istikrar dahil) fiziksel ve biyokimyasal karakterizasyonu sahip olmaktır dikkat edilmelidir. Küçük açı Nötron saçılma (San) genel bir tartışma Bu makalenin kapsamı dışında olduğunu. Kısa ama kapsamlı giriş Malzeme karakterizasyonu Kaufmann,44 ve saçılma kapsamlı bir ders kitabı üzerinde duruldu biyolojik küçük açı çözüm tarafından son yayınlanan başvuru eser bulunmaktadır kullanılabilir. 45 daha fazla tartışma bölümünde önerilen okuma verilir. Küçük açı saçılma sözde saçılma vektör Q dağıtma işlemini açıklar merkezi miktarı olarak kullanır. Bu makalede yaygın olarak kabul gören tanım Q kullanılmaktadır = 4π sin (θ) / λ, θ gelen ve dağınık kiriş ve λ arasında yarım açı nerede dalga boyu Angström nötron radyasyonu. Diğer tanımları farklı kullanım 's gibi semboller var ' saçılma vektör ve bu faktör 2π veya nanometre Angstrom yerine kullanarak farklı olabilir için (Ayrıca bkz: Şekil 10tartışılması).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="848">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator&#160;</td>
			<td style="width:209px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:108px;">UFC905096</td>
			<td style="width:135px;">labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A663</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>2150</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflo 310 Bioreactor System</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1287-2110</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>423525000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02025</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>3130</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC21413-0050</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper (II) sulfate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC19771-1000&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>756822</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drierite Gas Purifier</td>
			<td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td>
			<td>27068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA, disodium, dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>4010</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emulsiflex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Purifier UPC100</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17116701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>I3325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iron(III) chloride hexahydrate</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>ICN19404590</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Agar Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-134</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC20590-5000</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE6000-7&#160;</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-d25-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:396px;">RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall</td>
			<td>46910</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 25mm syringe filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile disposable bottle top filter with 0.2&#181;m PES membrane</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>596-4520&#160;</td>
			<td>labware</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose-12 10/300 GL column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>17517301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrospec 10 Cell Density Meter</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>80211630</td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate monohydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC38980-2500&#160;</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contrast-matching detergent in small-angle neutron scattering experiments for membrane protein structural analysis and ab initio modeling

Biyolojik küçük açı Nötron saçılma enstrüman High-Flux izotop reaktör, Oak Ridge National Laboratory, biyolojik malzemeler, işleme biyoyakıt ve biyo-ilham malzemeler için nanometre kapsayan soruşturma adanmış mikrometre uzunluğunda ölçekler. Burada fiziksel özelliklerini (Örneğin, boyut ve şekil) membran proteinlerinin soruşturma için sunulan yöntemleri (burada, MmIAP, Methanoculleus marisnigrigelen bir intramembrane aspartyl proteaz) micelle kurma çözümlerinde deterjanlar vardır diğerleri arasında bu küçük açı Nötron saçılma araç için oldukça uygundur. Diğer biyofiziksel karakterizasyonu teknikleri bir protein-deterjan karmaşık yapıda deterjan katkıları gidermek için kendi yetersizlik tarafından engellemiştir. Ayrıca, biyo-Deuteration laboratuvar erişim büyük ölçekli arazisi hazırlama ve protein gelişmiş saçılma sinyal proteinleri döteryum etiketli ifade için benzersiz yetenekleri sağlar. Bu süre tekniği yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi sağlamaz, membran proteinlerinin yapısal bilgi boşluğu yakınındaki atomik çözünürlük gerek kalmadan birçok adresli alanda araştırma içerir. Örneğin, bu alanlarda oligomeric Birleşik, karmaşık oluşumu, konformasyon değişiklikleri belirlenmesi sırasında pertürbasyon ve katlama/unfolding olayları içerir. Bu araştırmalar yoluyla bu yöntemin uygulamaları kolayca gerçekleştirilebilir.

Bir ışın zaman ve enstrüman öneri açıkça böylece önerilen deney geçerli bir değerlendirme yapılan değerlendirme Komitesi için gereken tüm bilgileri iletmek. Bir NSS ile iletişim çok deneyimsiz kullanıcılar için önerilir. NSS ilk fizibilite ve fizibilite, emniyet ve çok etkili bilim potansiyelini vurgulamak için kılavuz öneri gönderme değerlendirebilirsiniz. Teklife bilgiler arka plan bilgileri ve araştırma önemini bağlamının içermelidir; elde edilebilir ...

Watch this Scientific Journal Video about Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling at JoVE.com

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve Ab Initio modelleme

Bu iletişim kuralı, düşük çözünürlüklü ab initio manken ve yapısal bir deterjan çözündürüldükten membran proteini küçük açı Nötron saçılma kontrast-eşleştirme ile deterjan kullanarak çözümde detaylarını elde etmek gösterilmiştir.

