Name: analyzing dynamic protein complexes assembled on and released from biolayer interferometry biosensor using mass spectrometry and electron microscopy
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy at JoVE.c

この作品は、マディソンとリラ自己大学院フェローシップ (AJM)、NIH の 5T32GM008359 によって支持された (PTO) 生体分子の相互作用の技術センター (BITC) 助成 (区ブリッジ資金、NIH R01AI090085 (MTF) 院長医学研究研修プログラム (PTO)CT と MTF)。著者は、TEM 画像集録について院長電子顕微鏡コアでバーバラ Fegley を感謝したいです。

1. Biolayer 干渉法 (結合) バイオ センサー表面に高分子複合体定義のアセンブリ
<ol><li>
PDEA 変更アミン反応性バイオ センサーの表面に複雑な孔形成前の炭疽菌毒素のアセンブリ
	<ol>
<li>反応性アミンを水和物 10 分のための水の 250 μ L の 2 番目の世代 (AR2G) バリ バイオ センサー チップ。</li>
		<li>バリ ユニットを制御するソフトウェアの表 1に示したステップ時間をプログラム (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>バリ 30 250 μ L 水にバイオ センサーの先端を浸すことによって実行を開始 s バイオ センサーの厚さと密度の初期のベースラインを測定します。</li>
		<li>250 μ L 50 mM NHS (N ヒドロキシスクシンイミド) と 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) 7 分に先端を浸すことによってバイオ センサーをアクティブにします。</li>
		<li>50 mM PDEA (活性化チオール反応性表面を生成する 5 分の 0.1 M ホウ酸バッファー (pH 8.5) に溶解した 2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) アクティブ バイオ センサーを浸します。</li>
		<li>250 μ L 溶液 100 に活性化チオール反応性バイオ センサーを浸漬 5 分間 10 mM ナトリウム酢酸 ph 5.0 には、100 mM の NaCl、nM E126C LFNバッファーします。</li>
		<li>50 mM の L-システイン、1 LFN先端を浸し任意残り反応性自由なチオール反応性グループを癒やすための M NaCl、0.1 M 酢酸ナトリウム、pH 5.0 4 分。</li>
		<li>50 mM のトリス、50 mM 2 分のバッファーのベースラインを確立する塩化ナトリウム焼入れ LFN先端を浸します。</li>
		<li>50 ミリメートル トリス、50 ミリメートル LFNPApreporeの複雑なを作成する 5 分の食塩 0.5 μ M 防御抗原 prepore (PAprepore) に焼入れ LFN先端を浸します。</li>
		<li>一度 PApreporeが関連付けられている PApreporeソリューションから先端を削除し、トリス、50 mM 50 mM NaCl を 30 秒の間で任意の非具体的バインドされた PApreporeを洗い流すに先端を浸します。</li>
		<li>5 分間 50 mM トリス、50 mM NaCl、0.5 μ M CMG2 受容体 (膜貫通ドメイン) なしに複雑な LFNPApreporeを浸します。</li>
		<li>フォーム前エンドソーム複雑な任意の非連結 CMG2 を洗い流すため 50 mM トリス、30 秒間 50 mM NaCl に LFNPAprepore -CMG2 複雑なを浸します。</li>
		<li>EM 解析をリリース LFNPAprepore-CMG2 50 mM DTT、トリス、50 mM 50 mM NaCl、PCR チューブ内側の 5 μ L に先端を浸すことによってバイオ センサー先端から複雑な。</li>
		<li>複合体からペプチドのタンデム質量分析、リリース LFNPAprepore-CMG2 5 μ L 50 mM DTT、6 M にバイオ センサーを浸漬によるバイオ センサー先端から複雑な GuHCl (ケラチン無料)、25 mM 重炭酸アンモニウム pH 8.0 PCR 内管.これは、EM 解析に使用したものと異なるバイオ センサーで実行されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細孔炭疽菌毒素 PDEA 変更アミン反応性バイオ センサーの表面に複雑なアセンブリ
	<ol>
<li>PH 移行後複雑なを表示するには、LFNPApreporeを生成する前のセクションでの手順 1.1.1-1.1.12 を実行-CMG2 複合体。</li>
		<li>10 mM 酢酸 pH 5.0 PA気孔転移 PApreporeの遷移を開始する 5 分間にバイオ センサーの先端を浸します。この移行は振幅の増大によって示される (約 0.2 nm) 結合親和性を減少するために相当なまたは完全な受容体解離仮説は大きな振幅の減少が続きます。</li>
		<li>50 mM のトリス、50 mM NaCl、pH 8.0、酸性バッファーを洗浄する 30 秒間 LFNPA毛穴先端を浸します。</li>
		<li>EM 解析サンプルは、ジスルフィド結合のリリース後、ソリューションの凝集を予防する 5 分間 1.25 mM ミセル (2.5 mM MSP1D1、25 mM Na とコール酸、162.5 mM POPC) を含む溶液にバイオ センサー チップを没頭します。</li>
