Name: a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00
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Os autores gostaria de reconhecer o apoio institucional fornecido pelo centro de Ciências da saúde da LSU, que financiou o projeto.

Todas as tarefas foram realizadas em conformidade com os protocolos #8759 e #9189, aprovado pelo IRB escritório de LSUHSC-NO. Todo o trabalho animal foi realizado na adesão ao protocolo #3285 aprovado pelo Instituto IACUC no LSUHSC-n. º
1. semeadura de imprensa folhas de célula
Nota: Consulte a Figura 1.
<ol><li>Sementes ADSCs em aproximadamente 80% de confluência em placas de cultura de tecidos (6 cm ou placas boas 6). Para cada...

<ol>
	<li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medical+costs+of+obesity:+An+instrumental+variables+approach.">The medical costs of obesity: An instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li><li>Pi-Sunyer, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medical+Risks+of+Obesity.">The Medical Risks of Obesity.</a> Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).</li><li>Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+in+vitro.">Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro.</a> Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+unilocular+fat+cells:+characteristics+of+growth+in+vitro+and+changes+in+differentiation+properties.">Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.</a> Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilocular+fat+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture.">Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).</li><li>Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+cell+culture+of+freshly+isolated+adipocytes+using+extracellular+basement+membrane+components.">Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components.</a> The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).</li><li>Fried, S. K., Kral, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+regional+distribution+of+fat+cell+size+and+lipoprotein+lipase+activity+in+morbidly+obese+patients.">Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients.</a> International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).</li><li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Institutes+of+Health.+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline.">The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).</li><li>Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+and+potential+roles+of+microphysiological+systems+in+biology+and+medicine.">The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).</li><li>. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html">https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html</a> (2017)</li><li>Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwiched+White+Adipose+Tissue:+A+Microphysiological+System+of+Primary+Human+Adipose+Tissue.">Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).</li><li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+'smart'+polymers.">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).</li><li>Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo-responsive+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+onto+microtextured+poly(dimethylsiloxane)+for+aligned+cell+sheet+engineering.">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li><li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering:+Construction+of+a+Multicellular+3D+Scaffold+for+the+Delivery+of+Layered+Cell+Sheets.">Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).</li><li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+Isolation,+expansion+and+differentiation.">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li><li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion/detachment+control.">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li><li>Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+lipase+regulation+by+insulin+and+glucocorticoid+in+subcutaneous+and+omental+adipose+tissues+of+obese+women+and+men.">Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).</li><li>Keipert, S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brite/beige+fat+and+UCP1+-+is+it+thermogenesis?.">Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).</li></ol>

Este protocolo detalha o uso de ADSCs para sanduíche branco humana tecido adiposo; linhas de células humanas ADSC podem ser isoladas através de de protocolos bem estabelecidos15. No entanto, o sistema pode ser adaptado para as necessidades de pesquisa individualizada (como o uso de células de 3T3L-1 para mouse sanduíche WAT). Esse processo envolve manipulação de tecido humano primário. Precauções de segurança padrão devem ser empregadas; lidar com tecidos humanos como patógenos BSL-2 ...

