Name: analyzing dynamic protein complexes assembled on and released from biolayer interferometry biosensor using mass spectrometry and electron microscopy
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy at JoVE.c

Эта работа была поддержана Мэдисон и Лила Self выпускников стипендий (Предложившем), низ 5T32GM008359 (ПТО), KUMC биомедицинских исследований учебные программы (ПТО), низ R01AI090085 (MTF), ку преодоление фондов и (Грант биомолекулы взаимодействие технологий центр (био) КТ и MTF). Авторы хотели бы поблагодарить Барбара Fegley KUMC электронной микроскопии Core за помощь с приобретением изображений ТЕА.

1. Ассамблея определенных макромолекулярных комплексов на поверхностях биосенсор Biolayer интерферометрии (BLI)
<ol><li>
Ассамблея prepore сибирской токсина комплекс на поверхности реактивной биосенсор модифицированного PDEA Амин
	<ol>
<li>Гидрат Амин реактивной второго поколения (AR2G) BLI биосенсор кончиком в 250 мкл воды за 10 минут.</li>
		<li>Программа раз шаг, перечисленные в таблице 1, на программное обеспечение, управление блоком BLI (см. Таблицу материалы).</li>
		<li>Запустите BLI, запуск, погружая кончик биосенсор в 250 мкл воды для 30 s для измерения первоначальные базовые биосенсор толщины и плотности.</li>
		<li>Активируйте биосенсор, погружая кончик в 250 мкл 50 мм NHS (N-оксисукцинимидного) и 200 мм EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) за 7 минут.</li>
		<li>Погружать активированные биосенсор в 50 мм PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine), растворенных в 0,1 М Борат буфере (рН 8,5) за 5 минут, чтобы создать активированные тиоловых реактивной поверхности.</li>
		<li>Погрузите активированные тиоловых реактивной биосенсор в 250 мкл раствора, содержащего 100 Нм E126C LFN 10 мм натрия ацетата рН 5,0, 100 мм NaCl, буфер на 5 минут.</li>
		<li>Погрузите кончик LFN в 50 мм L-цистеина, 1 M NaCl, ацетат натрия 0,1 М, pH 5,0, 4 минут, чтобы утолить любые оставшиеся реактивных свободных тиоловых реактивной групп.</li>
		<li>Погрузите кончик закаленном LFN в 50 мм трис, 50 NaCl для 2 минут для создания базового буфера.</li>
		<li>Погрузите кончик закаленном LFN в 0,5 мкм защитные антигена prepore (ПА-prepore), 50 мм трис, 50 NaCl на 5 минут для создания LFN-PAprepore комплекс.</li>
		<li>Однажды связан ПАprepore , удалите наконечник из ПАprepore решения и погрузите кончик в 50 мм трис, 50 NaCl на 30 секунд смыть любых-специфически связанные ПАprepore.</li>
		<li>Погрузите LFN-PAprepore в 0,5 мкм CMG2 рецептор (без трансмембранных доменов), 50 мм трис, 50 NaCl, за 5 минут.</li>
		<li>Погрузите LFN-PAprepore -CMG2 комплекс в 50 мм трис, 50 мм NaCl на 30 секунд чтобы смыть любых несвязанных CMG2 комплекс формы pre-от англ.</li>
		<li>Для анализа EM, выпуска LFN-PAprepore-CMG2 комплекс от кончика биосенсор, погружая кончик в 5 мкл 50 мм DTT, 50 Tris, 50 мм NaCl, внутри ПЦР-пробирку.</li>