		<li>EM 解析のリリース、LFNPA間隙-ミセル化バイオ センサー先端から複雑な 50 mM DTT、トリス、50 mM 50 mM NaCl PCR チューブ内側の 5 μ L に先端を浸すことによって。</li>
		<li>N-PApoore複雑な (ないミセル) バイオ センサーからヒント 5 μ L 50 mM DTT、6 M GuHCl (ケラチン無料)、25 mM 重炭酸アンモニウム pH 8.0 PCR 内にバイオ センサーを浸すことによって複合体からペプチドのタンデム質量分析は、LF をリリースチューブ。これは、EM 解析に使用したものと異なるバイオ センサーで実行されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 可視化し、検証するリリースのネガティブ染色電子顕微鏡によるバリ バイオ センサーから高分子アセンブリ
<ol><li>グロー放電炭素被覆銅 300 グリッドです。典型的なグロー放電設定が 0.38 mBar 安定した大気圧、負の 15 mAmps、空気を抜き、20 秒です。</li>
	<li>清潔なピンセットのペアの間にグリッドを確保します。</li>
	<li>グリッド上に PCR チューブにリリースされた複雑なサンプルの 4 μ L をピペット、60 年代の吸着ができます。</li>
	<li>離れて残っているろ紙のウェッジで液体を放出します。</li>
	<li>5 秒後、0.75 %0.02 ミクロン フィルター ウラニル ギ酸と離れて余分な染色を吸湿発散性の 5 μ L 分注でグリッドを染色します。室温で乾燥するためにグリッドを許可します。</li>
	<li>透過電子顕微鏡による染色サンプル グリッドを表示します。</li>
</ol>3 完全な事前エンドソームの炭疽菌毒素の複合体の同定 (LFNPaprepore-CMG2) と (LFNPa毛穴CMG2 なし) で複雑な遷移を用いた質量分析法。
<ol><li>20 μ L にリリースされたサンプルを希釈し、室温で 1 時間。</li>
	<li>55 mM ヨードアセトアミド、25 mM 重炭酸アンモニウム、pH 8.0、2 μ L を追加し、(アルミ箔で覆われて) 暗闇の中で室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>25 mM 重炭酸アンモニウム、pH 8.0、1 m グアニジン塩酸濃度を減らすための 100 μ L のサンプルを希釈します。</li>
	<li>20 ng/μ L のグレード変更トリプシンをシーケンスの 5 μ L を追加し、37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	<li>氷酢酸を加える最終濃度の pH を減らすために 5% < 3、それから真空濃縮で 10 μ L にボリュームを減らします。</li>
	<li>NLC 1200 uHPLC のオートサンプラーのサンプル プレートにペプチド ソリューションを転送します。</li>
	<li>MS のイオン化の段階でマウントされて uHPLC 逆相カラムにペプチド液 5 μ L をロードします。</li>
	<li>5 μL/分の最大レートで 0.1% ギ酸の 15 μ L で列または 800 psi の最大圧力を洗います。</li>
	<li>A + B (溶剤 a: 0.1% ギ酸; 0.1% ギ酸溶剤 b: 95年% アセトニ トリル) の直系グラデーション溶剤 B の 5% から 40% を使用して 90 分間 350 nL/min の流速で逆相 C18 カラムからペプチドを溶出します。</li>
	<li>タンデム MS を使用して行に溶出ペプチドを分析します。<ol>
<li>イオン化ソース 2500 ボルトとイオン転送温度 250 ° c に設定します。</li>
		<li>3 s 時代にできるだけ多くタンデム MSM が続く継続的に 1 つの MS スキャンを実行する自動制御の下で質量分析計を動作 CID および 35 の正規化された衝突エネルギーを使用しています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>標準的な方法を使用してペプチッドおよび蛋白質のコンポーネントを識別します。この仕事のためペプチッドおよび蛋白質の分析の 2 つのセットを行った。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphenation+of+surface+plasmon+resonance+imaging+to+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+by+on-chip+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry+analysis.">Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis.</a> Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).</li><li>Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+patterned+biochips+for+on-chip+immuno-MALDI-TOF+MS:+SPR+imaging+coupled+multi-protein+MS+analysis.">Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis.</a> The Analyst. 137, 386-392 (2012).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).