Name: analyzing dynamic protein complexes assembled on and released from biolayer interferometry biosensor using mass spectrometry and electron microscopy
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy at JoVE.c

هذا العمل كان يدعمه ماديسون وليلى الذاتي خريج زمالة (AJM)، 5T32GM008359 المعاهد الوطنية للصحة (PTO)، كومك الطبية الأحيائية بحوث التدريب برنامج (PTO)، R01AI090085 المعاهد الوطنية للصحة (MTF)، و "الأموال سد كو" و (منحة مركز التكنولوجيات التفاعل بيوموليكولي (ترسم) الأشعة المقطعية و MTF). الكتاب يود أن يشكر باربرا فيجليي في "كومك الميكروسكوب الإلكتروني الأساسية" للمساعدة في الحصول على الصور ال.

1-جمعية مجمعات الجزيئات المحددة على السطوح بيوسينسور بيولايير قياس التداخل (BLI)
<ol><li>
جمعية توكسين الأنثراكس بربري المعقدة على سطح بيوسينسور رد الفعل تعديل لوكالة مكافحة المخدرات الفلبينية أمين
	<ol>
<li>هيدرات أمين رد الفعل تلميح biosensor BLI جيل (AR2G) الثاني في 250 ميليلتر من الماء لمدة عشر دقائق.</li>
		<li>برنامج مرات الخطوة، المدرجة في الجدول 1، على برنامج مراقبة وحدة BLI (انظر الجدول للمواد).</li>
		<li>بدء BLI تديرها غمر طرف biosensor في 250 ميليلتر الماء لمدة 30 ثانية لقياس خط أساس أولية وسمك بيوسينسور والكثافة.</li>
		<li>تنشيط في بيوسينسور بتخبط في التلميح إلى 250 ميليلتر دائرة الصحة الوطنية (N-هيدروكسيسوكسينيميدي) 50 و 200 ملم تنمية الصادرات (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) لمدة سبع دقائق.</li>
		<li>تزج biosensor المنشط في 50 ملم وكالة مكافحة المخدرات الفلبينية (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) حله في م 0.1 بورات المخزن المؤقت (pH 8.5) لمدة 5 دقائق لتوليد سطح ثيول المتفاعلة المنشط.</li>
		<li>تزج biosensor ثيول المتفاعلة المنشط في 250 ميليلتر من محلول يحتوي على 100 نانومتر LF E126Cن في الأس الهيدروجيني اسيتات 10 ملم الصوديوم 5.0، 100 ملم كلوريد الصوديوم، المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>تزج نصيحة LFN في 50 مم L-سيستين، 1 "م كلوريد الصوديوم"، خلات الصوديوم 0.1 M، pH 5.0، لمدة 4 دقائق، إخماد أي جماعات ثيول المتفاعلة الحرة رد الفعل المتبقية.</li>
		<li>تزج نصيحة LFن كوينتشيد في 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم لمدة دقيقتين إنشاء خط الأساس في المخزن المؤقت.</li>
		<li>تزج نصيحة LFن قوينتشيد إلى 0.5 ميكرومتر مستضد واقية بريبوري (بريبوريمن السلطة الفلسطينية)، 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم لمدة 5 دقائق لإنشاء المجلةN-PAبريبوري المعقدة.</li>
		<li>ويرتبط مرة السلطة الفلسطينيةبربري ، إزالة التلميح من الحلبربري السلطة الفلسطينية وتزج التلميح إلى 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم لمدة 30 ثانية ليغسل أي السلطة الفلسطينية عدم التحديد منضمبربري.</li>
		<li>تزج LFN-PAبربري المعقدة إلى 0.5 ميكرومتر CMG2 مستقبلات (دون المجال transmembrane)، 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>تزج المجلةN-PAبربري-CMG2 المعقدة في 50 ملم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم لمدة 30 ثانية ليغسل أي CMG2 غير منضم إلى النموذج اندوسومال قبل مجمع.</li>
		<li>لتحليل م، إطلاق سراح LFN-PAبريبوري-CMG2 معقدة من طرف بيوسينسور بتخبط في التلميح إلى 5 ميليلتر من 50 مم DTT، 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، داخل أنبوب PCR.</li>
		<li>لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد جنبا إلى جنب من الببتيدات من المجمع، إطلاق سراح LFN-PAبربري-أنبوب جوكل (الكيراتين خالية)، 25 مم بيكربونات الأمونيوم pH 8.0 داخل بكر CMG2 معقدة من طرف بيوسينسور بتخبط في بيوسينسور إلى 5 ميليلتر 50 مم DTT، م 6 . وهذا يتم في بيوسينسور مختلفة عن تلك المستخدمة لتحليل م.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
جمعية توكسين الأنثراكس المسامية معقدة على سطح بيوسينسور رد الفعل تعديل لوكالة مكافحة المخدرات الفلبينية أمين
	<ol>
<li>لعرض المجمع بعد انتقال درجة الحموضة، نفذ الخطوات 1.1.1-1.1.12 في المقطع السابق لتوليد LFN-PAبريبوري-مجمع CMG2.</li>
		<li>تزج نصيحة بيوسينسور في الرقم الهيدروجيني اسيتات 10 ملم 5.0 لمدة 5 دقائق لبدء المرحلة الانتقالية للسلطة الفلسطينيةبربري لانتقال السلطة الفلسطينيةالمسام . تتم الإشارة إلى هذا الانتقال عن طريق زيادة السعة (حوالي 0.2 nm) أعقبه انخفاض سعة أكبر الذي هو الافتراض بأن الانفصال مستقبلات كبيرة أو كاملة نظراً لتقلص تقارب ملزم.</li>
		<li>تزج نصيحةالمسام LFN-PA 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، pH 8.0، لمدة 30 ثانية يغسل العازلة الحمضية.</li>
		<li>للحصول على نموذج تحليل م، تزج نصيحة بيوسينسور في محلول يحتوي على المذيلات 1.25 مم (2.5 ملم MSP1D1، 25 مم نا-تشولاتي، مم 162.5 بوبك) لمدة 5 دقائق لمنع التراكم في الحل بعد إصدار ثنائي كبريتيد.</li>
		<li>لتحليل م، الإفراج المجلةN-السلطة الفلسطينيةالمسام-مذيل معقدة من طرف بيوسينسور بتخبط في التلميح إلى 5 ميليلتر من 50 مم DTT، 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم داخل أنبوب PCR.</li>
		<li>لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد جنبا إلى جنب من الببتيدات من المجمع، الإفراج عن المجلةنالسلطة الفلسطينية-بور معقدة (لا مذيل) من بيوسينسور نصيحة من أغرق في بيوسينسور إلى 5 ميليلتر 50 مم DTT، 6 م جوكل (الكيراتين خالية)، 25 مم بيكربونات الأمونيوم pH 8.0 داخل بكر أنبوب. وهذا يتم في بيوسينسور مختلفة عن تلك المستخدمة لتحليل م.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-تصور والتحقق من صحة إصدار التجميعات الجزيئات من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية BLI بالميكروسكوب الإلكتروني وصمة سلبية
<ol><li>توهج أداء شبكة Cu 300 المغلفة بالكربون. توهج نموذجية التفريغ الإعدادات هي 0.38 [مبر] جو مستقر الضغط والسلبية مامبس 15، 20 ثانية، ثم التنفيس مع الهواء.</li>
	<li>تأمين الشبكة بين زوج من ملاقط نظيفة.</li>
	<li>"الماصة؛" 4 ميليلتر من عينة معقدة المفرج عنهم في أنبوب بكر على الشبكة وتسمح الامتزاز ل 60s.</li>