Tecido adiposo é o principal órgão de obesidade, que acarreta custos médicos anuais directos entre US $ 147 bilhões e US $ 210 bilhões nos E.U.1. O acúmulo de tecido adiposo contribui também para outras principais causas de morte, tais como doenças cardíacas, diabetes tipo II e certos tipos de câncer2. Modelos de cultura in vitro são essenciais para estudos metabólicos e desenvolvimento de drogas, mas modelos de pesquisa atual do tecido adiposo tem grandes deficiências. Adipócitos são frágeis, flutuante e células que não aderir ao plástico de cultura de células e, portanto, não podem ser cultivadas usando métodos de cultura de células convencional terminalmente diferenciadas. Desde a década de 1970, vários métodos têm sido utilizados em tentativas para superar esses obstáculos, incluindo a utilização de lamelas de vidro, teto cultura, cultura de suspensão e matrizes extracelulares3,4,5, 6 , 7. no entanto, esses métodos foram marcados por morte celular e o quê, e são usados tipicamente para não mais do que um período de duas semanas de estudo. Além disso, estes modelos não tente recapitular o microambiente adiposa nativo, como eles não mantêm o ECM intacta, as interações entre adipócitos e do estroma apoiar as células, nem as forças contráteis células exercem uns contra os outros em in vivo WAT.
Na ausência de um método de cultura de tecido adiposo primária padrão-ouro, pesquisa adiposa dependeu principalmente pre-adipócitos diferenciados (diffAds). DiffAds são multilocular, aderentes e metabolicamente ativas. Por outro lado, primários adipócitos brancos são unilocular, de e demonstram o metabolismo relativamente baixo. O fracasso dos modelos atuais de cultura de tecido adiposo para recapitular a fisiologia do tecido adiposo maduro saudável provavelmente é um fator importante na ausência de medicamentos aprovados pela FDA que destino diretamente adipócitos. Na verdade, a falta de fisiológica em vitro modelos de órgãos é um grande problema na maioria dos órgãos e doença.
Em seu papel de posição anunciando a criação de seu programa de sistemas de Microphysiological (MPS), o National Institutes of Health (NIH) informou que a taxa de sucesso de 2013 em todos os ensaios clínicos farmacêuticas humanas foi apenas 18% para a fase II e 50% para a fase III ensaios clínicos8. O programa MPS é projetado para atender diretamente a incapacidade da monocultura em vitro de fisiologia humana de modelo. O NIH define MPSs como sistemas de cultura compostos de humana primária ou células-tronco em multicelulares construções 3D que recapitular o funcionamento do órgão. Ao contrário dos modelos reducionistas de culturas celulares homogêneos, imortalizado, MPSs com precisão devem modelo celular, droga-célula, medicamentosas e interações de droga-órgão9. Ao contrário de métodos de cultura primária a curto prazo, padrões de NIH ditam sustentabilidade MPS durante 4 semanas em cultura8. Mais detalhes do programa MPS podem ser encontrados no RFAs (#RFA-TR-18-001)10 do NIH.
Nós desenvolvemos um simples, romance, adaptável, e barato MPS adiposa denominado "imprensado tecido adiposo branco" (SWAT)11. Superamos a flutuabilidade natural dos adipócitos por "imprensar" picado principal tecido adiposo entre lençóis de células do estroma adiposo-derivado (ADSCs) (Figura 1). A construção 3D resultante recapitula o contato célula-célula e o microambiente adiposa nativo cercando adipócitos maduros, com uma população de células de suporte natural dos adipócitos. SWAT foi validada por demonstrar a viabilidade de 8 semanas, resposta a sinalização exógenos, adipokine secreção e enxertia em um modelo animal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:219px;">10x HBSS</td>
			<td style="width:92px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:115px;">14185052</td>
			<td style="width:393px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M199 Media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11043023</td>
			<td>Phenol red-free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250&#181;m Mesh Filter</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2&#181;m Syringe Filter</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5mL Luer-Lok syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;">Metal Washers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heated Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Incubated Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10020-988</td>
			<td style="width:393px;">Samples should be pitched at 45&#176; angle to facilitate collagenase digestion</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">Set to 37-40&#176;C and placed under Biosafety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">Set to ~75&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Specialized Plastics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;">Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>174902&#160; or 174901</td>
			<td style="width:393px;">These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: &#60;6cm for 6cm dish, &#60;3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;">Plastic Plunger Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue

Tecido adiposo branco (WAT) desempenha um papel crucial na regulação da saúde peso e todos os dias. Ainda assim, existem limitações significativas para modelos de cultura primária disponíveis, os quais não conseguiram fielmente recapitular o microambiente adiposa ou estender a viabilidade WAT para além de duas semanas. A falta de um modelo de cultura primária confiável severamente impede investigação em WAT metabolismo e desenvolvimento de drogas. Para tal, utilizamos padrões do NIH de um sistema de microphysiologic para desenvolver uma nova plataforma para cultura primária de WAT chamada 'SWAT' (imprensada tecido adiposo branco). Superamos a flutuabilidade natural dos adipócitos por picada WAT aglomerados entre lençóis de células do estroma adiposo-derivado de imprensa. Nessa construção, WAT amostras são viáveis em oito semanas em cultura. SWAT mantém o ECM intacta, contatos de célula para célula e pressões físicas na vivo condições WAT; Além disso, a SWAT mantém um perfil transcricional forte, sensibilidade à sinalização química exógena e função do tecido inteiro. SWAT representa um método simples, reprodutível e eficaz de cultura primária de tecido adiposo. Potencialmente, é uma plataforma amplamente aplicável para pesquisa em fisiologia, fisiopatologia, metabolismo e desenvolvimento farmacêutico WAT.

Viabilidade da SWAT foi inicialmente avaliada por serial brightfield imagem de clusters individuais de WAT (n = 12) aproximadamente 7,6 semanas. Clusters de permaneceram seguras no lugar sobre a monocamada durante todo este tempo. Ligeiras alterações morfológicas foram observadas com adipócitos individuais entortar ligeiramente ou trocando de posição. No entanto, adipócitos nem tornar-se multilocular ao longo do tempo, indicando uma falta de quê, nem fizeram eles apresentam sinais...

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A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Tecido adiposo branco (WAT) tem deficiências críticas em seus modelos de cultura primária atual, dificultando o Desenvolvimento farmacológico e estudos metabólicos. Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um sistema de microphysiological de tecido adiposo por WAT imprensar entre lençóis de células do estroma. Essa construção fornece uma plataforma estável e adaptável para a cultura primária de WAT.

Uma plataforma de Microphysiologic para gordura humana: imprensado tecido adiposo branco

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