Name: analyzing dynamic protein complexes assembled on and released from biolayer interferometry biosensor using mass spectrometry and electron microscopy
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy at JoVE.c

यह काम मैडिसन और लीला सेल्फ ग्रेजुएट फेलोशिप (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC बायोमेडिकल रिसर्च ट्रेनिंग प्रोग्राम (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), केयू ब्रिजिंग फंड और जैव अणु इंटरेक्शन टेक्नोलॉजीज सेंटर (BITC) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ( सीटी और MTF) । लेखक के लिए KUMC इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोर पर बारबरा Fegley उनि छवि अधिग्रहण के साथ सहायता के लिए धंयवाद देना चाहूंगा ।

1. Interferometry पर परिभाषित Macromolecular परिसरों की एसेंबली (BLI)
<ol><li>
एक PDEA-संशोधित अमीन प्रतिक्रियाशील पर एक बार फिर से सक्रिय करना एंथ्रेक्स विष परिसर के विधानसभा
	<ol>
<li>हाइड्रेट एक अमीन प्रतिक्रियाशील दूसरी पीढ़ी (AR2G) BLI २५० µ एल में दस मिनट के लिए पानी की l संवेदक टिप ।</li>
		<li>कार्यक्रम कदम बार, 1 तालिकामें सूचीबद्ध, BLI इकाई को नियंत्रित करने के सॉफ्टवेयर पर ( सामग्री की तालिकादेखें) ।</li>
		<li>30 एस के लिए २५० µ l पानी में BLI सेंसर टिप विसर्जित करके भागो शुरू करने के लिए एक प्रारंभिक आधार रेखा की मोटाई और घनत्व की माप ।</li>
		<li>7 मिनट के लिए २५० µ एल ५० mm एन एच एस (एन-hydroxysuccinimide) और २०० mm EDC (1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)) में टिप विसर्जित करके इस विसेंसर को सक्रिय करें ।</li>
		<li>५० mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio) ethanamine) ०.१ मीटर बोराटे बफर (पीएच ८.५) में भंग 5 मिनट के लिए एक सक्रिय thiol-प्रतिक्रियाशील सतह उत्पंन करने में विसर्जित कर दिया ।</li>
		<li>सक्रिय thiol-प्रतिक्रियाशील २५० µ l में १०० एनएम E126C वामोएन 10 मिमी सोडियम एसीटेट पीएच ५.०, १०० मिमी NaCl, 5 मिनट के लिए बफर युक्त समाधान के एल में विसर्जित कर दिया ।</li>
		<li>५० मिमी एल में वामोएन टिप विसर्जित-cysteine, 1 एम NaCl, ०.१ एम सोडियम एसीटेट, पीएच ५.०, 4 मिनट के लिए, किसी भी शेष प्रतिक्रियाशील मुक्त thiol-प्रतिक्रियाशील समूहों बुझाने के लिए.</li>
		<li>५० mm Tris में बुझती वामोN टिप विसर्जित कर दिया, ५० mm NaCl 2 मिनट के लिए बफर आधार रेखा स्थापित करने के लिए ।</li>
		<li>5 मिनट के लिए ०.५ µ एम सुरक्षात्मक प्रतिजन ताकना (फिलीस्तीनी अथॉरिटी), ५० mM Tris, 50mM NaCl में बुझती वामोn टिप विसर्जित करने के लिए वामोn-फिलीस्तीनी अथॉरिटीताकना जटिल बनाएं ।</li>
		<li>एक बार पीएताकना जुड़ा हुआ है, पीएताकना समाधान से टिप को दूर करने और 30 सेकंड के लिए ५० mm Tris, ५० mm NaCl में टिप विसर्जित करने के लिए दूर किसी भी गैर विशेष रूप से बाध्य PAताकनाधोना ।</li>
		<li>०.५ µ एम CMG2 रिसेप्टर (transmembrane डोमेन के बिना), ५० मिमी Tris, ५० मिमी NaCl, 5 मिनट के लिए में वामोएनपीएताकना परिसर विसर्जित कर दिया ।</li>
		<li>५० mm Tris, ५० mm NaCl के लिए 30 सेकंड के लिए दूर करने के लिए किसी भी असीम CMG2 पूर्व endosomal परिसर फार्म धोने में वामोN-PAताकना-CMG2 परिसर विसर्जित कर दिया ।</li>
		<li>EM विश्लेषण के लिए, एक पीसीआर ट्यूब के अंदर ५० mm डीटीटी, ५० mm Tris, ५० mm NaCl के 5 µ एल में टिप विसर्जित करके, वामोएन-पीएताकना-CMG2 जटिल से ।</li>
		<li>परिसर से पेप्टाइड्स के मिलकर एमएस विश्लेषण के लिए, रिलीज वामोएन-फिलीस्तीनी अथॉरिटीताकना-CMG2 परिसर में एक पीसीआर ट्यूब के अंदर 5 µ एल ५० mm डीटीटी, 6 एम GuHCl (केरातिन-free), 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट पीएच ८.० में विसर्जित कर दिया । . यह EM विश्लेषण के लिए इस्तेमाल एक से एक अलग सी सेंसर पर किया जाता है ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PDEA पर ताकना एंथ्रेक्स विष परिसर की विधानसभा-संशोधित अमीन प्रतिक्रियाशील
	<ol>
<li>पीएच संक्रमण के बाद परिसर को देखने के लिए, 1.1.1 कदम प्रदर्शन-1.1.12 पिछले अनुभाग में वामोN-PAताकना-CMG2 परिसर उत्पंन करते हैं ।</li>