	<li>فتيلة بعيداً المتبقية السائل مع آسفين ورق الترشيح.</li>
	<li>وصمة عار الشبكة من بيبيتينج ميليلتر 5 0.75% ميكرون 0.02 تصفيتها اليورانيل فورمات وفتل وصمة عار الزائدة بعيداً بعد 5 ثوان. تسمح الشبكة لتجف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>عرض الشبكات عينة ملطخة باستخدام مجهر إلكترون انتقال.</li>
</ol>3-تحديد كاملة قبل اندوسومال "الجمرة الخبيثة السمية المعقدة" (LFN-Paبربري-CMG2) وانتقلت المعقدة (LFN-Paالمسام دون CMG2) "باستخدام قياس الطيف الكتلي".
<ol><li>تمييع عينات تم إصدارها إلى 20 ميليلتر واحتضان لمدة ساعة واحدة.</li>
	<li>إضافة 2 ميليلتر إيودواسيتاميدي 55 مم، 25 مم بيكربونات الأمونيوم، pH 8.0، واحتضان لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة في الظلام (مغطاة برقائق الألومنيوم).</li>
	<li>تمييع العينة مع 100 ميليلتر من 25 مم بيكربونات الأمونيوم، pH 8.0، لخفض تركيز هيدروكلوريد غوانيدين أدناه م 1.</li>
	<li>إضافة 5 ميليلتر من تسلسل الصف تعديل التربسين في 20 نانوغرام/ميليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>إضافة حمض الخليك الجليدية إلى تركيز 5% للحد من درجة الحموضة إلى نهائي < 3، قم بتقليل الحجم إلى 10 ميليلتر في فراغ المكثف.</li>
	<li>نقل الحل الببتيد إلى لوحة عينة على أوتوسامبلير أوهبلك 1200 مؤتمر العمال النيجيري.</li>
	<li>تحميل 5 ميليلتر محلول الببتيد على عمود مرحلة عكس أوهبلك التي شنت على مرحلة التأين MS.</li>
	<li>أغسل العمود مع 15 ميليلتر من حمض الفورميك 0.1% بمعدل 5 μلتر في الدقيقة كحد أقصى و/أو الضغط الأقصى من 800 رطل/بوصة مربعة.</li>
	<li>الوت الببتيدات من عمود C18 المرحلة عكس معدل تدفق من 350 nL/دقيقة على مدى فترة 90 دقيقة باستخدام تدرج مباشر من 5% إلى 40% مذيب ب في ألف + باء (حمض الفورميك 0.1% ج: المذيبات؛ المذيبات باء: 95% من الاسيتو الانيتريل مع حمض الفورميك 0.1%).</li>
	<li>تحليل الببتيدات التينج على الخط باستخدام MS جنبا إلى جنب.<ol>
<li>تعيين مصدر التأين إلى 2500 فولت وأيون نقل الحرارة إلى 250 درجة مئوية.</li>
		<li>تعمل مطياف كتلة تحت التحكم التلقائي بإجراء فحص مرض التصلب العصبي المتعدد باستمرار واحدة تليها العديد من الترادف MSMS قدر الإمكان في فترة ق 3، استخدام إدارة البحث الجنائي وطاقة اصطدام مسواة من 35.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحديد المكونات الببتيد والبروتين باستخدام الطرق القياسية. وأجريت لهذا العمل، ومجموعتين من تحليل الببتيد والبروتين.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphenation+of+surface+plasmon+resonance+imaging+to+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+by+on-chip+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry+analysis.">Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis.</a> Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).</li><li>Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+patterned+biochips+for+on-chip+immuno-MALDI-TOF+MS:+SPR+imaging+coupled+multi-protein+MS+analysis.">Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis.</a> The Analyst. 137, 386-392 (2012).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).</li><li>Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+kinetics+of+the+pH-driven+transition+of+the+anthrax+toxin+prepore+to+the+pore+by+biolayer+interferometry+and+surface+plasmon+resonance.">Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+anthrax+toxin+pore:+Lethal-factor+complexes+into+lipid+nanodiscs.">Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs.</a> Protein Science. 22, 492-501 (2013).</li><li>Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+periplasmic+production+of+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+Pseudomonas+fluorescens.">Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens.</a> Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).</li><li>Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABRF-MIRG+benchmark+study:+Molecular+interactions+in+a+three-component+system.">ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system.</a> Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).</li><li>Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+biological+characterisation+of+a+sensor+surface+for+bioprocess+monitoring.">Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).</li><li>Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+unfolding+of+anthrax+lethal+factor+by+protective+antigen+oligomers.">Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. , 171-184 (2015).</li><li>Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structurally+altered+and+aggregated+states+of+therapeutically+relevant+proteins+using+GroEL+coupled+to+bio-layer+interferometry.">Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry.</a> Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).</li><li>Bandyopadhyay, A., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminoboronate-based+peptide+cyclization+that+responds+to+pH,+oxidation,+and+small+molecule+modulators.">Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).</li><li>Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+occlusion+of+both+cavities+of+the+eukaryotic+chaperonin+with+antibody+has+no+effect+upon+the+rates+of+beta-actin+or+alpha-tubulin+folding.">Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).</li><li>Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Tomography:+A+Three-Dimensional+Analytic+Tool+for+Hard+and+Soft+Materials+Research.">Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research.</a> Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).</li></ol>

لا توجد عمليات الكشف في هذا الوقت.