		<li>Для анализа MS в тандеме пептидов из комплекса, выпуска LFN-PAprepore-CMG2 комплекс от кончика биосенсор, погружая биосенсор в 5 мкл 50 мм DTT, 6 M GuHCl (кератин бесплатно), 25 мм бикарбонат аммония рН 8,0 внутри PCR трубки . Это выполняется на различных биосенсор чем той, которая используется для анализа EM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ассамблея поры сибирской токсина комплекс на PDEA-модифицированные Амин реактивной биосенсор поверхности
	<ol>
<li>Чтобы просмотреть комплекс после перехода рН, выполните шаги 1.1.1-1.1.12 в предыдущем разделе для создания LFN-PAprepore-CMG2 комплекс.</li>
		<li>Погрузите кончик биосенсор в 10 мм ацетат pH 5,0 за 5 минут, чтобы начать переход ПАprepore ПАпоры перехода. Этот переход обозначается увеличения амплитуды (примерно 0,2 Нм) следуют большие амплитуды спад, что предположил быть существенной или полной рецептор диссоциации из-за уменьшилась сродство.</li>
		<li>Погружайте LFN-PAпоры кончиком в 50 мм трис, 50 мм NaCl, рН 8,0, 30 секунд смыть кислой буфера.</li>
		<li>Для анализа образца EM погрузиться кончик биосенсор раствор, содержащий мицеллы 1,25 мм (2,5 мм MSP1D1, 25 мм Na холат, 162.5 POPC) на 5 минут для предотвращения агрегации в растворе после выхода дисульфида.</li>
		<li>Для анализа EM отпустите LFN-PAпоры -комплекс от кончика биосенсор мицеллы, погружая кончик в 5 мкл 50 мм DTT, 50 Tris, 50 мм NaCl внутри ПЦР-пробирку.</li>
		<li>Для анализа MS тандем пептидов из комплекса, выпуска LFN-PApoore комплекс (не мицеллы) от биосенсор наконечник, погружая биосенсор в 5 мкл 50 мм DTT, 6 M GuHCl (кератин бесплатно), 25 мм бикарбонат аммония рН 8,0 внутри PCR трубка. Это выполняется на различных биосенсор чем той, которая используется для анализа EM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Визуализация и проверка выпустила макромолекулярных сборки от BLI биодатчики, негативные пятно электронной микроскопии
<ol><li>Тлеющим разрядом углерода покрытием сетки Cu 300. Типичный свечение разряда параметры являются 0.38 мбар стабильной атмосферы давления, негативные 15 мА, 20 секунд, затем продувки воздухом.</li>
	<li>Закрепите сетку между чистые пинцет.</li>
	<li>Пипетка 4 мкл выпустила сложных образца в ПЦР-пробирку на сетке и позволяют адсорбции для 60-х годов.</li>
	<li>Фитиль прочь оставшихся жидкость с клином фильтровальной бумаги.</li>
	<li>Пятно сетки путем дозирования 5 мкл 0,75% 0,02 мкм фильтруют уранила Формиат и влагу от избыточного пятно через 5 секунд. Разрешить сетке высохнуть при комнатной температуре.</li>
	<li>Просмотр цветного образца сеток с использованием просвечивающий электронный микроскоп.</li>
</ol>3. определение комплекса полной Pre-от англ сибирской токсин (LFN-Paprepore-CMG2) и перешли комплекс (LFN-Paпоры без CMG2) с помощью масс-спектрометрии.