</li><li>Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+kinetics+of+the+pH-driven+transition+of+the+anthrax+toxin+prepore+to+the+pore+by+biolayer+interferometry+and+surface+plasmon+resonance.">Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+anthrax+toxin+pore:+Lethal-factor+complexes+into+lipid+nanodiscs.">Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs.</a> Protein Science. 22, 492-501 (2013).</li><li>Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+periplasmic+production+of+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+Pseudomonas+fluorescens.">Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens.</a> Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).</li><li>Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABRF-MIRG+benchmark+study:+Molecular+interactions+in+a+three-component+system.">ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system.</a> Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).</li><li>Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+biological+characterisation+of+a+sensor+surface+for+bioprocess+monitoring.">Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).</li><li>Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+occlusion+of+both+cavities+of+the+eukaryotic+chaperonin+with+antibody+has+no+effect+upon+the+rates+of+beta-actin+or+alpha-tubulin+folding.">Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).</li><li>Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Tomography:+A+Three-Dimensional+Analytic+Tool+for+Hard+and+Soft+Materials+Research.">Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research.</a> Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).</li></ol>

この時点での開示。

このデモを示します高分子複合体の形成は、biolayer 干渉法を用いた簡単に監視することができます、どのように EM を用いて可視化して短い時間のスパンで microvolumes ですべて MS と確認します。構造組立やこの組み合わせの方法論をさらに検証する、生物学的に関連する予測に従う観測の複合体。結果のセクションで述べたように、アセンブリの成功の重要な要素は、複雑なタンパク質インターフェイスが正しくバイオ センサー面から離れる方向に合理的に設計されたシステインの変異を必要があります。
以前のシステムは発現タンパク質の受容体結合の整合性だけでなく、2 つ、3 つのコンポーネント システムの蛋白結合を評価するバリ、MS の技術を使用しているが、方法両方のインスタンスでタンデム EM/MS の活用開発されなかった8,9に近づきます。のみ他干渉システム相互作用の特徴を支援する MS 解析を組み合わせたデュアル偏光干渉計10であった。残念ながら、このシステムはもはや一般的な使用可能です。導入で述べたように、多くのサンプルが SPR のようなバイオ センサー表面に形成されるが、MS 分析から削除を完了した研究がありました。これらの例のどれもは、EM を用いて可視化する複合体で起因しませんでした。
このフレームシーケンシャル方式の限界は多くすることができますが解ける。初期固定とそのアセンブリの基礎ステップ、構造相互作用面の知識の欠如を妨げる進行初期アセンブリ フェーズを監視に関連付けられている確かに。構造情報の欠如は、エンジニア リング設計によって対処できる基盤構築場所添付ファイル化学 (例えばスルフヒ部位のジスルフィド結合の/彼の付けられた位置決め) コア内のさまざまな領域に移動することができます組立システム。炭疽菌毒素複合体の場合は、利用可能な11を LFN PApreporeにバインドの構造には幸運だった。設計されたシステインの合理的な配置は PApreporeバインド顔からの地域にローカライズされました。システイン リンケージ化学とその他の反応性のシステインがタンパク質表面に存在しないことが望ましいです。