يوضح هذا العرض التوضيحي كيف يمكن رصد تشكيل الجزيئات المعقدة بسهولة باستخدام قياس التداخل بيولايير، تصور استخدام EM، والتحقق منها مع مرض التصلب العصبي المتعدد، مع كل من ميكروفولوميس في فترة زمنية قصيرة. هيكلية الجمعية ومجمعات لوحظ متابعة التوقعات ذات الصلة بيولوجيا، كذلك التحقق من صحة هذه المنهجية المشتركة. كما هو مذكور في المقطع النتائج، يتطلب العنصر الرئيسي لنجاح الجمعية الطفرات سيستين هندسيا عقلانية لضمان أن الواجهات المعقدة بالبروتين البروتين تتجه بشكل صحيح بعيداً عن السطح بيوسينسور.
النظم السابقة استخدمت تقنيات BLI ومرض التصلب العصبي المتعدد لتقييم البروتين ملزمة لأنظمة المكونات اثنين وثلاثة وكذلك سلامة ملزم مستقبلات البروتين المعرب عنها، ولكن، في كلتا الحالتين، لم تتطور الأساليب الاستفادة من جنبا إلى جنب م/MS نهج8،9. وكان فقط قياس التداخل بواسطة نظام آخر يجمع بين تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد للمساعدة في وصف التفاعلات التداخلي الاستقطاب المزدوج10. ولسوء الحظ، لم يعد هذا النظام متاح للاستخدام العام. وكما ذكر في المقدمة، كانت هناك عدد من الدراسات التي أنجزت فيها تشكلت على السطوح بيوسينسور موارد البرنامج الخاصة مثل عينات وإزالتها من تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. أيا من تلك الأمثلة أدت إلى المجمعات تصور استخدام EM.
القيود المفروضة على هذا الأسلوب متتابعة يمكن أن تكون عديدة ولكن قابلة للحل. للتثبيت الأولى وذلك خطوة مؤسسة للجمعية، سيعوق الافتقار إلى المعرفة بأسطح التفاعل الهيكلية التأكيد التقدم المرتبطة برصد المراحل الأولى من الجمعية العامة. الافتقار إلى هيكل المعلومات يمكن معالجتها من خلال تصميم تصميم بناء مؤسسة حيث كيمياء مرفق (مثل سلفهيدريل moiety للروابط ثنائي كبريتيد/صاحب معلم الموضع) يمكن نقلها إلى مناطق مختلفة داخل نواة نظام الجمعية. في حالة توكسين الأنثراكس المعقدة، كان محظوظاً بأن هيكل LFن ملزمة للسلطة الفلسطينيةبريبوري هو متاح11. وكان المترجمة الرشيد موضع سيستين هندسيا إلى المناطق البعيدة عن وجه السلطة الفلسطينية ملزمةبربري . مع كيمياء سيستين الربط، فمن الأفضل أن لا سيستينيس رد الفعل أخرى موجودة على سطح البروتين.
وهناك كيمياء مرفق المختلفة التي يمكن استخدامها لمهندس موقع مرفق محدد على الأسطح للبروتين. أحد المرفقات المحددة الأكثر شعبية ينطوي على تحديد المواقع مجموعة بيوتين في مكان محدد على سطح البروتين12. ولسوء الحظ، ملزمة البيوتين إلى ستريبتافيدين أو عبدين مغلفة الأسطح ضيق للغاية. انعكاس للتفاعل الملزمة ليست بسيطة. استخدام هندسيا له-علامة في المحطة N أو ج وسهولة اللاحقة من المرفق إلى الأسطح ني-الإدارة الوطنية للسياحة تطبيق عالمي أكثر من تجميد التقارب. وبطبيعة الحال، واحدة من المحاذير للجمعية مرفق المواقع الهندسية مع نظم صاحب معلم هو اشتراط أن ن-وج-تيرميني للبروتين الجمعية الأساسية تظل مكشوف وفصل حيث أن المرفق سهل. مع جميع عمليات الجمعية، واجهة التفاعل من البروتين الجمعية الأساسية يجب أن تظل متاحة كما تقدم الجمعية المعقدة.
ربما القلق الأكثر شيوعاً لاستخدام كيمياء السطح biosensor ملزمة غير محددة. نصائح ستريبتافيدين غالباً ما تكون مصدرا لآثار كبيرة غير محددة ملزمة. ثنائي كبريتيد المرتبطة البيوتين يمكن استخدامها للإفراج عن مجمعات محددة جداً تاركين وراءهم الربط S-البيوتين تخفيض أحكام ملزمة ل أجهزة استشعار العوامل البيولوجية streptavidin المعطل تداولها13. وهناك أخرى كيمياء عكسها تصبح متاحة مثل إيمينوبوروناتيس، وإلى حد أقل كيتواميدي14. هذا الحقل حاليا المتخلفة، ولكن هناك ارتفاع الفوائد في مواصلة تطوير البروتوكولات التساهمية عكسها لتجنب آثار سمية المخدرات خارج الهدف التي تصاحب عادة استخدام المخدرات تستهدف التساهمية التنمية.