<ol><li>Разбавить выпустила образцов до 20 мкл и инкубировать 1 час.</li>
	<li>2 мкл 55 мм iodoacetamide, бикарбонат аммония 25 мм, pH 8.0 и инкубировать 1 час при комнатной температуре в темноте (покрытые алюминиевой фольги).</li>
	<li>Разбавьте образца с 100 мкл 25 мм бикарбонат аммония, рН 8,0, чтобы уменьшить Гуанидин гидрохлорид концентрации ниже 1 М.</li>
	<li>5 мкл секвенирования трипсина изменен класс на 20 нг/мкл и инкубировать и при 37 ° C на ночь.</li>
	<li>Добавьте уксусной кислоты кристаллизированной до конечной концентрации 5% для снижения pH для < 3, затем уменьшить объем до 10 мкл в вакуумной концентратор.</li>
	<li>Передаче раствор пептидов образца пластины на автоматический пробоотборник nLC 1200 uHPLC.</li>
	<li>Загрузка 5 мкл, пептид раствор на столбец обратной фазы uHPLC монтируется на сцене ионизации MS.</li>
	<li>Промойте колонку с 15 мкл 0,1% муравьиной кислоты с максимальной скоростью 5 мкгЛ/мин и/или максимальное давление 800 psi.</li>
	<li>Элюировать пептиды из столбца C18 обратная фаза со скоростью потока 350 нл/мин в течение 90 минут, используя линейный градиент от 5% до 40% растворителя B в A + B (растворителей A: 0,1% муравьиной кислоты; растворителя B: 95% ацетонитриле с 0.1% муравьиной кислоты).</li>
	<li>Анализируйте элюирующие пептидов на линии с помощью тандем МС.<ol>
<li>Задайте источник ионизации 2500 Вольт и ионного переноса температура до 250 ° C.</li>
		<li>Действуют масс-спектрометр под автоматического управления непрерывно один MS проверки следуют столько тандем MSMS максимально в течение 3 s, используя CID и энергию нормализованных столкновения, 35.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Идентифицировать пептида и белковые компоненты, с помощью стандартных методов. Для этой работы были выполнены два набора анализа пептидов и белков.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphenation+of+surface+plasmon+resonance+imaging+to+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+by+on-chip+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry+analysis.">Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis.</a> Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).</li><li>Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+patterned+biochips+for+on-chip+immuno-MALDI-TOF+MS:+SPR+imaging+coupled+multi-protein+MS+analysis.">Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis.</a> The Analyst. 137, 386-392 (2012).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).</li><li>Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+kinetics+of+the+pH-driven+transition+of+the+anthrax+toxin+prepore+to+the+pore+by+biolayer+interferometry+and+surface+plasmon+resonance.">Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. , (2013).</li><li>Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+anthrax+toxin+pore:+Lethal-factor+complexes+into+lipid+nanodiscs.">Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs.</a> Protein Science. 22, 492-501 (2013).</li><li>Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+periplasmic+production+of+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+Pseudomonas+fluorescens.">Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens.</a> Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).</li><li>Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABRF-MIRG+benchmark+study:+Molecular+interactions+in+a+three-component+system.">ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system.</a> Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).</li><li>Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+biological+characterisation+of+a+sensor+surface+for+bioprocess+monitoring.">Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).</li><li>Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+unfolding+of+anthrax+lethal+factor+by+protective+antigen+oligomers.">Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. , 171-184 (2015).</li><li>Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+structurally+altered+and+aggregated+states+of+therapeutically+relevant+proteins+using+GroEL+coupled+to+bio-layer+interferometry.">Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry.</a> Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).</li><li>Bandyopadhyay, A., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminoboronate-based+peptide+cyclization+that+responds+to+pH,+oxidation,+and+small+molecule+modulators.">Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).</li><li>Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+occlusion+of+both+cavities+of+the+eukaryotic+chaperonin+with+antibody+has+no+effect+upon+the+rates+of+beta-actin+or+alpha-tubulin+folding.">Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).</li><li>Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Tomography:+A+Three-Dimensional+Analytic+Tool+for+Hard+and+Soft+Materials+Research.">Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research.</a> Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).</li></ol>

Нет информации в настоящее время.