様々 な添付ファイル化学蛋白質の表面上の特定の添付ファイルのサイトを設計する使用ことができますがあります。最も人気のある特定の添付ファイルのいずれかを含むタンパク質表面12上具体的に定義した場所にビオチン基を配置します。残念ながら、アビジンまたはストレプトアビジンにビオチン結合コーティング表面はかなりきつい。結合相互作用の逆転は単純ではないです。設計された彼のタグの N 末端または C 領域で使用、その後 Ni NTA 面付着性、親和性固定のより普遍的なアプリケーションです。もちろん、彼の付けられたシステム工学アセンブリ添付ファイルをサイトの注意事項の 1 つはコア アセンブリ蛋白の N 末端と C-のまま公開、添付ファイルが簡単に分離要件です。として、アセンブリ プロセス、コア アセンブリ蛋白質の相互作用のインターフェイスを複雑なアセンブリが進むにつれて使用可能ななりません。
おそらくバイオ センサー表面化学反応を使用して最も一般的な懸念、非固有のバインディングです。ストレプトアビジンのヒント重要な非特異的結合効果のソースが多い。二硫化物リンク ビオチンをストレプトアビジンを固定化したバイオ センサー13と密接に減らされた S ビオチン リンケージを残して非常に特定の錯体を解放する使用できます。リバーシブルの化学的性質を iminoboronates などと低い範囲 ketoamide14に利用可能になっています。このフィールドは現在発展途上がさらに共有結合の対象となる医薬品開発の利用に伴う一般的オフ対象薬物毒性影響を避けるためにリバーシブルの共有プロトコルの開発に高い関心があります。
EM を使用して複合体を可視化する制限は、解釈、特に組み立てられた複合体の構造は、当初知られていないインスタンスです。未定義組み立てタンパク質内のコンポーネントの空間的な位置は、特定の運動や構造のマーカーとしてモノクローナル抗体 (mAb) を使用して識別できます。たとえば、複合体を形成すると、一度は特定のコンポーネントにバインドするモノクローナル抗体を追加することがことができます。このメソッドを大規模なアセンブリ15内の特定のコンポーネントを識別するために EM の使用頻繁。別の制限は、複合体のサイズに関連、汚れ EM をされているが、定義された対称アセンブリ 70 kDa (GroES heptamer) は、簡単に小さな解決を使用してインスタンスの負。EM によって分析される組み立ての複合体は、通常、〜 100 Å 以上の直径のサイズの範囲で。最近しかし、20 kDa のタンパク質が解決されている、優れた染色方法論16を使用する場合、低解像度の構造がしました。
MS 分析用フェムトモル (attomoles) レベルの MS 計測器の高められた感度増やすことができますいくつかのケースでバリ検出の感度。高振幅の最小が反復可能な上昇を示す蛋白質信号問題の蛋白質の同定であることが考えられます。さらに、バイオ センサー、細胞環境の他のパートナーの 1 つに蛋白質蛋白質の相互作用に有効になります精製とその後新しく形成された複合体の検出現在の高感度 MS システムで観察することがあります 1 つの制限は興味の蛋白質のデータベースでは、できない場合がありますが、この観測はまれである (例えば、希少種からプロテオーム)。興味の蛋白質のシーケンスがわからない場合は、(前述のプロトコル セクションでこの仕事の) 背景蛋白質データベースにおける蛋白のアミノ酸配列をこの問題は簡単に解決します。Trypsinolysis タンパク質の抵抗から方法論のもう一つの潜在的な制限の検索結果します。トリプシンの消化力、タンパク質同定ボトムアップの既定のメソッドです。Arg と Lys 残基がないまたは折り畳まれた構造によってこれらの残基へのアクセスが制限される場合、タンパク質はトリプシンに耐性あります。これらの制限は、それぞれ、酵素消化する前に (尿素やグアニジン HCl、1.1.14 と 1.2.6 で示されているように) 展開試薬を含むまたは代替またはプロテアーゼの組み合わせを使用して解決されます。
この方法論の可能な拡張は、ユーザーが従うし、原油のセル lysates から細胞アセンブリの複合体を識別できるように含まれます。それは濃縮細胞抽出物のアセンブリ構成部品は簡単 biolayer 干渉法のプロシージャを使用して実行するテスト判明します。目詰まりを起こし、集計に敏感である一般的に使用されるマイクロ ベースの方法論とは異なりバリ アプローチを直接 biolayer センサーの先端を直接潜在的な複合体を組み立てるための粗抽出物に没頭する使用ことができます。これらから不純なサンプルを集中しました。組み立てた後、さらに特定しても微量 MS 法による同定された細胞の抽出物の疑いのある成分量的に表わすバリ システムへのフォロー アップとして抗体プローブを使用する完全に可能です。もう一度、ここのキーは特定のアフィニティ プローブとして定義し、適切な方向のコア蛋白質を使用します。
バリと速度論的移行プロセスを入念にする prepore を表示する機能は特に後期エンドソーム、低 pH (5.0) の下で機能する蛋白質遷移の潜在的な「アンチ毒素」の小分子阻害剤を識別するに非常に便利になります条件。間隙の移行この pH による prepore は、スクロース、グリセリンなどのスタビライザー (osmolyte) の折りたたみの存在下で抑制される、したがってを貸す PA を防ぐ特定のターゲットを絞った折りたたみの安定剤を開発するための強力なサポート細孔形成。この特定のアプローチを回避し、pH 低下蛋白質の沈殿物につながる原油集計に基づく試金を置き換えられます。この後者の方法では、主な事前チェック方法の良いもののしばしばにつながる偽陽性の結果特定の化合物が、集計ではなく、実際の分子の遷移を抑制します。
構造体の下流の観測と小さな微量サンプルの内で個々 のアセンブリ構成部品の識別は、潜在的な鉛化合物の検証に役立つことができます。これは、特定のアセンブリの安定または不安定化のいずれかが対象となる結果に適用できます。このキネティック/構造/識別する並列方法役に直接アセンブリの疑いのある鉛化合物エフェクターの妥当性を確認するため、合理的な二次審査手順または中程度のスループットのアプローチとしています。