حد من استخدام EM لتصور المجمعات هو التفسير، لا سيما في الحالات حيث هياكل المجمعات المجتمعين ليست معروفة في البداية. يمكن تحديد الموقع المكاني للمكونات داخل مجمع الجزيئات مجمعة غير معرف باستخدام الأجسام المضادة (ماب) كعلامات حركية وهيكلية محددة. على سبيل المثال، حالما يتم تشكيل مجموعة معقدة، الأجسام المضادة يمكن إضافة أن ربط مكونات محددة. كثيرا ما يستخدم هذا الأسلوب في م لتحديد مكونات محددة داخل التجمعات الكبيرة15. قيد آخر مرتبط بحجم المجمع، رغم أنه كانت هناك حالات حيث حل الجمعيات متماثل تعريف صغيرة كما كاتشين 70 (جروس هيبتامير) يتم بسهولة باستخدام سلبية وصمة عار م. عادة ما تكون مجمعات المجمعة التي يتم تحليلها بواسطة EM في نطاق الحجم ~ 100 Å في القطر أو أعلاه. مؤخرا ولكن البروتينات صغيرة كاتشين 20 قد تم حلها وتم الحصول على هياكل منخفضة الدقة عند استخدام متفوقة تلطيخ منهجيات16.
لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد، ويمكن زيادة حساسية الأجهزة MS الحالية وصولاً إلى مستوى فيمتومولار (أتوموليس) في بعض الحالات زيادة حساسية الكشف BLI. وتصور الغاية أن إشارات البروتين التي تظهر ارتفاع الحد الأدنى ولكن قابل للتكرار في الاتساع سيؤدي إلى تحديد البروتين في السؤال. وباﻹضافة إلى ذلك، سبر تفاعلات البروتين البروتين مع أحد الشركاء يعلق بيوسينسور والآخر في بيئة خلوية سيؤدي إلى سارية المفعول في تنقية والكشف بعد الأسهل مجمع المنشأة حديثا. حد واحد التي قد تلاحظ مع النظم الراهنة لمرض التصلب العصبي المتعدد حساسة للغاية هي أن بروتين الفائدة قد لا تكون في قاعدة البيانات، ولكن هذه الملاحظة نادرة (مثلاً، بروتيوميس من الأنواع النادرة). وإذا كانت معروفة في تسلسل البروتينات ذات الاهتمام، هو حل هذه المشكلة بسهولة بما في ذلك تسلسل الأحماض الأمينية protein(s) في قاعدة بيانات بروتين خلفية (كما هو موضح في هذا العمل في قسم البروتوكول). قيد محتمل آخر النتائج المنهجية من المقاومة للبروتين تريبسينوليسيس. التربسين الهضم هو عادة الأسلوب الافتراضي لتحديد البروتين من الأسفل. بيد أن البروتينات قد تكون مقاومة التربسين إذا أنها تفتقر إلى الأرجنتين و Lys مخلفات أو يتم تقييد الوصول إلى هذه المخلفات بهيكل مطوية. يتم حل هذه القيود، على التوالي، باستخدام مزيج من البروتياز أو بديل أو بما في ذلك كاشف تتكشف (اليوريا أو غوانيدين HCl، كما هو مبين في 1.1.14 و 1.2.6) قبل الهضم الأنزيمي.
وتشمل التوسعات الممكنة لهذه المنهجية مما يسمح للمستخدم بتتبع وتحديد المجمعات الجمعية الخلوية من النفط الخام ليساتيس الخلوية. وتبين التجارب لمكونات الجمعية تتركز مقتطفات الخلوية من السهل القيام باستخدام إجراءات قياس التداخل بيولايير. خلافا موائع جزيئية أكثر استخداماً على أساس المنهجيات التي عرضه لانسداد وحساسية للتجميع، يمكن استخدام نهج BLI تزج بيولايير استشعار نصائح مباشرة في مقتطفات النفط الخام احتمال تجميع مجمعات محددة مباشرة من هذه العينات النجسة مركزة. بمجرد تجميعها، من الممكن تماما لاستخدام المسابير جسم معين كمتابعة النظام BLI لمواصلة تحديد وحتى قوانتيتاتي يشتبه في أنهم عناصر في مقتطفات الخلوية التي تم تحديدها باستخدام أسلوب ميكروفولومي مرض التصلب العصبي المتعدد. مرة أخرى، أن المفتاح هنا استخدام البروتينات أساسية محددة وموجهة بشكل صحيح كما يسبر تقارب محددة.
القدرة على عرض بربري المسام عملية الانتقال مع BLI كينيتيكالي سوف تكون مفيدة للغاية في تحديد "المضادة السم" المحتملة جزيء صغير مثبطات البروتين التحولات التي تعمل على وجه التحديد ضمن أواخر اندوسومال، انخفاض الأس الهيدروجيني (5.0) شروط. هذا بربري درجة الحموضة التي يسببها للمسام الانتقال تحول دون حضور قابلة للطي مثبت (أوسموليتيس) مثل الجلسرين أو السكروز، ومما يضفي الدعم القوى لتطوير مثبتات قابلة للطي مستهدفة محددة تمنع السلطة الفلسطينية تشكيلالمسام . يتجنب هذا النهج المحدد ويستبدل فحوصات النفط الخام على أساس التجميع حيث تنخفض درجة الحموضة تؤدي إلى ترسيب البروتين. هذا الأسلوب الأخير، على الرغم من أن جيدة لأساليب الغربلة الأولية، غالباً ما يؤدي إلى نتائج إيجابية زائفة فيها مركبات محددة تمنع التجميع بدلاً من الانتقالات الجزيئية الفعلية.