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Bu yöntem, integral membran proteinleri ile ilgili anahtar sorulara yardımcı olabilir, örneğin oligomerik durum, boyutları, genel şekli ve çözeltideki düşük çözünürlüklü yapısı gibi. Membran proteinlerinin çözüm çalışmaları deterjan lar gibi moleküllerin dengelenmesini gerektirir. Bu teknik, deterjanları görünmez yapar ve membran proteininden gelen sinyali vurgular avantajına sahiptir.Bu tekniğin etkileri birçok biyolojik ve tıbbi araştırma sorularına kadar uzanır, çünkü proteinlerin 1/3'ünden fazlası birçok hayati hücresel işlevi yerine getirdikleri zarlarda yer alır. Döteryum etiketleme ve nötron saçılma adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, çok az kurum bu teknikler konusunda eğitim sunduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir. Başlamak için, kontrast değişim verilerinin analizi için modüller olan WEB uygulaması MULCh'ü kullanarak nötron saçılma uzunluğu yoğunluklarını veya SLD'leri belirleyin.Sol gezinti bölmesinde bulunan kontrastı tıklatarak kontrast modüllerini açın. Proje başlığı için metin sağlayın ve alt birim bir ve alt birim iki olarak iki bileşen için aşağıdaki ayrıntıları girin. Formül metin kutusuna her bileşen için moleküler formül girin.Daha sonra hacmin altındaki kutudaki her bileşen için birim hacmini kübik angstroms girin. Son olarak, arabellek bileşenleri için ayrıntıları girin. Nötron kontrast hesaplamalarını gerçekleştirmek için gönder'i tıklatın.Arabellekte d2O herhangi bir yüzdesi bu parametreleri belirlemek için formüller yanı sıra dağılım uzunluğu yoğunluğu ve kontrast maç noktaları bir tablo sağlayan bir sonuç sayfası oluşturulur. Bileşen kontrastı eşleşme noktalarına özellikle dikkat ederek saçılma parametrelerini gözden geçirin. LB orta hedef protein dizisi için indüklanabilir bir ifade vektörü barındıran E.coli hücrelerini 600 nanometre veya Yaklaşık bir OD 600 optik yoğunluğa büyütün.E.coli hücrelerini, lb kültürünü üç mililitrelik en az orta da 1'den 20'ye seyrelterek, deuterated proteinin aşırı ekspresyonu için ölçeklendirmeden önce döteryum etiketli ortama uyarla. Yaklaşık bir OD 600 büyüdükten sonra, 50, 75 ve% 100 D2O içeren minimal orta kullanarak 20 seyreltme bir tekrarlayın. Bir kez adapte, bir biyoreaktör deuterated hücre kütlesinin verimini artırmak için kültür büyümeye devam.D2O içeriği arttıkça büyüme oranları azalacaktır. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri hasat, lyse ve arındırmaya devam edin. Sonraki hızlı protein sıvı kromatografi sistemi kullanarak son değişim arabellek iki sütundan daha büyük bir boyut dışlama sütun u dengeleyin.Numuneyi enjekte ettikten sonra, kolonu ilgi proteinine karşılık gelen izole kesirlerde çalıştırın. Küçük açı nötron saçılımı veya SANS arka plan çıkarma için eşleşen arabellek bir aliquot ayırın. SANS verilerini toplamak için önce örnekleri ve tamponları kuvars hücrelerine yükleyin.Kiriş deklanşörünü kapattıktan sonra, numune ortamı alanına yaklaşın ve kuvars hücrelerini numune değiştiriciye yerleştirin. Her örnek hücresi için örnek değiştirici konumunu kaydedin. Alanı kontrol edin ve numune çevre alanından ayrılmadan önce Kiriş yolunun tıkanıklıktan arındığından emin olun.Sonra kiriş deklanşör açın. Otomatik veri toplama için tablo tarar. Nötron saçılma bilim adamı tarafından sağlanan enstrüman operasyonu için talimatları izleyin.SANS verilerinin 2B görüntüden 1B çizime indirgenmesi için Mantid Plot yazılımını ve Python komut dosyasını kullanın. Bunu yapmak için, uzak çözümleme kümesine giriş yapın ve komut satırından Mantid çizimini çalıştırın. Ardından sağlanan kullanıcı azaltma komut dosyasını açın ve ilgili taramaya niçin ilgili tazyik numaralarını veya tanımlamayı uygun listeye arabellek çiftleri halinde yerleştirin.Belirtilen konumda dört sütunlu metin dosyası olarak azaltılmış veri oluşturmak için komut dosyasını çalıştırın. Sağ tıklayın uygun çalışma alanı ve Mantid arsa ve saçılma profilleri ilk inceleme için hataları ile arsa seçin. ATSAS yazılım paketini indirin ve veri çizimi, arabellek ölçekleme ve çıkarma ve Guinier analizi için PRIMUS'u kullanın.ATSAS, SAS veri analizi uygulamasını başlatın ve örnek ve arabellek çiftine karşılık gelen azaltılmış veri dosyalarını yükleyin. Arabelleği