Cryoem は、アセンブリのさまざまな状態における高分子複合体の原子の詳細を学習するための便利な方法です。Cryoem サンプルを準備する前に、まず準備に EM のネガティブ染色と合理的に純粋な均質な錯体が含まれているを確認することが重要です。ここに記載した作業は、バリ バイオ センサー表面上のタンパク質複合体のアセンブリの EM の可視化、これらの複合体のリリースと MS を使用してこれらのコンポーネントの識別を示しています。制御アセンブリとリリースのこの特定のメソドロジは、ネガティブ染色 EM、ステップに進む前に実証する必要がありますが必要なため同種の連続サンプル準備を高める非常に特定のプロトコルを生成する際に便利CRYOEM。低解像度の 3 D 構造を得るためには、複合体の 30-50 粒子だけが向き多様性 (複数の異なるビュー) がある場合、円錐傾斜シリーズ (粒子あたり 70 ビュー異なる 2D イメージ) を実行する必要になります。
MS の方法の強化、基準感度の進歩とサンプル量の削減は、改善し続けます。ナノ流と高速の義務と質量分析装置の開発と超高圧液体クロマトグラフィー サイクル、感度と解像力。Orbitrap 質量分析計の最近の導入、特に検索アルゴリズムと同様に、最新バージョン (orbitrap 融合 Lumos と予想される後継者 Orbitrap 融合 Lumos 1 M) 大幅このプロセスを促進します。
現在の方法は、キネティック組立・ ラベル無料バリの方法論を用いた炭疽菌毒素成分の分解を監視し、評価構造と EM と MS、それぞれ使用してこれらのコンポーネントの id。シンプルなシングル チャンネル バリ システムの使用と相まって負染色 EM 解析ルーチンと小学校の MS 技術、アセンブリ プロセスを特徴付けるため十分以上。

識別して蛋白質複雑なアセンブリ体内を支配する特異性を理解する生化学研究者の極端な関心です。大規模な異種タンパク質複合体は例外よりもむしろ標準です。この概念は穏やかなセルの中断の技術を使用して、親和性に基づく精製方法から製品を評価、それらを可視化の複合体を分離する、アセンブリの生体内での分光学的監視でサポートされている高解像度を使用して極低温電子顕微鏡 (Cryoem)。セル内でアセンブリの特異性の制御を理解するには、研究者は日常的に分離、識別、および最終的に構造物組立/分解作業これら動的特性を評価します。頻繁にこれらのアセンブリのコンポーネントを識別するために最も頻繁に使用される分子ツールは、セル中断中の複雑な安定性の維持に依存している抗体を用いた免疫沈降を必要です。様々 な連成解析技術は、表面プラズモン共鳴 (SPR) など、マイクロ ベースのアプローチを使用して細胞サンプルから複合体をキャプチャする最近開発されました。SPR 表面から除去、続いてこれらのサンプルは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行 (MALDI-TOF)1,2時間によって分析されました。容易にプロトコルを使用してこの方法を進める細胞環境で発生する予測の錯体を検証を視覚化して研究者になります。SPR はマイクロ ベースのシステムですので、集計の形成からしばしば問題が発生します。この問題を回避には、サンプルの希釈は、ターンでは、濃度を負う生物学的複合体の整合性を減らすことができます必要があります。
無料のラベル技術で比較的最近の進歩 biolayer 干渉法 (結合) システム3の開発であります。これらの複製、または最もよいシステムをエミュレート特定光ベースの反射率、SPR バインディングと単一チャネル単位を使用している場合は特にコスト3,4の分数で運動の結果。バリは、参照レイヤー (コントロール) と (実験) biolayer 表面の反射の光干渉パターンの変化を測定します。フェーズで発生した変更は、速度論的および定量的な読み出し5としてリアルタイムで測定されます。特定固定化化学を含むバイオ センサー表面は、波長位相たわみによる測定のため、SPR でマイクロ アプローチによってバッファーの変更ではなく、ソリューションの間物理的に転送されます。物質移動の影響は、ソリューションを攪拌によって防止されます。SPR とは異なりこれらのシステムはかなり原油の生体試料からの複合体の評価に有用です。主にバリの実験中に測定する物理パラメーターは、質量または蛋白質複雑なアセンブリまたはアセンブリ解除に起因するバイオ センサー表面に厚さの変更に依存します。
これらの繊維の光学バイオ センサーは使いやすく、比較的安価です。バリの新興の有益な側面の 1 つは、新しく組み立てたタンパク質表面の安易な除去です。大規模な pH のリアルタイム動態を観察するこのメソッドは当研究室を許可されての最近のアプリケーションは、prepore (PAprepore) に移行、炭疽菌毒素防御抗原 (PA) コンポーネントのタンパク質構造転位を誘発、細孔 (PA間隙) フォーム。バイオ センサー チップのこの転移は電子顕微鏡検査 (EM)6を用いて検証しました。バイオ センサーの表面錯体の除去より大きい体積希釈効果頻繁マイクロ流体システムを使用する場合、チップ表面錯体を解放するときに発生を回避できます。
現在の仕事で炭疽菌毒素複合体組み立てとバイオ センサー表面に分解、1 マイクロリットル ボリュームにそれから解放されます。結果、複雑なコンポーネントは、直交 EM と質量分析法 (MS) を使用して検証されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>BR100058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL black microtubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688304-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 50 &#956;m x 150mm, C18, 2 &#956;m, 100 &#197;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>164561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38SL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips</td>