الملاحظات النهائية لهيكل وتحديد المكونات الفردية المجمعة داخل عينات صغيرة ميكروفولومي أيضا يمكن أن تكون مفيدة في التحقق من مركبات الرصاص المحتملة. وهذا يمكن تطبيقها في الحالات التي يكون فيها استقرار الجمعية محددة أو زعزعة استقرار النتائج المستهدفة. هذا النهج الموازي الحركية/هيكل/تحديد مفيد لتأكيد صحة المستجيبة مركب الرصاص المشتبه فيها للجمعية مباشرة بمثابة خطوة معقولة الفرز الثانوي أو نهج الإنتاجية المتوسطة.
Cryo-م تقنية مفيدة لدراسة تفاصيل الذري مجمعات جزيء ضخم في الدول المختلفة للجمعية. قبل إعداد عينات م البرد، من المهم أولاً التحقق من إعداد يحتوي على مجمعات متجانسة نقية معقول مع وصمة سلبية م. الأعمال المعروضة هنا يوضح الجمعية من البروتين المجمعات على الأسطح biosensor BLI، الإفراج عن هذه المجمعات للتصور م، وتحديد هذه المكونات باستخدام MS. هذه منهجية خاصة للجمعية العامة التي تسيطر عليها، وإطلاق سراح يمكن أن يكون مفيداً في توليد البروتوكولات المحددة جداً التي تعزز إعداد عينة متسلسلة متجانسة لوصمة سلبية م، خطوة ضرورية ويجب أن تظهر قبل المضي قدما إلى م البرد. للحصول على بنية ثلاثية الأبعاد ذات الدقة المنخفضة، يلزم فقط 30-50 جزيئات معقدة لتنفيذ سلسلة إمالة مخروطية (70 صورة 2D مختلف وجهات النظر كل الجسيمات) شريطة أن يكون هناك اتجاه التنوع (وجهات نظر مختلفة متعددة).
فيما يتعلق بتعزيز أساليب مرض التصلب العصبي المتعدد، تواصل التقدم في الحساسية، وتخفيض حجم العينة تحسين. تدفقات نانو والضغط الفائقة اللوني السائل جنبا إلى جنب مع تنمية مطيافات الشامل مع واجب سريع دورة، وزيادة الحساسية وحل السلطة. الأخيرة مقدمة من مطياف كتلة أوربيتراب، لا سيما الإصدار الأحدث (أوربيتراب "لموس الانصهار"، وخلفه المتوقع "لموس الانصهار أوربيتراب" م 1) فضلا عن خوارزميات البحث إلى حد كبير تسهيل هذه العملية.
وترصد الجمعية الحركية والتفكيك من المكونات السمية الجمرة الخبيثة باستخدام منهجيات BLI خالية من التسمية المنهجية الحالية وتقييم الهيكل والهوية لهذه المكونات باستخدام EM ومرض التصلب العصبي المتعدد، على التوالي. استخدام قناة واحدة بسيطة نظام BLI مقترنة بالروتين السلبي تلطيخ تحليل م والابتدائية مرض التصلب العصبي المتعدد التقنيات أكثر من كافية لوصف عملية الجمعية العامة.

تحديد وفهم خصوصية الإدارة البروتين الجمعية المعقدة في فيفو الاهتمام الشديد للباحثين البيوكيميائية. التجميعات البروتين غير متجانسة كبيرة هي القاعدة وليس الاستثناء. هذا المفهوم معتمد بواسطة الرصد الطيفي للجمعية في فيفو ، عزل مجمعات استخدام تقنيات تعطيل الخلية الطف وتقييم المنتجات من أساليب تنقية المستندة إلى تقارب، وتصور لهم استخدام دقة عالية المجهر الإلكتروني المبردة (cryo-م). فهم التحكم في خصوصية الجمعية داخل الخلية، يجب أن الباحثين بشكل روتيني عزل وتحديد وتميز هذه الهياكل من تجميع أو تفكيك دينامية في نهاية المطاف. الأداة الجزيئية الأكثر استخداماً لتحديد العناصر المكونة لهذه الجمعيات وكثيراً ما يتطلب المستندة إلى جسم إيمونوبريسيبيتيشن، الذي يعتمد على الحفاظ على استقرار معقدة أثناء تعطيل الخلية. ووضعت مختلف التقنيات التحليلية إلى جانب مؤخرا لالتقاط المجمعات من عينات الخلايا باستخدام موائع جزيئية على أساس النهج، مثل الرنين السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة). بعد إزالة من الأسطح موارد البرنامج الخاصة، تم تحليل هذه العينات بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين وقت الرحلة (استخدام-TOF)1،2. النهوض بهذه المنهجية باستخدام بروتوكولات أسهل سيتيح الباحثين إلى تصور والتحقق من مجمعات المتوقعة التي تحدث في الوسط الخلوي. نظراً لموارد البرنامج الخاصة نظام قائم على ميكروفلويديكس، وكثيراً ما تنشأ المشاكل عن تشكيل التجميعية. التحايل على هذه المشكلة يتطلب تخفيف العينة، التي يمكن أن تقلل بدورها سلامة مجمعات التركيز البيولوجي مسؤولاً.