		<li>5 मिनट के लिए एक 10 मिमी एसीटेट पीएच ५.० में एक से अधिक सेंसर टिप विसर्जित पीएताकना संक्रमण के लिए फिलीस्तीनी अथॉरिटी के संक्रमण आरंभ करने के लिए । इस संक्रमण आयाम बढ़ (लगभग ०.२ एनएम) द्वारा संकेत दिया है एक बड़ा आयाम गिरावट है कि पर्याप्त या पूरा रिसेप्टर पृथक्करण कम बाध्यकारी संबंध के कारण होने की कल्पना है द्वारा पीछा किया ।</li>
		<li>५० mm Tris, ५० mm NaCl, पीएच ८.० में, 30 सेकंड के लिए अम्लीय बफर धोने के लिए में वामोएन-पीएताकना टिप विसर्जित कर दिया ।</li>
		<li>EM विश्लेषण नमूना के लिए, डाइसल्फ़ाइड रिलीज़ के बाद समाधान में एकत्रीकरण को रोकने के लिए 5 मिनट के लिए १.२५ mm micelles (२.५ mm MSP1D1, 25 mm Na-cholate, १६२.५ mm POPC) युक्त सॉल्यूशन में एक साथ, एक समाधान में शामिल है ।</li>
		<li>EM विश्लेषण के लिए, एक पीसीआर ट्यूब के अंदर ५० mm डीटीटी, ५० mm Tris, ५० mm NaCl के 5 µ एल में टिप विसर्जित करके वामोN-PAताकना-Micelle जटिल से ।</li>
		<li>परिसर से पेप्टाइड्स के मिलकर एमएस विश्लेषण के लिए, इस micelle को 5 µ एल ५० एमएम डीटीटी, 6 एम GuHCl (केरातिन-फ्री), 25 एमएम अमोनियम बिकारबोनिट पीएच ८.० में एक पीसीआर के अंदर विसर्जित करके, एक सेंसर टिप से वामोN-PAबेचारी परिसर (कोई नहीं) रिलीज ट्यूब. यह EM विश्लेषण के लिए इस्तेमाल एक से एक अलग सी सेंसर पर किया जाता है ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. visualizing और मांय जारी Macromolecular सभाओं BLI से नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा
<ol><li>एक कार्बन लेपित घन ३०० ग्रिड निर्वहन चमक । ठेठ चमक निर्वहन सेटिंग्स ०.३८ mBar स्थिर वातावरण दबाव, नकारात्मक 15 mAmps, 20 सेकंड, तो हवा के साथ वेंट कर रहे हैं ।</li>
	<li>साफ चिमटी की एक जोड़ी के बीच सुरक्षित ग्रिड ।</li>
	<li>पिपेट ग्रिड पर पीसीआर ट्यूब में जारी जटिल नमूना के 4 µ एल और 60 के दशकों के लिए सोखना अनुमति देते हैं ।</li>
	<li>दूर एक फिल्टर कागज कील के साथ तरल शेष बाती ।</li>
	<li>pipetting 5 µ एल द्वारा ग्रिड दाग ०.७५% ०.०२ माइक्रोन फ़िल्टर uranyl प्रारूपण और बाती दूर अतिरिक्त दाग 5 सेकंड के बाद । ग्रिड को कमरे के तापमान पर सूखने दें ।</li>
	<li>देखें सना हुआ नमूना ग्रिड एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग.</li>
</ol>3. पूरा पूर्व endosomal एंथ्रेक्स विष परिसर की पहचान (वामोएन-पीएताकना-CMG2) और संक्रमणीय परिसर (वामोn-paताकना CMG2 बिना) मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर ।
<ol><li>1 घंटे के लिए 20 µ एल और गर्मी के लिए जारी नमूनों पतला ।</li>
	<li>५५ मिमी iodoacetamide, 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट, पीएच ८.० के 2 µ एल जोड़ें, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन (एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर) ।</li>
	<li>25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के १०० µ एल के साथ नमूना पतला, पीएच ८.०, 1 मीटर नीचे guanidine हाइडरोक्लॉराइड एकाग्रता को कम करने के लिए ।</li>
	<li>३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 20 एनजी/µ एल और गर्मी में अनुक्रमण ग्रेड संशोधित trypsin के 5 µ एल जोड़ें ।</li>
	<li>5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए हिमनदों एसिटिक एसिड जोड़ें < 3 के लिए पीएच को कम करने के लिए, तो वैक्यूम ध्यान में 10 µ एल के लिए मात्रा को कम ।</li>
	<li>एनएलसी १२०० uHPLC के पारखी पर नमूना प्लेट के लिए पेप्टाइड समाधान स्थानांतरण.</li>
	<li>लोड 5 µ l पेप्टाइड समाधान पर एक uHPLC उलट चरण स्तंभ MS के ionization चरण पर घुड़सवार.</li>
	<li>15 µ एल के साथ ०.१% फार्मिक एसिड की अधिकतम दर पर धो कॉलम 5 µl/न्यूनतम और/या ८०० साई के अधिकतम दबाव ।</li>
	<li>Elute पेप्टाइड्स के एक प्रवाह दर पर उलट-चरण C18 स्तंभ से ३५० nL/मिनट एक ९० मिनट की अवधि में एक + बी में विलायक बी के ४०% के लिए 5% की एक लाइन ढाल का उपयोग कर (विलायक एक: ०.१% फार्मिक एसिड; विलायक बी: ०.१% फार्मिक एसिड के साथ ९५% acetonitrile) ।</li>
	<li>विश्लेषण लाइन पर eluting पेप्टाइड्स मिलकर एमएस का उपयोग कर ।<ol>