			<td>Forte Bio</td>
			<td>18-5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter, 0.02um</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>6809-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz System</td>
			<td>Pall Forte Bio</td>
			<td>45-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Morphogenic Gene-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon coated Cu 300 grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-CU-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acids</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>0129-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GuHCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>MP-BioMedicals,LLC</td>
			<td>100-351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cystiene hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethal Factor N-terminal domain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS software version 2.2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>090M14531V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easiGlow glow discharge cleaning system</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>91000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective Antigen prepore</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-795C 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequest HT search engine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP334-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl formate (UF)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30487</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing dynamic protein complexes assembled on and released from biolayer interferometry biosensor using mass spectrometry and electron microscopy

生体内でタンパク質結合特異性とダイナミクスは最終的に機能出力決定に大きな高分子複合体の部分が多い。今回、プレ エンドソーム炭疽菌毒素は組み立て、複雑なエンドソームに移行します。まず、システインの変異体致死因子 (LFN) の N 末端ドメインは防御抗原 (PA) prepore (Kd 1 nM) をバインドするをできるように、最適な方向に結合ジスルフィド結合を介して biolayer の干渉 (結合) バイオ センサーに接続されます。複雑な最適指向 LFNPAprepore可溶性毛細血管形態形成遺伝子 2 (CMG2) 細胞表面受容体にバインド (Kd 170 pM)、代表的な炭疽菌前エンドソームの複雑な pH 7.5 で安定しています。この組み立ての複合体膜挿入孔状態 PApreporeに移行し後期エンドソーム環境の酸性 (pH 5.0) 代表にさらされます。この PA の毛穴状態は CMG2 受容体と細孔LFNPA 遷移孔から CMG2 の実質的な解離と弱体化したバインディングの結果します。バイオ センサー表面に LFNのチオ添付ファイル ジチオトレイトールによって簡単に逆転させます。バリ バイオ センサー面上削減解放 LFNPAprepore-CMG2 複合体または酸は 1 マイクロリットル ボリュームに LFNPA孔複合体を移行します。リリースされた複合体は、可視化し、電子顕微鏡や質量分析法を使用して識別されます。これらの実験は、ラベル無料バリの方法論を使用して特定の蛋白質複合体の運動の組み立て/分解をモニターし、構造を評価する方法を示し、これらのバリの id は、電子顕微鏡や質量によって錯体を組み立て分析法、それぞれ複製簡単連続した手順を使用します。