النهوض حديثة نسبيا في تكنولوجيات خالية من التسمية هو تطوير نظام قياس التداخل (BLI) بيولايير3. هذه خاصة الانعكاس الضوء على محاكاة النظم نسخ متماثل، أو أفضل، وربط موارد البرنامج الخاصة ونتائج الحركية في جزء صغير من3،تكلفة4 خاصة إذا استخدمت وحدات قناة واحدة. BLI يقيس التغيرات في أنماط التدخل الضوء المنعكس بين طبقة مرجع (المراقبة) والسطح بيولايير (تجريبية). يتم قياس التغير الناتج في المرحلة في الوقت الحقيقي ك قراءات الحركية والكمية5. السطح بيوسينسور، الذي يحتوي على التثبيت محددة كيمياء، منقولا ماديا بين الحلول، بدلاً من المخزن المؤقت تغييرات النهج موائع جزيئية في موارد البرنامج الخاصة، للقياس عن طريق الطول الموجي أو المرحلة. آثار نقل أسلحة ممنوعة بالتحريض الحل. وخلافا لموارد البرنامج الخاصة، هذه النظم مفيدة للغاية في تقييم المجمعات من العينات البيولوجية الخام. المعلمة الفعلي يقاس أثناء تجارب BLI أساسا يعتمد على إجراء تغيير في كتلة أو سمك على السطح بيوسينسور الذي ينتج من البروتين مجمع التجميع أو التفكيك.
هذه الألياف البصرية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية سهلة الاستخدام وغير مكلفة نسبيا. أحد جوانب مفيدة الناشئة من BLI هو إزالة السطحية من مجمعات البروتين المجمعة حديثا من على سطح الأرض. تطبيق هذا الأسلوب يسمح مختبرنا الأخيرة التقيد الوقت الحقيقي حركية كبيرة مقياس الأس الهيدروجيني الناجم عن إعادة ترتيب هيكل البروتين المكون مستضد واقية (السلطة الفلسطينية) والتكسينية الجمرة الخبيثة كما بربري (السلطة الفلسطينيةبربري) انتقلت إلى ما نموذج المسامية (السلطة الفلسطينيةالمسام). تم التحقق من هذا التحول على الحافة بيوسينسور باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني (م)6. ويتجنب إزالة المجمعات من السطوح بيوسينسور أكبر حجم تخفيف آثار كثيرا ما تصادف عند الإفراج عن مجمعات من سطوح شرائح عند استخدام النظم ميكروفلويديكس.
في العمل الحالي، الجمرة الخبيثة السمية مجمعات تجميعها وتفكيكها على سطح بيوسينسور وثم أفرج عنه في مجلدات ميكروليتير. يتم التحقق من صحة المكونات المعقدة الناتجة عن استخدام أورثوجونالي م والطيف الكتلي (مللي ثانية).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>BR100058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL black microtubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688304-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 50 &#956;m x 150mm, C18, 2 &#956;m, 100 &#197;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>164561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38SL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips</td>
			<td>Forte Bio</td>
			<td>18-5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter, 0.02um</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>6809-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz System</td>
			<td>Pall Forte Bio</td>
			<td>45-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Morphogenic Gene-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon coated Cu 300 grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-CU-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acids</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>0129-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GuHCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>MP-BioMedicals,LLC</td>
			<td>100-351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cystiene hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethal Factor N-terminal domain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS software version 2.2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>090M14531V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easiGlow glow discharge cleaning system</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>91000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective Antigen prepore</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-795C 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequest HT search engine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP334-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl formate (UF)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30487</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing dynamic protein complexes assembled on and released from biolayer interferometry biosensor using mass spectrometry and electron microscopy

البروتينات المجراة، غالباً ما تكون جزءا من المجمعات الجزيئات الكبيرة حيث خصوصية ملزم وديناميات تفرض في نهاية المطاف النواتج الفنية. في هذا العمل، هو توكسين الأنثراكس اندوسومال قبل تجميعها وانتقلت إلى اندوسومال المعقدة. أولاً، المجال الطرفي ن معامل الفتاكة متحولة سيستين (LFN) مرفق بيوسينسور قياس التداخل (BLI) بيولايير عن طريق ثنائي كبريتيد اقتران في توجه أمثل، مما يتيح بربري مستضد واقية (السلطة الفلسطينية) لربط (كد 1 نانومتر). ثم يربط التوجه على النحو الأمثل LFN-PAبريبوري المعقدة القابلة للذوبان الشعرية morphogenic جين-2 (CMG2) الخلية السطحية مستقبلات (170 كد م)، مما أسفر عن مجمع اندوسومال قبل الجمرة الخبيثة ممثل، مستقر في درجة الحموضة 7.5. هذا المجمع تجميعها ثم يتعرض لممثل الحموضة (pH 5.0) البيئة دخلول الراحل إلى انتقال السلطة الفلسطينيةبربري إلى الدولة مسام الغشاء إدراجها. وينتج هذه الدولةالمسام السلطة الفلسطينية ضعف ربط بين مستقبلات CMG2 و LFN-السلطة الفلسطينية فيالمسام وتفكك كبير من CMG2 من المسام الانتقال. يتم عكس الايثير-إلحاق LFن على سطح بيوسينسور بسهولة من ديثيوثريتول. الحد على سطح biosensor BLI النشرات LFN-PAبربري-مجمع الثلاثي CMG2 أو الحمض انتقلت مجمعاتالمسام LFN-السلطة الفلسطينية إلى وحدات تخزين ميكروليتير. ثم تصور مجمعات المفرج عنهم والتعرف باستخدام المجهر الإلكتروني والطيف الكتلي. هذه التجارب لشرح كيفية رصد حركية التجميع/التفكيك مجمعات البروتين محددة باستخدام منهجيات BLI خالية من التسمية وتقييم الهيكل وتجميعها هوية BLI هذه المجمعات بالميكروسكوب الإلكتروني والإعلام قياس الطيف الكتلي، على التوالي، باستخدام إجراءات سهلة لتكرار متسلسلة.