Выявление и понимание специфики регулирующих белка комплекс Ассамблеи в естественных условиях имеет крайнюю заинтересованность для биохимических исследователей. Большие гетерогенных белков сборки являются скорее нормой, чем исключением. Это понятие поддерживается спектральные наблюдения в vivo Ассамблеи, изолируя комплексов с использованием мягче клеточные нарушения технологии, оценки продуктов из методов на основе сродства очищения и визуализации их с высоким разрешением криогенных электронной микроскопии (крио EM). Чтобы понять управления Ассамблея специфичности в ячейке, исследователи должны регулярно изолировать, идентифицировать и в конечном итоге характеризуют эти динамические структуры, монтаж/демонтаж. Наиболее активно используемых молекулярной инструмент для идентификации компонентов этих собраний часто требует на основе антитело иммунопреципитации, которая опирается на поддержании комплекс стабильности во время разрушения клеток. Различные сочетании аналитических методов недавно были разработаны для захвата комплексы из образцов клеток, используя microfluidic на основе подходов, таких как поверхностного плазмон резонанс (СРП). После удаления с поверхностей СРП эти образцы были проанализированы при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF)1,2. Продвижение этой методологии с использованием легче протоколов позволит исследователям для визуализации и проверки прогнозируемых комплексы, которые происходят в клеточной среде. Так как СРП на основе микрофлюидика системы, от совокупного образования часто возникают проблемы. Обход этой проблемы требует разбавления образца, которая в свою очередь, может уменьшить целостности концентрация ответственности биологических комплексов.
Относительно недавнее продвижение в лейбл свободной технологии является развитие системы интерферометрии (BLI) biolayer3. Эти конкретного отражения на основе света которые системы репликации, или лучший подражать, SPR привязки и кинетические результаты на долю стоимости3,4 особенно если один канал единицы используются. BLI измеряет изменения в структурах отражение световых помех между эталонный слой (контроль) и biolayer поверхности (экспериментальная). Результирующее изменение фазы измеряется в режиме реального времени как кинетическая и количественной индикации5. Биосенсор поверхности, содержащий конкретные иммобилизации химия, физически переносится между решениями, в отличие от изменения буфера microfluidic подходы в СРП, для измерения через волны фазы прогибов. Эффекты массообмена предотвращаются путем агитировать решение. В отличие от СРП эти системы являются весьма полезными в оценке комплексов из сырой биологических образцов. Физический параметр измеряется в ходе экспериментов BLI главным образом зависит от изменения в масса или толщина на поверхности биосенсор, которая является результатом сложных Ассамблеи белка или разборки.
Эти волокна оптические биодатчики, удобный и сравнительно недорогой. Один из новых полезных аспектов BLI является поверхностным удаление вновь собрал белковых комплексов от поверхности. Недавнее применение этого метода позволило нашей лаборатории наблюдать реального времени кинетика больших масштабах рН индуцированной перегруппировки структуры белка компонента защитные антигена (PA) токсинов сибирской язвы, как prepore (preporeПА) перешли к его поры (ПАпоры) формы. Этот переход на кончик биосенсор была проверена с помощью электронной микроскопии (EM)6. Удаление комплексов от биосенсор поверхностей позволяет избежать большего объема разрежения эффекты часто встречающихся при освобождении комплексы от чип поверхностей при использовании микрофлюидика систем.