<li>ionization स्रोत सेट करने के लिए २५०० वोल्ट और आयन स्थानांतरण तापमान के लिए २५० ° c.</li>
		<li>स्वचालित नियंत्रण के तहत जन स्पेक्ट्रोमीटर संचालित करने के लिए लगातार एक एमएस के रूप में एक 3 एस अवधि में संभव के रूप में कई मिलकर MSMS के बाद स्कैन, सीआईडी और ३५ के एक सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा का उपयोग कर ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>मानक तरीकों का उपयोग कर पेप्टाइड और प्रोटीन घटकों की पहचान । इस काम के लिए पेप्टाइड और प्रोटीन विश्लेषण के दो सेट प्रदर्शन किए गए ।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphenation+of+surface+plasmon+resonance+imaging+to+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+by+on-chip+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry+analysis.">Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis.</a> Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).</li><li>Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+patterned+biochips+for+on-chip+immuno-MALDI-TOF+MS:+SPR+imaging+coupled+multi-protein+MS+analysis.">Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis.</a> The Analyst. 137, 386-392 (2012).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).</li><li>Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+kinetics+of+the+pH-driven+transition+of+the+anthrax+toxin+prepore+to+the+pore+by+biolayer+interferometry+and+surface+plasmon+resonance.">Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+anthrax+toxin+pore:+Lethal-factor+complexes+into+lipid+nanodiscs.">Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs.</a> Protein Science. 22, 492-501 (2013).</li><li>Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+periplasmic+production+of+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+Pseudomonas+fluorescens.">Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens.</a> Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).</li><li>Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABRF-MIRG+benchmark+study:+Molecular+interactions+in+a+three-component+system.">ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system.</a> Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).</li><li>Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+biological+characterisation+of+a+sensor+surface+for+bioprocess+monitoring.">Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).</li><li>Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+unfolding+of+anthrax+lethal+factor+by+protective+antigen+oligomers.">Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. , 171-184 (2015).</li><li>Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structurally+altered+and+aggregated+states+of+therapeutically+relevant+proteins+using+GroEL+coupled+to+bio-layer+interferometry.">Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry.</a> Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).</li><li>Bandyopadhyay, A., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminoboronate-based+peptide+cyclization+that+responds+to+pH,+oxidation,+and+small+molecule+modulators.">Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).</li><li>Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+occlusion+of+both+cavities+of+the+eukaryotic+chaperonin+with+antibody+has+no+effect+upon+the+rates+of+beta-actin+or+alpha-tubulin+folding.">Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).</li><li>Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Tomography:+A+Three-Dimensional+Analytic+Tool+for+Hard+and+Soft+Materials+Research.">Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research.</a> Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).</li></ol>

