Name: a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00
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Los autores desean reconocer el apoyo institucional de LSU Health Sciences Center, que financió el proyecto.

Todas las tareas se realizaron en adhesión a protocolos 8759 # y #9189, aprobado por la oficina de LSUHSC-NO. de IRB Animal todo el trabajo se realizó en adhesión a protocolo #3285 aprobado por la oficina de IACUC LSUHSC-NO.
1. siembra de intercalando hojas de células
Nota: Vea la figura 1.
<ol><li>Semilla ADSCs en aproximadamente 80% de confluencia en las placas de cultivo de tejidos (6 cm o placas de 6 pocillos). Para cada pocil...

<ol>
	<li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medical+costs+of+obesity:+An+instrumental+variables+approach.">The medical costs of obesity: An instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li><li>Pi-Sunyer, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medical+Risks+of+Obesity.">The Medical Risks of Obesity.</a> Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).</li><li>Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+in+vitro.">Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro.</a> Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+unilocular+fat+cells:+characteristics+of+growth+in+vitro+and+changes+in+differentiation+properties.">Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.</a> Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).</li><li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilocular+fat+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture.">Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).</li><li>Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+cell+culture+of+freshly+isolated+adipocytes+using+extracellular+basement+membrane+components.">Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components.</a> The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).</li><li>Fried, S. K., Kral, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+regional+distribution+of+fat+cell+size+and+lipoprotein+lipase+activity+in+morbidly+obese+patients.">Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients.</a> International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).</li><li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. 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NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001) Available from: <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html">https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html</a> (2017)</li><li>Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwiched+White+Adipose+Tissue:+A+Microphysiological+System+of+Primary+Human+Adipose+Tissue.">Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).</li><li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+'smart'+polymers.">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).</li><li>Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermo-responsive+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+onto+microtextured+poly(dimethylsiloxane)+for+aligned+cell+sheet+engineering.">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li><li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering:+Construction+of+a+Multicellular+3D+Scaffold+for+the+Delivery+of+Layered+Cell+Sheets.">Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).</li><li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+Isolation,+expansion+and+differentiation.">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li><li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+poly(N-isopropylacrylamide)+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion/detachment+control.">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li><li>Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+lipase+regulation+by+insulin+and+glucocorticoid+in+subcutaneous+and+omental+adipose+tissues+of+obese+women+and+men.">Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).</li><li>Keipert, S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brite/beige+fat+and+UCP1+-+is+it+thermogenesis?.">Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).</li></ol>

Este protocolo detalla el uso de ADSCs humano tejido adiposo blanco sandwich; líneas de celulares ADSC humanas pueden ser aisladas mediante protocolos bien establecidos15. Sin embargo, el sistema puede ser adaptado para los requisitos de la investigación individualizada (como el uso de las células 3T3L-1 ratón emparedado WAT). Este proceso implica el manejo primario del tejido humano. Deben emplearse precauciones de seguridad estándar; manejar los tejidos humanos como BSL-2 patógenos (p....

