Name: a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue at JoVE.com

Les auteurs tiennent à souligner le soutien institutionnel de LSU Health Sciences Center, qui a financé le projet.

Toutes les tâches ont été effectuées dans le respect des protocoles 8759 # et #9189, tel qu’approuvé par le Bureau de la CISR de LSUHSC-NO. Tous les animaux travaux ont été réalisés dans le respect du protocole #3285 approuvées par le Bureau de IACUC participant-no
1. ensemencement d’intercaler les feuilles de la cellule
Remarque : Voir la Figure 1.
<ol><li>ADSCs de semences à environ 80 % de confluence en plaques de c...

<ol>
	<li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medical+costs+of+obesity:+An+instrumental+variables+approach.">The medical costs of obesity: An instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li><li>Pi-Sunyer, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medical+Risks+of+Obesity.">The Medical Risks of Obesity.</a> Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).</li><li>Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+in+vitro.">Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro.</a> Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+unilocular+fat+cells:+characteristics+of+growth+in+vitro+and+changes+in+differentiation+properties.">Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.</a> Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilocular+fat+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture.">Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).</li><li>Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+cell+culture+of+freshly+isolated+adipocytes+using+extracellular+basement+membrane+components.">Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components.</a> The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).</li><li>Fried, S. K., Kral, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+regional+distribution+of+fat+cell+size+and+lipoprotein+lipase+activity+in+morbidly+obese+patients.">Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients.</a> International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).</li><li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Institutes+of+Health.+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline.">The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).</li><li>Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+and+potential+roles+of+microphysiological+systems+in+biology+and+medicine.">The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).</li><li>. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html">https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html</a> (2017)</li><li>Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwiched+White+Adipose+Tissue:+A+Microphysiological+System+of+Primary+Human+Adipose+Tissue.">Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).</li><li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+'smart'+polymers.">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).</li><li>Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo-responsive+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+onto+microtextured+poly(dimethylsiloxane)+for+aligned+cell+sheet+engineering.">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li><li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering:+Construction+of+a+Multicellular+3D+Scaffold+for+the+Delivery+of+Layered+Cell+Sheets.">Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).</li><li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+Isolation,+expansion+and+differentiation.">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li><li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion/detachment+control.">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li><li>Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+lipase+regulation+by+insulin+and+glucocorticoid+in+subcutaneous+and+omental+adipose+tissues+of+obese+women+and+men.">Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).</li><li>Keipert, S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brite/beige+fat+and+UCP1+-+is+it+thermogenesis?.">Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).</li></ol>

Ce protocole détaille l’utilisation de ADSCs pour "sandwich" humain le tissu adipeux blanc ; lignées de cellules humaines ADSC peuvent être isolées par l’intermédiaire des protocoles bien établis,15. Toutefois, le système peut être adapté pour les besoins de recherche individualisée (comme l’utilisation de cellules 3T3L-1 pour la souris "sandwich" WAT). Ce processus implique la manipulation des tissus humains primaires. Les précautions standard devraient être utilisées ; manip...