القدرة على رصد والتحقق من الجمعية العامة للمجمعات الجزيئات الكبيرة خطوة حاسمة نحو فهم خصوصية ووظائف التجمعات الجزيئية البيولوجية الكبيرة. تدل نتائج الأساليب المقدمة في هذه الوثيقة السهولة مع مجمعات البروتين الكبيرة التي (> 150 كاتشين الشامل) يمكن تجميعها باستخدام قياس التداخل بيولايير، حين رصد حركية والسعة للجمعية جميع. طبيعة الاتفاق فريدة من نوعها على سطح biosensor يتيح تحليل الجمعية تمدد بالإفراج عن مجمعات المجتمعون في ميكروفولوميس الصغيرة. يمكن استخدام هذه ميكروفولوميس لتصور الهيكل المادي الأولى من المجمعات استخدام EM والتحقق من هوية عناصر معقدة باستخدام MS. ويرد في الشكل 1نظرة تخطيطي لهذه العملية برمتها.
عنصر أساسي لنجاح الجمعية والتحقق من الجزيئات المعقدة على سطح بيوسينسور ينطوي على التوجه السليم للبروتين البذور الأولى. وهذا يضمن أن مواقع التفاعل البروتين-بروتين موجوداً ولا ستيريكالي المحظورة والمتمركزة على النحو الأمثل بعيداً عن السطح بيوسينسور. كما هو مبين في الشكل 2، يتحقق التوجه السليم من توكسين الأنثراكس معقدة باستخدام جزء الطرفي ن على وجه التحديد هندسيا عامل المميتة (LFN) حيث يتم دائماً وضع الموقع ملزمبربري LFN-السلطة الفلسطينية عكس بيوسينسور التساهمية مرفق الموقع6،7. في نهاية المطاف يخلق تراكم اللاحقة للمجمع وملزمة للسلطة الفلسطينية إلى biosensor BLIن LF متبوعاً القابلة للذوبان CMG2 ملزم للسلطة الفلسطينية من توكسين الأنثراكس مختصة إزفاء المعقدة.
التتبع سينسوجرام BLI قراءة في الوقت الحقيقي من التغييرات السعة بسبب إضافة محددة من المكونات السمية الجمرة الخبيثة كما أنها تضاف إلى بيوسينسور. يظهر الشكل 3 تتبع ممثل إقران مع توقع نموذجا للمجمع إلى النموذج في هذه الخطوة في العملية. هو أول ارتفاع LFن التحميل على التلميح. بعد تبريد وخط الأساس، السلطة الفلسطينيةبربري ثم يربط LFN متبوعاً بإضافة مستقبلات CMG2 القابلة للذوبان الناتجة في مجمع اندوسومال قبل تجميعها LFN-PAبربري-CMG2. أن التقدم نحو البيئة دخلول الراحل، تعرض المجمع بأكمله لنبض انخفاض درجة حموضة (pH 5.0) أن يضعف مستقبلات ملزم، بما يسمح بريبوري للانتقال إلى ما تكيف مسام الغشاء الموسعة إدراج. 6 تظهر آثار سينسوجرام لهذه الخطوة التحمض في الشكل 4. الزيادة الأولية أو 'سبايك' في السعة من المحتمل تمديد المسام6 التي يجب أن تحدث قبل الانخفاض في ربط مستقبلات CMG2. انخفاض السعة الأكبر الأكثر احتمالاً تفارق مستقبلات كبيرة أو كاملة بسبب تقارب ملزم تقلص. العمل السابقة في هذا المختبر أشارت إلى CMG2 ملزم للسلطة الفلسطينية تماما تمديدالمسام لا يكاد يذكر مقارنة ب تفاعلبريبوري CMG2-PA6. وباﻹضافة إلى ذلك، لاحظ تتبع الحركية سينسوجرام، في سينسوجرامس كل من LFN-PAبربري-التحولات CMG2 للمجلةN-PAالمسام مع انخفاض درجة حموضة، استنساخه على تشغيل متعددة.
قبل وبعد التحميض، تصدر مجمعات بيوسينسور تعلق بسهولة للتصور بوصمة سلبية م وتحديد الهوية بواسطة MS (الشكل 5). وترد في الشكل 6مجمعات تمثيلية من نتائج م. إظهار شبكات العينة قبل اندوسومال، كثافة متسقة مع سليمة مجمعات ثلاثية تتكون من LFN-PAبربري-CMG2. بعد التحميض الشبكات المعقدة، وتظهر السلطة الفلسطينية انتقلت إلى المسام وسولوبيليزيد بإدراج مذيل بكثافة CMG2 واضحة لا.