Tejido adiposo es el órgano principal de la obesidad, que lleva los costos médicos anuales directos entre $ 147 billones y $ 210 billones en los Estados Unidos1. La acumulación de tejido adiposo contribuye también a otras causas de muerte tales como enfermedad cardíaca, tipo diabetes II y ciertos tipos de cáncer2. Modelos de cultivo in vitro son esenciales para los estudios metabólicos y de desarrollo de fármacos, pero modelos actuales de la investigación del tejido adiposo tienen deficiencias importantes. Adipocitos son frágiles, boyante y células que no se adherirán a los plásticos de la cultura de célula y por lo tanto no pueden ser cultivadas utilizando métodos de cultivo celular convencionales terminalmente diferenciadas. Desde la década de 1970, varios métodos se han utilizado en los intentos de superar estas barreras, incluyendo el uso de cubreobjetos de vidrio, techo cultura, cultura de suspensión y matrices extracelulares3,4,5, 6 , 7. sin embargo, estos métodos han sido marcados por la muerte de la célula y diferenciación, y se suelen usar para nada más que un periodo de dos semanas de estudio. Por otra parte, estos modelos no tratan de recapitular el microambiente adiposo nativo ya no sostienen el ECM intacto, las interacciones entre los adipocitos y stromal células de apoyo, ni las fuerzas contráctiles células ejercen sobre otros en en vivo WAT.
En la ausencia de un método estándar de oro en cultivo primario adiposo, investigación adiposo ha confiado principalmente en los adipocitos pre diferenciadas (diffAds). DiffAds son multiloculares, adherente y metabólicamente activo. Por el contrario, adipocitos blancos primarios son uniloculares, nonadherent y demuestran metabolismo relativamente baja. El fracaso de los modelos actuales de cultura adiposo para recapitular la fisiología del tejido adiposo maduro sano es probablemente un factor importante en la ausencia de medicamentos aprobados por la FDA que directamente adipocitos. De hecho, la falta de modelos de órganos fisiológicos en vitro es un problema importante en la mayoría de los órganos y la enfermedad.
En su documento de posición anunciando la creación de su programa de Microphysiological Systems (MPS), los institutos nacionales de salud (NIH) informó que la tasa de éxito de 2013 a través de todos los ensayos clínicos farmacéuticos humanos era sólo 18% para la fase II y 50% para la fase III ensayos clínicos8. El programa MPS está diseñado para abordar directamente la imposibilidad de fisiología humana modelo de monocultivo en vitro . El NIH define MPSs como sistemas de cultivo conformados por primaria humano o células madre en multicelulares construcciones 3D que recapitulan el funcionamiento del órgano. A diferencia de los modelos reduccionistas de cultivos de células homogéneas, inmortalizado, MPSs deben modelar con precisión la célula, célula de drogas, fármacos y fármacos órgano interacciones9. A diferencia de los métodos de cultivo primario a corto plazo, normas NIH exigen sostenibilidad MPS durante 4 semanas en cultura8. Pueden encontrar más detalles sobre el programa MPS en los NIH AFR (#RFA-TR-18-001)10.
Hemos desarrollado una novela simple, adaptable, y MPS adiposo barato llamado "tejido adiposo blanco intercalada" (SWAT)11. Vencemos la flotabilidad natural de los adipocitos por "bocadillo" picada el principal tejido adiposo entre las hojas de células del estroma adiposo derivados (ADSCs) (figura 1). La construcción resultante 3D recapitula el contacto célula-célula y el microambiente adiposo nativo rodeando adipocitos maduros con una población de célula de soporte natural del adipocito. SWAT ha sido validado por demostrar viabilidad de 8 semanas, respuesta a la señalización, la secreción de adipoquinas y engraftment en un modelo animal exógena.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:219px;">10x HBSS</td>
			<td style="width:92px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:115px;">14185052</td>
			<td style="width:393px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenosine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M199 Media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11043023</td>
			<td>Phenol red-free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250&#181;m Mesh Filter</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2&#181;m Syringe Filter</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5mL Luer-Lok syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;">Metal Washers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heated Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Incubated Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10020-988</td>
			<td style="width:393px;">Samples should be pitched at 45&#176; angle to facilitate collagenase digestion</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">Set to 37-40&#176;C and placed under Biosafety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">Set to ~75&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Specialized Plastics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;">Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>174902&#160; or 174901</td>
			<td style="width:393px;">These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: &#60;6cm for 6cm dish, &#60;3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;">Plastic Plunger Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:393px;">These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue

Tejido adiposo blanco (WAT) desempeña un papel crucial en la regulación de la salud peso y todos los días. Sin embargo, existen importantes limitaciones a los modelos disponibles en cultivo primario, que no han podido recapitular el microambiente adiposo fielmente o extender la viabilidad WAT más de dos semanas. La falta de un modelo de cultura primaria confiable impide severamente investigación en WAT metabolismo y desarrollo de medicamentos. Para ello hemos utilizado estándares de NIH de un sistema de microphysiologic para desarrollar una nueva plataforma para cultivo primario WAT llamado 'SWAT' (tejido adiposo blanco intercalado). Vencemos la flotabilidad natural de los adipocitos intercalando picada WAT racimos entre las hojas de células estromales derivadas del adiposo. En esta construcción, WAT las muestras son viables después de ocho semanas en la cultura. SWAT mantiene el ECM intacta, contactos célula a célula y las presiones físicas de en vivo las condiciones WAT; Además, SWAT mantiene un perfil transcripcional robusto, sensibilidad a la señalización química exógena y función del tejido entero. SWAT representa un método simple, reproducible y eficaz de cultivo primario de adiposo. Potencialmente, es una plataforma ampliamente aplicable para la investigación en fisiología, Fisiopatología, metabolismo y desarrollo farmacéutico de WAT.

Inicialmente se evaluó la viabilidad de SWAT por brightfield serial proyección de imagen de los racimos individuales de WAT (n = 12) durante aproximadamente 7,6 semanas. Grupos seguía siendo seguros en lugar de la monocapa en todo este tiempo. Se observaron ligeros cambios morfológicos con adipocitos individuales combarse ligeramente o cambiar posiciones. Sin embargo, adipocitos ni ser multiloculares con el tiempo, lo que indica una falta de diferenciación, ni presentan signos visibl...

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A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Tejido adiposo blanco (WAT) tiene deficiencias importantes en sus modelos actuales de cultivo primario, que obstaculizan el desarrollo farmacológico y estudios metabólicos. Aquí, presentamos un protocolo para producir un sistema microphysiological adiposo WAT bocadillo entre las hojas de las células estromales. Esta construcción proporciona una plataforma estable y adaptable para cultivo primario de WAT.

Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco

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