В текущей работе сибирской язвы токсин комплексы собираются и разобраны на поверхности биосенсор и затем выпустили в микролитр томов. Результате сложных компонентов проверяются ортогонально с помощью EM и масс-спектрометрия (МС).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>BR100058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL black microtubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688304-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 50 &#956;m x 150mm, C18, 2 &#956;m, 100 &#197;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>164561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A38SL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips</td>
			<td>Forte Bio</td>
			<td>18-5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anotop 10 syringe filter, 0.02um</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>6809-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz System</td>
			<td>Pall Forte Bio</td>
			<td>45-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Morphogenic Gene-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon coated Cu 300 grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-CU-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>DTT25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acids</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>0129-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GuHCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>MP-BioMedicals,LLC</td>
			<td>100-351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cystiene hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C121800-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethal Factor N-terminal domain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS software version 2.2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>090M14531V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco easiGlow glow discharge cleaning system</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>91000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective Antigen prepore</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protein produced and purified in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-795C 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequest HT search engine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP334-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl formate (UF)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>OPTON-30487</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing dynamic protein complexes assembled on and released from biolayer interferometry biosensor using mass spectrometry and electron microscopy

В естественных условиях, белки часто являются частью больших макромолекулярных комплексов, где привязка специфичность и динамика в конечном итоге диктовать функциональных мероприятий. В этой работе pre-от англ сибирской язвы токсин является собраны и перешли в от комплекса англ. Во-первых N-концевой домен хвоща мутант смертоносных фактора (NLF) прилагается к biolayer интерферометрии (BLI) биосенсор через дисульфида, муфты в оптимальной ориентации, позволяя защитные антигена (PA) prepore для привязки (Kd 1 Нм). Оптимально ориентированы LFN-PAprepore комплекс затем связывает растворимых капиллярного морфообразующих гена-2 (CMG2) клеток поверхности рецептор (Kd 170 м), что привело в комплексе представитель сибирской pre-от англ, стабильной при pH 7.5. Затем этот собранный комплекс подвергается подкисления (рН 5,0) представитель позднего endosome среды перехода ПАprepore в состояние поры мембраны вставлены. Это ПАпоры состояние приводит к ослабленной привязку между CMG2 рецептор и LFN-PA,поры и существенной диссоциации CMG2 от перехода поры. Тио вложение LFN биосенсор поверхность легко обратить вспять Дитиотреитол. Сокращение на поверхности биосенсор BLI выпускает LFN-PAprepore-CMG2 троичного комплекс или кислоты перешли LFN-PAпоры комплексов в микролитр томов. Выпущенные комплексы затем визуализируется и определены с помощью электронной микроскопии и масс-спектрометрии. Эти эксперименты демонстрируют, как кинетические сборки/разборки конкретных белковых комплексов с помощью метки бесплатно BLI методологий мониторинга и оценки структуры и личность этих BLI собрал комплексов электронной микроскопии и масса спектрометрия, соответственно, с помощью легко реплицировать последовательных процедур.

Способность отслеживать и проверять Ассамблея крупных макромолекулярных комплексов является важным шагом на пути к пониманию специфики и функциональность биомолекулярных больших сборок. Результаты методов, представленных в настоящем документе продемонстрировать легкость, с которой крупных белковых комплексов (> 150 кДа массы) может быть смонтирован с помощью biolayer интерферометрии, все время мониторинга кинетики и амплитуда Ассамблеи. Уникальный компактный характер поверхности биосенсор позволяет Ассамблее анализ будет продлен, выпустив собрал комплексов в небольших микрообъемах. Эти микрообъемах может использоваться для визуализации начальной физической структуры комплексов, используя EM и проверить личность сложных компонентов, используя MS. Схематический обзор весь этот процесс показан на рисунке 1.
Ключевым элементом для успешной сборки и проверки макромолекулярных комплекса на поверхности биосенсор включает в себя правильную ориентацию начального белка. Это гарантирует, что сайты взаимодействия протеин протеина являются доступными, не труднодоступных заблокированных и оптимально позиционированные от поверхности биодатчик. Как показано на рисунке 2, правильной ориентации сибирской язвы токсин комплекс достигается с помощью специально инженерии N-терминальный фрагмент смертоносных фактор (NLF) так всегда размещается сайт связыванияprepore LFN-PA противоположностью биосенсор ковалентных вложения сайт6,7. Последующее накопление комплекса с привязкой ПА для LFN BLI биосенсор следуют растворимых CMG2 привязки ПА в конечном итоге создает токсин компетентным сибирской транслокации комплекса.