تم التحقق من هويات ما قبل والمجمعات بعد التحميض بمرض التصلب العصبي المتعدد. قاعدة بيانات حيث تسلسل السلطة الفلسطينية، P13423؛ LFن، P15917؛ وأدرجت في خلفية من قاعدة بيانات الماوس البروتينات المشتقة من مستودع نكبينر CMG2، P58335. تم الحصول على البروتينات فقط لمصلحة من هذا البحث قاعدة البيانات الأولى، مع تغطية الأحماض الأمينية التالية للمجمعات ثلاثي وثنائي: 54% و 22% للسلطة الفلسطينية، 36% ونسبة 6 في المائة للقوات البرية و 43 في المائة ل CMG2، على التوالي (CMG2 لم يتم الكشف عنه في المجمع ثنائي). بغية تحقيق أقصى قدر من التغطية من الأحماض الأمينية البروتين، أجرى تعريف بروتين ببتيد/ثانية باستخدام قاعدة بيانات بروتين تحتوي على البروتينات ثلاثة فقط من الفائدة. عينات قبل اندوسومال مرض التصلب العصبي المتعدد الواردة الببتيدات من كافة المكونات السمية الثلاثة مع 60.46% و 67.97% و 54.15% تغطية LFN، والسلطة الفلسطينية، و CMG2، على التوالي (الشكل 7). نتائج اندوسومال بوست، هو مبين في الشكل 8، لا يتضمن إلا الببتيدات من LFن والسلطة الفلسطينية (التغطية 57.41% و 67.79%، على التوالي). عدم وجود CMG2 في عينات اندوسومال وظيفة تتماشى مع النقصان نانومتر BLI لوحظ أثناء تشكيل المسام.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig1.jpg"> رقم 1- تجميعها في نظرة عامة التخطيطي لتحليل البروتين المجمعات ومعزولة عن biosensor BLI استخدام EM والسيدة <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig2.jpg"> الشكل 2- تفعيل بيوسينسور: الخطوة الأولى في اتجاه الجمعية المحددة في BLI biosensor. ويرتبط المجال عامل الفتاكة E126C ن--المحطة الطرفية، (LFN) من خلال ارتباط الايثير إنشاء السلطة الفلسطينية ملزمةبربري واجهة الموجه بشكل صحيح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig3.jpg"> الشكل 3- رصد الجمرة الخبيثة السمية الجمعية والتفكيك مع BLI: سينسوجرام يبين التغييرات السعة كدالة للوقت بسبب إضافة محدد من الجمرة الخبيثة المكونات السمية كما يتم إضافتها إلى بيوسينسور بدءاً من تحميل المجلةN (الخطوة 4 في الجدول 1). ثم يتم تحميل السلطة الفلسطينيةبربري على السطح تليها إضافة مستقبلات CMG2 القابلة للذوبان. ويتكون المجمع اندوسومال قبل تجميعها من LF-PAبريبوري-CMG2. إلى التقدم نحو البيئة دخلول الراحل، تجميع الكامل الوظيفية الجمرة الخبيثة السمية، يخضع لدرجة حموضة منخفضة نبض (pH 5.0) أن يضعف مستقبلات ملزم، مما يسمح بربري للانتقال إلى ما تكيف مسام الغشاء الموسعة إدراج. وأكد تعرض الأغشية التي تغطي المسام و solubilized بإضافة المذيلات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig4.jpg"> الشكل 4- سينسوجرام BLI CMG2 الإصدار: تظهر آثار هذه الخطوة التحمض زيادة أولية أو 'سبايك' في السعة أعقبه انخفاض سعة كبيرة التي من المرجح المسام تشكيل ومستقبلات الانفصال، على التوالي. عمودي منقط الخطوط الحمراء تدل على بداية خطوة جديدة. يتم محاذاة سينسوجرامس الغامق خط أحمر منقط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig5.jpg"> الشكل 5- تحليل البروتين المجمعات تجميعها على ومعزولة عن biosensor BLI استخدام EM ومرض التصلب العصبي المتعدد: Biosensor مجمعات المرفقة يتم إصدارها بسهولة إلى 5 ميليلتر من المخزن المؤقت الذي يحتوي على القيمة لتحديد الهوية بواسطة السيدة <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig5large.jpg" target="_blank">والتصور بوصمة سلبية م الرجاء النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig6.jpg"> الشكل 6- التصور من البروتين المجمعات مع م: شبكات العينة قبل اندوسومال، إظهار كثافة متسقة مع سليمة مجمعات ثلاثية تتكون من LFN-PAبربري-CMG2. اندوسومال وظيفة الشبكات المعقدة، وتظهر السلطة الفلسطينية انتقلت إلى المسام و solubilized من مذيل بكثافة CMG2 واضحة لا. نماذج مجمعات المتوقعة (الجانب الأيسر) على نفس النطاق كالجسيمات الفردية هو مبين. جسيمات ملونة مع توقع البروتين (استناداً إلى حجم الكثافة م) ترد أدناه كل الجسيمات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig7.jpg"> الرقم 7- التحقق من البروتين المجمعات مع مرض التصلب العصبي المتعدد: الوارد عينات قبل اندوسومال مرض التصلب العصبي المتعدد الببتيدات من كافة المكونات السمية الثلاثة مع 60.46% و 67.97% و 54.15% تغطية LFN، والسلطة الفلسطينية، و CMG2، على التوالي. الببتيدات الكشف عن معدل اكتشاف كاذبة (FDR) مساوية أو أعلى من 5% تظهر باللون الأصفر، فرانكلين روزفلت مساوية أو أكبر من 1% تظهر باللون الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig8.jpg"> الشكل 8- التحقق من البروتين المجمعات مع مرض التصلب العصبي المتعدد: اندوسومال بوست الببتيدات العينات الواردة من LFن والسلطة الفلسطينية (التغطية 57.41% و 67.79%، على التوالي)، لكن لا CMG2. فرانكلين روزفلت مساوية أو أعلى من 5% تظهر باللون الأصفر، فرانكلين روزفلت مساوية أو أكبر من 1% تظهر باللون الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الخطوة</td>
			<td>الوقت (s)</td>
			<td>الوصف</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>الأساس الأولى</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>420</td>
			<td>التنشيط</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>التنشيط</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>300</td>
			<td>LFن تحميل</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>240</td>
			<td>الطفايات سيستين</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>120</td>
			<td>خط الأساس</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>رابطةبريبوري السلطة الفلسطينية</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>30</td>
			<td>خط الأساس</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>300</td>
			<td>رابطة CMG2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>30</td>
			<td>خط الأساس</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>300</td>
			<td>انتقال حمض</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>30</td>
			<td>خط الأساس</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>300</td>
			<td>رابطة مذيل</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1- أوقات خطوة واحدة تشغيل BLI للجمعية توكسين الأنثراكس المعقدة. لاحظ أنه يتم استخدام خطوط الأساس يغسل البروتين غير منضم من الخطوة السابقة و/أو وضع خط أساس جديد في المخزن مؤقت.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy at JoVE.c

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

نقدم هنا بروتوكولا لرصد الجمعية والتفكيك من توكسين الأنثراكس باستخدام قياس التداخل بيولايير (BLI). بعد التجميع/التفكيك على سطح بيوسينسور، تصدر مجمعات البروتين الكبيرة من على سطح الأرض للتصور وتحديد مكونات المجمعات باستخدام المجهر الإلكتروني والطيف الكتلي، على التوالي.

تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...