Le tissu adipeux est le principal organe de l’obésité, qui transporte les coûts médicaux annuels directs entre $ 147 milliards et $ 210 milliards dans l’US1. L’accumulation de tissu adipeux contribue également à d’autres causes principales de décès comme les maladies cardiaques, diabète de type II et certains types de cancer2. Modèles de culture in vitro sont essentiels pour les études du métabolisme et le développement de médicaments, mais les modèles actuels de recherche du tissu adipeux ont des lacunes majeures. Les adipocytes sont fragiles, flottant et différencient en phase terminale des cellules qui ne peut pas adhérer aux plastiques de culture cellulaire et par conséquent ne peuvent pas être cultivées à l’aide de méthodes de culture cellulaire conventionnel. Depuis les années 1970, plusieurs méthodes ont été utilisés dans les tentatives pour surmonter ces obstacles, y compris l’utilisation de lamelles de verre, plafond culture, culture en suspension et matrices extracellulaires3,4,5, 6 , 7. Toutefois, ces méthodes ont été marquées par la mort cellulaire et la dédifférenciation, et ils sont généralement utilisés pour pas plus d’une période d’étude de deux semaines. En outre, ces modèles ne pas récapituler le microenvironnement adipeux natif car ils ne conservent pas l’ECM intact, les interactions entre les adipocytes et stromales soutiennent les cellules, ni les cellules contractiles forces exercent les uns des autres en in vivo WAT.
En l’absence d’une méthode de culture de tissu adipeux primaire étalon-or, recherche adipeuse s’est appuyé principalement sur les pré-adipocytes différenciés (diffAds). DiffAds sont multiloculaire, adhérente et métaboliquement actives. En revanche, les adipocytes blancs primaires sont uniloculaires, non adhérentes et démontrent métabolisme relativement faible. L’échec des modèles actuels de culture de tissu adipeux à récapituler la physiologie des tissus sains d’adipeux mature est probablement un facteur important en l’absence de médicaments approuvés par la FDA qui ciblent directement les adipocytes. En fait, le manque de modèles d’organe physiologique in vitro est un problème majeur dans la plupart des organes et des maladies.
Dans son document annonçant la création de son programme de Microphysiological Systems (MPS), le National Institutes of Health (NIH) ont indiqué que le taux de réussite de 2013 à travers tous les essais cliniques pharmaceutiques humains était seulement 18 % pour la phase II et 50 % pour la phase III essais cliniques8. Le programme MPS est conçu pour traiter directement de l’incapacité de in vitro de la monoculture de la physiologie humaine modèle. Le NIH définit MPSs comme les systèmes de culture composés des humains primaires ou de cellules souches dans des constructions 3D multicellulaires qui récapitulent le fonctionnement des organes. Contrairement aux modèles réductionnistes de cultures de cellules immortalisées, homogène, MPSs devraient modeler exactement cellules, cellules drogue, médicamenteuses et orgue-drug interactions9. À la différence des méthodes de culture primaire à court terme, normes NIH dictent durabilité MPS pendant 4 semaines dans la culture8. On trouvera plus de détails sur le programme MPS à la NIH ad (#RFA-TR-18-001)10.
Nous avons développé un roman simple, adaptable, et peu coûteux MPS adipeuse appelé « en sandwich le tissu adipeux blanc » (SWAT)11. Nous avons surmonté la flottabilité naturelle des adipocytes en « sandwich » haché primaire tissu adipeux entre les feuilles des cellules stromales dérivées d’adipeux (ADSCs) (Figure 1). La construction 3D résultante récapitule le contact de cellule-cellule et le microenvironnement adipeux natif en entourant les adipocytes matures avec une population de cellules de soutien naturel adipocyte. SWAT a été validé en démontrant la viabilité de 8 semaines, réponse à exogène de signalisation, sécrétion adipokine et greffe dans un modèle animal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:219px;">10x HBSS</td>
			<td style="width:92px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:115px;">14185052</td>
			<td style="width:393px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M199 Media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11043023</td>
			<td>Phenol red-free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250&#181;m Mesh Filter</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2&#181;m Syringe Filter</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5mL Luer-Lok syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;">Metal Washers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heated Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Incubated Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10020-988</td>
			<td style="width:393px;">Samples should be pitched at 45&#176; angle to facilitate collagenase digestion</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">Set to 37-40&#176;C and placed under Biosafety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">Set to ~75&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Specialized Plastics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;">Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>174902&#160; or 174901</td>
			<td style="width:393px;">These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: &#60;6cm for 6cm dish, &#60;3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;">Plastic Plunger Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue

Le tissu adipeux blanc (WAT) joue un rôle crucial dans la régulation du poids et tous les jours de la santé. Néanmoins, il y a des limites importantes aux modèles disponibles culture primaire, qui n’ont pas fidèlement récapituler le microenvironnement adipeux ou prolonger la viabilité WAT au-delà de deux semaines. L’absence d’un modèle de culture primaire fiable entrave gravement recherche dans WAT du métabolisme et du développement des médicaments. À cette fin, nous avons utilisé des normes NIH d’un système de microphysiologic pour développer une nouvelle plate-forme pour la culture primaire de WAT appelée « SWAT » (sandwich le tissu adipeux blanc). Nous surmontons la flottabilité naturelle des adipocytes en intercalant hachées WAT grappes entre feuilles de cellules stromales dérivées d’adipeux. Dans cette construction, les échantillons WAT sont viables sur huit semaines de culture. SWAT maintient l’ECM intact, contacts cellule-cellule et les pressions physiques in vivo le conditions de WAT ; en outre, SWAT maintient un profil transcriptionnel robuste, sensibilité à la signalisation chimique exogène et fonction de tissus entiers. SWAT représente une méthode simple, reproductible et efficace de culture de tissu adipeuse primaire. Potentiellement, c’est une plateforme largement applicable pour la recherche en physiologie, physiopathologie, métabolisme et développement pharmaceutique WAT.

Viabilité de SWAT a été initialement évaluée par imagerie série fond clair de clusters individuels de WAT (n = 12) au cours des semaines environ 7,6. Les clusters est resté sécurisés en place sur la monocouche pendant tout ce temps. Légers changements morphologiques ont été observés avec les adipocytes individuels se déformant légèrement ou le déplacement des postes. Toutefois, les adipocytes ni devient multiloculaires au fil du temps, ce qui indique une absence de dédif...

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A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Le tissu adipeux blanc (WAT) a des lacunes critiques dans ses modèles actuels de la culture primaire, qui entravent le développement pharmacologique et études métaboliques. Nous présentons ici un protocole visant à produire un système adipeux microphysiological par WAT intercaler entre deux feuilles de cellules stromales. Cette construction fournit une plateforme stable et adaptable pour la culture primaire de WAT.

Une plate-forme de Microphysiologic pour la graisse humaine : en sandwich le tissu adipeux blanc

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