大規模な高分子複合体のアセンブリを検証および監視する機能は、特異性と大きな生体分子のアセンブリの機能を理解することの方の重要なステップです。ここに提示されたメソッドの結果を示すどの大規模なタンパク質複合体を容易 (> 150 kDa 質量) とアセンブリの振幅を監視しながら biolayer 干渉計を使用して組み立てることができます。バイオ センサー表面のユニークなコンパクトな性質には、小さな microvolumes に組み立てられた複合体を解放することによって拡張されるアセンブリ分析ができます。これらの microvolumes は、EM を用いた複合体の初期の物理的な構造を視覚化して MS を使用して複雑なコンポーネントの id を確認する使用できます。この全体のプロセスの概要を図 1に示します。
アセンブリが成功したとバイオ センサー表面上の高分子複合体の検証のための重要な要素には、初期の種子蛋白質の適切な向きが含まれます。これにより、蛋白質蛋白質の相互作用部位がアクセス可能な立体ブロックされていない、およびバイオ センサー面から最適な位置。致死因子 (LFN) の特に設計された N 末端フラグメントを使用して、複雑な炭疽菌毒素の適切な向きを達成できる図2 LFNPAprepore結合部位は常に配置されるのでバイオ センサー共有結合サイト6、7の逆。PA の PA に、水溶性の CMG2 結合に続く LFNバリのバイオ センサーへのバインディングで複合体の後蓄積最終的に作成します転座有能な炭疽菌毒素複雑です。
バイオ センサーに追加されると、バリ sensogram トレースは炭疽菌毒素コンポーネントの特定の添加による振幅変化リアルタイム読み取りです。図 3代表的なトレース プロセスの手順でフォームに予測した複合体のモデルとペアを示しています。最初の上昇は LFNチップにロードです。焼入れとベースラインの後、PAprepore LFN LFNPApreporeの複合体の組み立て前エンドソーム結果可溶性 CMG2 受容体の添加に続いてにバインドされます-CMG2。後期エンドソーム環境に向かって進行するには、全体の複合体は、バインド、その挿入拡張膜細孔構造に移行する prepore 受容体を弱める低 pH パルス (pH 5.0) を受けます。6酸性化のステップの Sensogram トレースは、図 4のとおりです。初期の増加または振幅で ' スパイク' CMG2 受容体結合の減少の前に発生する必要があります毛穴拡張6が。大きい振幅減少は、減少した結合親和性のための最も可能性の高い実質的なまたは完全な受容体解離です。この研究室で前の仕事は、毛穴完全に伸ばした PA CMG2 バインディングは CMG2 PAprepore相互作用6比べて無視されて示されます。加えて、sensogram キネティック トレースは LFNPApreporeのすべての sensograms で観察-LFNPA間隙の pH 滴と CMG2 遷移は、複数の実行を再現。
前に前後の酸性化、バイオ センサー接続された複合体は EM のネガティブ染色による可視化と (図 5) 質量分析法による同定のため簡単に解放されます。EM 結果から代表的な複合体は、図 6のとおりです。Pre エンドソーム サンプル グリッド表示密度 LFNPApreporeから成るそのまま三元錯体と一貫性のある-CMG2。後酸性化複雑なグリッド表示 PA 間隙に移行し、ない明白な CMG2 の密度とミセル含めることによって可溶化します。
前の id とポストの酸性化の複合体は、MS によって検証されました。データベース、ペンシルバニア、P13423; のシーケンスLFNP15917;CMG2、P58335、NCBInr リポジトリから派生したマウスのタンパク質データベースの背景に含まれていた。この初回のデータベース検索、次のアミノ酸カバレッジ三項およびバイナリの複合体から得られた興味の蛋白質のみ: CMG2、43% と lf 6% 36 %pa の 22% 54% それぞれ (CMG2 はバイナリの複合体検出されない)。蛋白質のアミノ酸のカバレッジを最大化するためにのみ興味の 3 つの蛋白質を含んでいる蛋白質のデータベースを使用して 2 番目のペプチド ・ タンパク質の同定を行った。Pre エンドソーム MS のサンプルはそれぞれで LFNPA、および CMG2、60.46%、67.97% 54.15% の範囲とすべての 3 つの毒素コンポーネントからペプチドを含まれている (図 7)。ポスト エンドソームの結果、図 8に示すようにのみ含まれる LFNと PA からペプチド (57.41% と 67.79% カバレッジ、それぞれ)。ポスト エンドソーム サンプルで CMG2 の不足は、細孔形成の間に観察されるバリ nm 減少と一致しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig1.jpg"> 図 1.タンパク質複合体の解析の図式的な概観の組み立てし、EM とさんを使用してバリ バイオ センサーから分離された<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig2.jpg"> 図 2 。バイオ センサーの活性化: バリ バイオ センサーの向きの特定のアセンブリの最初のステップです。(LFN) E126C 致死因子 N 末端ドメインは、チオ リンケージの正しく指向の PApreporeバインディング インターフェイスの作成を通じてリンクされています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig3.jpg"> 図 3.炭疽菌毒素組立・ バリと分解の監視: sensogram コンポーネントを示しています振幅変更炭疽菌の特定の添加による時間の関数として毒素 LFN読み込み (手順 4 で始まるバイオ センサーに追加されます。表 1)。PApreporeは、水溶性の CMG2 受容体を添加したサーフェイスが読み込まれます。組み立て前エンドソームの複合体は、LF PAprepore- CMG2 から成っています。後期エンドソーム環境に向かって進行する全体を組み立てる機能炭疽菌毒素はバインディング、その挿入拡張膜細孔構造に移行する prepore 受容体を弱める低 pH パルス (pH 5.0) を受けます。