düzgün ölçeklendirmek için, her iki profilin de düz olarak benzer olduğu yüksek Q'daki veri aralığını seçin ve işlemler sekmesinin altında bulunan ölçek düğmesini tıklatın. Tüm noktaları görüntülemek için veri aralığını artırın, bu işlemi gerçekleştirmek için çıkarma'yı tıklatın.SAS veri analizi uygulamasının analiz sekmesini kullanarak arabellek çıkarılan örnek verilerin Guinier analizini gerçekleştirin. Listede uygun dosyanın seçildiğinden emin olun ve girdap yarıçapını tıklatın. Otomatik RG düğmesine tıklayarak guinier uyumu gerçekleştirmek için otomatik bir girişim sağlanacaktır.Düşük Q verilerinin tümünün dahil olduğu veri aralığını genişletin ve Q maksimum kez RG sınırı 1,3'ün altına inene kadar yüksek Q puanlarını alarak veri aralığını daraltmaya başlayın. Verilerin sığdırmazlık aralığında doğrusal olduğunu doğrulamak için artıkların çizimini kullanın. Sığdırma bölgesinde küçük ayarlamalar yapın ve bu değerlerin uyumda kullanılan veri aralığına karşı duyarlılığını izleyin.Gnome'daki R'nin olasılık dağılım işlevini elde edin. Şimdi çözümleme sekmesindeki mesafe dağıtım sihirbazını başlatın. Kaliteli bir model elde etmek için verilere iyi bir uyum sağlamak esastır.Moleküliçindeki maksimum atomlararası mesafe olan Dmax'ı belirleyin. Rmax'ı zorlamak için kutunun işaretlerini açarak Dmax için bir değer tahmin edin sıfıra eşittir ve Dmax için büyük bir değer girin. R'nin P'sinin çizimindeki ilk X kesebu bu tahmine neden olabilir.Bu Dmax değeri ne kadar veri sayısı için kullanılan veri aralığı nın yanı sıra verilere ve ortaya çıkan R eğrisine uygun gnome'u optimize etmek için kullanılan veri aralığında artımlı değişiklikler yapın. Primus şekil sihirbazını SAS veri analizi nin analiz sekmesindeki dammif düğmesinden başlatın ve el ile parametre seçimini kullanın. Guinier aralığını sığdır'dan tanımlayın ve navigasyon düğmelerini kullanarak bir sonraki adıma geçin.R çiziminin P'sindeki sığdırma değerlerini tanımlayın ve bir sonraki adıma geçin. ab initio modelleme işlemi için parametreler sağlayın. Ardından commit düğmesini kullanarak işlemi başlatın.ATSAS içinde supcomb kullanarak ilgili bir yüksek çözünürlüklü model ile son sans zarfı yerve üst üste. Yüksek çözünürlüklü PDB modelinin bir kopyasını çalışma dizinindeki SANS zarfına sığacak şekilde yerleştirin. Daha sonra ilk listelenen şablon yapısı ile iki bağımsız değişken olarak PDB dosya adlarını kullanarak komut satırından supcomb yürütmek.Son olarak, 3D moleküler grafik görüntüleme programı PyMOL'u kullanarak ab initio model sonuçlarını görselleştirin. SANS zarfı ve yüksek çözünürlüklü yapı üst üste bindikten sonra, bu modeller herhangi bir moleküler grafik görüntüleme programı kullanılarak görselleştirilebilir. PyMOL görselleştirme sürecine genel bir bakış gösterilmiştir.PYMOL'da PDB yapı dosyaları açıldıktan sonra, modeller PyMOL görüntüleyici penceresinde görünür olmalıdır. Her modelin gösterimleri, her dosya adının yanındaki S düğmesi kullanılarak değiştirilebilir. Burada SANS zarfı için bir yüzey gösterimi ve yüksek çözünürlüklü modelin protein omurgası için bir çizgi film gösterimi kullanılır.C tuşu altında bulunan seçeneklerarasından uygun bir renk düzeni seçilebilir. Protein zincirleri için, bir chainbow boyama yorumlamaya yardımcı olmak için N'den C terminus bir renk gradyan sağlar. Zarf ın içindeki protein yapısının daha iyi görüntülenmesi için yüzey gösterimine saydamlık uygulanır.Yayın görselleri için beyaz bir arka plan önerilir. Bu görselleştirme ipuçları uygulandıktan sonra 3B yapılar tıklayarak ve sürükleyerek incelenebilir. Perspektif ve molekül rotasyonu ve çevirisi manipülasyonları yapılabilir.Bu prosedürü denerken deterjan baş ve kuyruk gruplarının nötron kontrastını D2O H2O çözücü ile doğru bir şekilde eşleştirmeyi unutmamak gerekir. Bu teknik, gelişiminden sonra membran içi asparto proteazların yapısını keşfetmenin yolunu açmıştır. Bu proteinler bağışıklık yanıtı, hepatit C ve Alzheimer hastalığında rol oynarlar.Biyokimyasal laboratuvarlarda ve nötron ışını tesislerinde çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü uygularken kişisel koruyucu ekipman takmak ve tüm tesis güvenlik kurallarına ve radyolojik ilanlara uymak gibi önlemler zorunludur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...