इस समय कोई प्रकटीकरण नहीं ।

की पहचान करने और vivo में प्रोटीन कॉंप्लेक्स विधानसभा शासी जैव रासायनिक शोधकर्ताओं के लिए अत्यधिक ब्याज की है समझ । बड़े विषम प्रोटीन सभाओं के आदर्श के बजाय अपवाद हैं । इस धारणा vivo विधानसभा में स्पेक्ट्रोस्कोपी निगरानी द्वारा समर्थित है, gentler सेल व्यवधान तकनीकों का उपयोग कर परिसरों को अलग, समानता से उत्पादों का मूल्यांकन-शुद्धि तरीकों आधारित है, और उंहें उच्च संकल्प का उपयोग visualizing क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) । सेल के भीतर विधानसभा विशिष्टता के नियंत्रण को समझने के लिए, शोधकर्ताओं को नियमित रूप से अलग करना चाहिए, की पहचान, और अंततः इन गतिशील कोडांतरण/ सबसे भारी इस्तेमाल किया आणविक उपकरण इन सभाओं के घटकों की पहचान करने के लिए अक्सर एंटीबॉडी आधारित immunoprecipitation, जो सेल व्यवधान के दौरान जटिल स्थिरता बनाए रखने पर निर्भर करता है की आवश्यकता है । विभिन्न युग्मित विश्लेषणात्मक तकनीक हाल ही में microfluidic आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर सेल नमूनों से परिसरों पर कब्जा करने के लिए विकसित किए गए थे, जैसे सतह plasmon अनुनाद (SPR). SPR सतहों से हटाने के बाद, इन नमूनों मैट्रिक्स द्वारा विश्लेषण किया गया था असिस्टेड लेजर desorption/ionization उड़ान के समय (मालदी-तोफ)1,2. आसान प्रोटोकॉल का उपयोग कर इस पद्धति को आगे बढ़ाने के शोधकर्ताओं कल्पना करने के लिए और सत्यापित परिसरों कि सेलुलर वातावरण में होने की भविष्यवाणी की अनुमति देगा । चूंकि SPR एक microfluidics आधारित प्रणाली है, समस्याओं को अक्सर कुल गठन से उठता है । इस समस्या को दरकिनार नमूना कमजोर पड़ने की आवश्यकता है, जो बारी में, एकाग्रता उत्तरदायी जैविक परिसरों की अखंडता को कम कर सकते हैं.
लेबल मुक्त प्रौद्योगिकियों में एक अपेक्षाकृत हाल ही में प्रगति के विकास के लिए है interferometry (BLI) प्रणाली3। इन विशेष प्रकाश आधारित चिंतनशील प्रणाली दोहराने, या सबसे अच्छा अनुकरण, SPR बाध्यकारी और काइनेटिक परिणाम3लागत,4 के एक अंश पर विशेष रूप से अगर एक चैनल इकाइयों का उपयोग किया जाता है । BLI एक संदर्भ परत (नियंत्रण) और (प्रयोगात्मक) सतह के बीच प्रतिबिंबित प्रकाश हस्तक्षेप पैटर्न में परिवर्तन के उपाय । चरण में परिणामस्वरूप परिवर्तन एक काइनेटिक और मात्रात्मक readout5के रूप में वास्तविक समय में मापा जाता है । , विशिष्ट स्थिरीकरण chemistries युक्त, शारीरिक रूप से समाधान के बीच स्थानांतरित कर रहा है, के रूप में SPR में microfluidic दृष्टिकोण से बफर परिवर्तन का विरोध किया है, तरंग दैर्ध्य चरण विक्षेप के माध्यम से माप के लिए । जन स्थानांतरण प्रभाव आंदोलन को हल करने से रोका जाता है । SPR के विपरीत, इन प्रणालियों क्रूड जैविक नमूनों से परिसरों का मूल्यांकन करने में काफी उपयोगी होते हैं । शारीरिक BLI प्रयोगों के दौरान मापा पैरामीटर मुख्य रूप से बायोमास या मोटाई में एक परिवर्तन पर निर्भर करता है जो प्रोटीन जटिल विधानसभा या विधानसभा से परिणाम ।