細孔にまたがる膜の露出を確認し、ミセルの添加による可溶化します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig4.jpg"> 図 4 。CMG2 リリースのバリ sensogram: 酸性化のステップのトレースを見ると初期の増加または可能性のある大きな振幅減少続く振幅で ' スパイク' 細孔形成と受容体解離、それぞれ。縦の赤点線は新しいステップの始まりを示します。Sensograms は太字の赤の点線で配置されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig5.jpg"> 図 5 。組み立てし、EM と MS を使用してバリ バイオ センサーから分離されたタンパク質複合体の解析: バイオ センサーの接続された複合体簡単に 5 μ L の EM のネガティブ染色による可視化およびさん<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig5large.jpg" target="_blank">の同定をクリックしてください、ここに DTT を格納するバッファーの中に放出されます。この図の拡大版を表示します</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig6.jpg"> 図 6 。EM と蛋白質の複合体の可視化: Pre エンドソーム サンプル グリッド表示密度 LFNPApreporeから成るそのまま三元錯体と一貫性のある-CMG2。ポスト エンドソーム複雑なグリッド表示 PA 間隙に移行し、ない明白な CMG2 の密度とミセルに可溶化します。予測複合体 (左手側) のモデルは、示されている個々 の粒子と同じ規模です。(EM の密度のサイズに基づいて) 予測された蛋白質発色した粒子は、各パーティクルによってとおりです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig7.jpg"> 図 7 。MS タンパク質複合体の検証: Pre エンドソーム MS のサンプルはそれぞれで LFNPA、および CMG2、60.46%、67.97% 54.15% の範囲とすべての 3 つの毒素コンポーネントからペプチドを含まれています。図中の黄色、FDR の緑色で示されている 1% 以上 5% 以上の偽の発見率 (FDR) で検出されたペプチド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig8.jpg"> 図 8 。MS タンパク質複合体の検証: LFNと PA からポスト エンドソーム サンプルに含まれるペプチド (57.41% と 67.79% カバレッジ、それぞれ)、CMG2 ではないが。図中の黄色、FDR の緑色で示されている 1% 以上 5% 以上のルーズベルト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>時間 (秒)</td>
			<td>説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>最初のベースライン</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>420</td>
			<td>活性化</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>活性化</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>300</td>
			<td>LFN荷重</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>240</td>
			<td>システイン クエンチ</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>120</td>
			<td>ベースライン</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>PAprepore協会</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>30</td>
			<td>ベースライン</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>300</td>
			<td>CMG2 協会</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>30</td>
			<td>ベースライン</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>300</td>
			<td>酸の移行</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>30</td>
			<td>ベースライン</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>300</td>
			<td>ミセル協会</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.シングル ステップ回バリ実行アセンブリ炭疽菌毒素複合体。ベースラインを使用して前の手順から自由な蛋白質を洗浄および/または新しいバッファーのベースラインを確立することに注意してください。

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Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ センサー面上、大きい蛋白質の複合体は、可視化とそれぞれ電子顕微鏡や質量分析法を用いた複合体のコンポーネントの識別のために表面から解放されます。

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