BLI sensogram след-реального времени читать из амплитуда изменения, обусловленные конкретными добавлением компонентов токсинов сибирской язвы, как они добавляются на биодатчик. Рисунок 3 показывает, представитель трассировки в паре с моделью комплекса предсказал форму на этом этапе в процессе. Первый подъем-LFN загрузки на кончик. После закалки и базовых, ПАprepore затем связывается с LFN с последующим добавлением растворимых рецепторов CMG2 результате комплекс собран pre-от англ. LFN-PAprepore-CMG2. Чтобы продвинуться к конце endosome окружающей среды, весь комплекс подвергается низкого pH импульса (рН 5,0), что ослабляет рецептор привязки, позволяющие prepore переход к ее конформации поры расширенные мембраны вставлены. 6 Sensogram следы подкисления шага показаны на рисунке 4. Первоначальное увеличение или «Спайк» в амплитуде, вероятно, расширение пор6 , что должно произойти до снижения связывания рецептора CMG2. Больше снижение амплитуды является скорее рецептор существенной или полной диссоциации благодаря снижению сродство. Предыдущие работы в этой лаборатории сообщили, что CMG2 привязки в полностью выдвинутом ПА,поры незначительна по сравнению с CMG2-ПАprepore взаимодействия6. Кроме того, sensogram кинетическая трассировки, наблюдается в всех sensograms LFN-PAprepore-CMG2 переходы к LFN-PAпоры с падение РН, воспроизводимых через несколько запусков.
До и после подкисления придает биосенсор комплексы легко выпускаются для визуализации на негативные пятно EM и идентификации мс (рис. 5). Представитель комплексы от EM результаты показаны на рисунке 6. Pre-от англ образца сетках, показать плотность согласуется с нетронутыми тройных комплексов, состоящих из LFN-PAprepore-CMG2. После подкисления сложные сетки, показать ПА перешла на поры и солюбилизирован путем включения мицеллы с не очевидно плотность CMG2.
Тождества пред и после подкисления комплексы были проверены МС. База данных где последовательности ПА, P13423; LFN, P15917; и CMG2, P58335 были включены в фоне белков мыши базы данных, полученных из репозитория NCBInr. От этой первой базы данных поиска, с охватом следующих аминокислоты для тройных и бинарные комплексов были получены только протеинов интереса: 54% и 22% для ПА, 36% и 6% для LF и 43% для CMG2, соответственно (CMG2 не был обнаружен на бинарные комплекс). В целях максимального охвата аминокислоты белка, второй идентификация пептидов/белков выполнялось с помощью белка базы данных, содержащей только три протеинов интереса. Pre-от англ MS образцы содержится пептидов из всех трех токсин компонентов с 60,46%, 67.97% и 54,15% покрытия для LFN, ПА и CMG2, соответственно (рис. 7). Результаты пост-от англ, показанный на рисунке 8, содержал только пептидов из LFN и ПА (57.41% и 67,79% охвата, соответственно). Отсутствие CMG2 в образцах пост-от англ, согласуются с Наблюдаемое уменьшение Нм BLI во время порообразования.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig1.jpg"> Рис. 1. Схематический обзор для анализа белковых комплексов собрал на и изолированы от BLI биосенсора с использованием EM и г-жа <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig2.jpg"> Рисунок 2. Биосенсор активации: первый шаг в Ассамблее конкретной ориентации на BLI биодатчик. Домен E126C смертельной фактор N-терминала, (NLF) связан через Тио связь, создание должным образом ориентированные ПАprepore привязки интерфейса. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig3.jpg"> Рис. 3. Мониторинг сибирской токсин сборки и разборки с BLI: sensogram показывает изменения амплитуды как функция времени из-за конкретных добавлением сибирской язвы токсин компоненты, как они добавляются на биосенсор, начиная с LFN загрузки (шаг 4 в Таблица 1). ПАprepore затем загружены на поверхности, с последующим добавлением растворимых рецепторов CMG2. Собрал pre-от англ. комплекс состоит из LF-PAprepore- CMG2. Продвигаться к конце endosome среды, весь собрать функциональных сибирской токсин подвергается низкого pH импульса (рН 5,0), что ослабляет рецептор привязки, позволяющие prepore переход к ее конформации поры расширенные мембраны вставлены. Воздействия, охватывающих поры мембраны подтвердил и солюбилизирован путем добавления мицеллы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig4.jpg"> Рисунок 4. BLI sensogram CMG2 выпуска: следы подкисления шаг показывают увеличение первоначального или «шип» в амплитуде следуют больше снижение амплитуды, которые скорее всего поры формирования и рецептор диссоциации, соответственно. Вертикальные пунктирные красные линии обозначают начало нового шага. Sensograms совмещаются на полужирный красный пунктир. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig5.jpg"> Рисунок 5. Анализ комплексов протеина собрал на и изолированы от BLI биосенсора с использованием EM и MS: биосенсор прилагаемый комплексы легко попадают в 5 мкл буфера, содержащий DTT визуализация негативные пятно EM и идентификации, г-жа <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig5large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь для Увеличенная версия этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig6.jpg"> Рисунок 6. Визуализация белковых комплексов с EM: Pre-от англ образца сетках, показать плотность согласуется с нетронутыми тройных комплексов, состоящих из LFN-PAprepore-CMG2. Пост-от англ. сложные сетки, показать ПА перешла на поры и солюбилизирован мицеллы с не очевидно плотность CMG2. Модели прогнозируемого комплексов (левой) находятся на той же шкале, как отдельные частицы показано. Частицы, раскрашенная с прогнозируемым белка (на основании размера EM плотности) показаны ниже каждой частицы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig7.jpg"> Рисунок 7. Проверка белковых комплексов с MS: Pre-от англ MS образцы содержится пептидов из всех трех токсин компонентов с 60,46%, 67.97% и 54,15% покрытия для LFN, ПА и CMG2, соответственно. Пептиды, обнаружены со скоростью ложных обнаружения (ФДР) равна или превышает 5%, показанными желтым, ФДР равна или превышает 1%, показано зеленым цветом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig8.jpg"> Рисунок 8. Проверка белковых комплексов с MS: пост-от англ содержатся образцы пептиды от LFN и ПА (57.41% и 67,79% охвата, соответственно), но не CMG2. Рузвельт, равна или превышает 5%, показанными желтым, ФДР равна или превышает 1%, показано зеленым цветом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Шаг</td>
			<td>Время (ов)</td>
			<td>Описание</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>Первоначальные базовые</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>420</td>
			<td>Активация</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>Активация</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>300</td>
			<td>LFN загрузки</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>240</td>
			<td>Закалочная хвоща</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>120</td>
			<td>Базовый</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>ПАprepore Ассоциация</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>30</td>
			<td>Базовый</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>300</td>
			<td>CMG2 Ассоциация</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>30</td>
			<td>Базовый</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>300</td>
			<td>Кислотные переход</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>30</td>
			<td>Базовый</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>300</td>
			<td>Мицеллы Ассоциация</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Шаг раз для сингла BLI запустить для Ассамблеи сибирской токсин комплекс. Обратите внимание, что базовые показатели используются для смыть несвязанных белка из предыдущего шага и/или создание нового базового буфера.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy at JoVE.c

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Здесь мы представляем протокол осуществлять монтаж и демонтаж токсинов сибирской язвы, с помощью biolayer интерферометрии (BLI). После сборки/разборки на поверхности биосенсор крупных белковых комплексов освобождаются от поверхности для визуализации и идентификации компонентов комплексов с помощью электронной микроскопии и масс-спектрометрии, соответственно.

Анализ динамических белковых комплексов монтируется на и освобождены от Biolayer интерферометрии биосенсора с использованием масс-спектрометрии и электронной микроскопии

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Определение Hsp33 в редокс регулируемых Chaperone активность и сопоставления конформационные изменения на Hsp33 с использованием водорода дейтерия обмен масс-спектрометрия

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...