इन फाइबर ऑप्टिक के लिए उपयोग करने के लिए आसान है और अपेक्षाकृत सस्ती सेंसर । एक BLI के उभरते उपयोगी पहलुओं की सतह से नए इकट्ठे प्रोटीन परिसरों के सतही हटाने है । इस पद्धति का एक हाल ही में आवेदन हमारी प्रयोगशाला के लिए बड़े पैमाने पर कैनेटीक्स के वास्तविक समय का निरीक्षण करने की अनुमति दी पीएच एंथ्रेक्स विष सुरक्षात्मक प्रतिजन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के घटक के रूप में संक्रमण कीसंरचना पुनर्व्यवस्था पोरे (पीएपोरे) रूप. इस पर संक्रमण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM)6का उपयोग कर सत्यापित किया गया था । microfluidics प्रणालियों का उपयोग करते समय चिप सतहों से परिसरों को रिहा जब बड़ी मात्रा कमजोर पड़ने प्रभाव अक्सर का सामना करना पड़ा जब से जटिल सेंसर सतहों से बचा जाता है ।
मौजूदा काम में एंथ्रेक्स विष परिसरों को इकट्ठा और विभक्त कर रहे हैं और फिर से microliter मात्रा में जारी है । जिसके परिणामस्वरूप जटिल घटकों का उपयोग कर मान्य हैं orthogonally EM और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>BR100058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL black microtubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688304-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 50 &#956;m x 150mm, C18, 2 &#956;m, 100 &#197;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>164561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38SL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips</td>
			<td>Forte Bio</td>
			<td>18-5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter, 0.02um</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>6809-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz System</td>
			<td>Pall Forte Bio</td>
			<td>45-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Morphogenic Gene-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon coated Cu 300 grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-CU-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acids</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>0129-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GuHCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>MP-BioMedicals,LLC</td>
			<td>100-351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cystiene hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethal Factor N-terminal domain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS software version 2.2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>090M14531V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easiGlow glow discharge cleaning system</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>91000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective Antigen prepore</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-795C 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequest HT search engine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP334-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl formate (UF)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30487</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing dynamic protein complexes assembled on and released from biolayer interferometry biosensor using mass spectrometry and electron microscopy

vivo में, प्रोटीन अक्सर बड़े macromolecular कॉम्प्लेक्स का हिस्सा होते हैं, जहां बाइंडिंग विशिष्टता और गतिशीलता अंततः कार्यात्मक outputs हुक्म देती है । इस काम में प्री-endosomal एंथ्रेक्स विष इकट्ठा हो जाता है और endosomal परिसर में संक्रमण हो जाता है. सबसे पहले, एन एक cysteine उत्परिवर्ती घातक कारक के टर्मिनल डोमेन (वामोएन) एक इष्टतम अभिविंयास में डाइसल्फ़ाइड युग्मन के माध्यम से एक interferometry परत (BLI) से जुड़ा हुआ है, सुरक्षात्मक प्रतिजन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के लिए बाइंड करने की अनुमति (Kd 1 एनएम) । इष्टतम उंमुख वामोN-PAताकना जटिल तो घुलनशील केशिका morphogenic जीन-2 (CMG2) सेल सतह रिसेप्टर (कश्मीरडी १७० बजे), एक प्रतिनिधि एंथ्रेक्स पूर्व endosomal परिसर, पीएच ७.५ पर स्थिर में जिसके परिणामस्वरूप के लिए बांधता है । इस इकट्ठे परिसर तो अंलीकरण के अधीन है (पीएच ५.०) देर endosome पर्यावरण के प्रतिनिधि संक्रमण करने के लिए झिल्ली में पीएताकना डाला राज्य में ताकना । CMG2 रिसेप्टर और वामोN-paताकना और संक्रमण ताकना से CMG2 की एक पर्याप्त पृथक्करण के बीच एक कमजोर बंधन में यह पीएताकना राज्य परिणाम । इस thio-से वामो केएन की आसक्ति को dithiothreitol से आसानी से उलटा कर दिया जाता है. BLI पर कम सेंसर सतह विज्ञप्ति वामोn-paताकना-CMG2 त्रिगुट परिसर या एसिड microliter मात्रा में वामोn-paताकना परिसर में संक्रमण । जारी परिसरों तो visualized रहे है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर की पहचान की । ये प्रयोग प्रदर्शित करता है कि कैसे की निगरानी के लिए काइनेटिक विधानसभा/लेबल मुक्त BLI के तरीके का उपयोग कर विशिष्ट प्रोटीन परिसरों के विधानसभा/और संरचना और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और जनसंचार द्वारा इन BLI इकट्ठे परिसरों की पहचान का मूल्यांकन स्पेक्ट्रोमेट्री, क्रमशः, आसानी से दोहराने अनुक्रमिक प्रक्रियाओं का उपयोग कर ।

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Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

यहां हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान एंथ्रेक्स विष के विधानसभा और विधानसभा की निगरानी के लिए एक परत interferometry (BLI) का उपयोग कर । निंनलिखित विधानसभा/बायोमास सेंसर सतह पर, बड़े प्रोटीन परिसरों के दृश्य और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर परिसर के घटकों की पहचान के लिए सतह से जारी कर रहे हैं, क्रमशः ।

गतिशील प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण पर इकट्ठे हुए और बायोमास स्पेक्ट्रोमेट्री और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर परत Interferometry से जारी

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर Hsp33 पर Hsp33's Redox-विनियमित निगरानी गतिविधि और मानचित्रण गठन परिवर्तन परिभाषित करना

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

स्पेक्ट्रोस्कोपी और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा फाइब्रिन थक्का संरचना पर β-Amyloid-प्रेरित विषमता का विश्लेषण

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग

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Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री और जैव सूचना विज्ञान द्वारा पेप्टिडोग्लाइकन का अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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सैकरोमाइसेस सेरेविसिया के मात्रात्मक मेटाबोलोमिक्स ने मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...