Name: detecting protein subcellular localization by green fluorescence protein tagging and 4',6-diamidino-2-phenylindole staining in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-07-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans at JoVE.

As cepas de c. elegans utilizadas neste estudo foram obtidas a partir do centro de genética Caenorhabditis, que é apoiado pelo National Institutes of Health - escritório da infra-estrutura de programas de pesquisa (OD010440 P40). Este trabalho foi financiado pelo NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 Jun Liang e PSC-CUNY 66184-00 44 e 45 67248-00 a Jun Liang. Agradecemos Cathy Savage-Dunn gentilmente partilha o seu espaço de laboratório. Todas as imagens de fluorescência foram coletadas no Queens College Core Facility. Agradecemos a William J. Rice por seus comentários sobre o manuscrito.

1. soluções
<ol><li>
Placas NGM
	<ol>
<li>Em um Erlenmeyer de 2 L, adicione 3 g de NaCl, 17 g de ágar-ágar, 2,5 g de peptona e 975 mL de dH2tampa do O. a boca do balão com folha de alumínio. Autoclave o balão de 50 min. resfriá-lo por 20 a 30 min.</li>
		<li>Em seguida, adicionar soluções esterilizadas: 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol de 5 mg/mL em etanol, 1ml de 1m MgSO4e 25 mL de tampão de4 (pH 6,0) de KPO 1 M. Agite as soluções para mistu...

<ol>
	<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK.">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li><li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor/DAF-16.">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release,+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1/Fas+death.">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li><li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins:+a+20-year+stock-take.">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li><li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+(Placozoa),+an+animal+lacking+neurons+and+synapses.">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905 (2018).</li><li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+(ROS/RNS)+during+hypersensitive+cell+death.">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li><li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosynthesis+and+maturation+in+the+ER.">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li><li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308 (2017).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+microinjection.">Transformation and microinjection.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li><li>Yochem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomarski+images+for+learning+the+anatomy,+with+tips+for+mosaic+analysis.">Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator.">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li><li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIC4,+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer:+surprising+connections.">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li><li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer.">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li><li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene,+CLIC4,+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts.">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li><li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide.">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation.">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378 (2012).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling.">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li><li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans.">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li><li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929 (2014).</li><li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression.">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li><li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination.">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li><li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1/BECN1/Beclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development.">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li><li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+environment,+DAF-7/TGFbeta+signaling+and+LAG-2/DSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche.">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li><li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+helicase+HIM-6/BLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis.">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li><li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes.">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li><li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li></ol>

Este artigo apresenta um método rápido e eficiente para verificar as alterações Subcellular da proteína do citoplasma para o núcleo. A expressão da proteína foi mostrada por uma fusão de GFP, enquanto a estrutura do núcleo foi verificada por DAPI coloração (Figura 3). Desde que immunostaining proteínas de c. elegans é um desafio, a maioria das localizações da proteína c. elegans subcellular caracterizam-se por marcá-los com proteínas marcador como GFP, La...

Uma mudança de localização Subcellular da proteína é um mecanismo comum em resposta a sinais internos ou externos, tais como o stress de calor, fome, estresse oxidativo, apoptose, fosforilação de proteínas e outros. Por exemplo, stress de calor induz um membro FOXO DAF-16 translocação nuclear1,2e a proteína BCL-2 de pro-apoptotic que oferta translocates para a mitocôndria após recebimento morte sinalização3,4. Várias técnicas estão disponíveis para detectar essas alterações. Uma combinação de mancha ocidental e bioquimicamente isolando estruturas subcelulares (por exemplo, as mitocôndrias ou núcleos) bem poderia alcançar o objetivo3. No entanto, requer um anticorpo específico contra a proteína de interesse. Um anticorpo bem-estabelecida torna-se assim, a chave para o sucesso. Uma abordagem alternativa é para rotular diferentes estruturas subcelulares ou organelas com vários marcadores tais como proteínas fluorescência verde (GFP), proteína de fluorescência vermelha (RFP), proteína de fluorescência amarela (YFP) e mCherry e enquanto isso rotular a proteína de interesse com outros marcadores. Em seguida, observá-los sob um microscópio confocal para localizar os alvos5,6. Isótopos radioativos são uma escolha alternativa para rotular as proteínas alvo e então detectando sua localização subcellular7. No entanto, este método requer formação adequada e tratamento de resíduos radioactivos. Em circunstâncias como a falta de um anticorpo específico, a ausência de um marcador adequado ou a escassez de equipamentos, tais como um microscópio confocal, uma abordagem alternativa precisa ser considerado. Para identificar uma translocação nuclear da proteína, é atraente para rotular apenas as proteínas alvo com um marcador e manchar os núcleos com o reagente químico 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), desde que isto requer apenas um microscópio de fluorescência regular.
Immunolabeling c. elegans com anticorpos é desafiadora devido a baixa permeabilidade da casca da ovo ou da cutícula colágenas em torno do animal. Entretanto, desde que o c. elegans proteínas são significativamente divergentes de suas orthologs de vertebrados, algumas empresas comerciais fornecem c. elegans com produtos específicos. É difícil para um pequeno laboratório gerar anticorpos c. elegans por si mesmos. Pesquisadores na Comunidade usam proteínas etiquetadas como marcadores para demonstrar uma expressão de localização ou do gene da proteína. Este artigo usa EXL-1::GFP como um exemplo, para controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor8. Uma translação integrado exl-1::gfp no genoma do animal é usado para expressar estàvel o gene com fusão de gfp . Pesquisas mostraram que exl-1 é expressa no intestino, músculo da parede do corpo e outras estruturas subcelulares8. Este protocolo demonstra como sincronizar vermes à fase larval quarta (L4), executar um calor stress experimento e conduta DAPI de coloração, etanol fixação, fixação de acetona e imagem de um microscópio de fluorescência regular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td>both Hoechst 33258 and Hoechst 33342 also works well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td>OP50</td>
			<td>https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim Wipe</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td></td>
			<td>soft tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#160; AX10</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Rel 4.8</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MR Rev3</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent nail polish gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-20 &#181;L pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-200 &#181;L pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200-1000 &#181;L pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L pipet tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200-1000 &#181;L pipet tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire worm pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting protein subcellular localization by green fluorescence protein tagging and 4',6-diamidino-2-phenylindole staining in caenorhabditis elegans

Neste protocolo, uma proteína de fusão de proteína (GFP) fluorescência verde e 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração são usados para controlar alterações de Localização subcellular da proteína; em particular, uma translocação nuclear sob um calor salientar a condição. As proteínas reagem sinais correspondentemente para interno e externos. Um mecanismo comum é mudar sua localização subcellular. Este artigo descreve um protocolo para rastrear a localização da proteína que não requer um anticorpo, etiquetar radioativo ou um microscópio confocal. Neste artigo, GFP é usado para marcar a proteína alvo EXL-1 em c. elegans, um membro da família cloreto intracelular canal proteínas (CLICs), incluindo mamíferos CLIC4. Uma linha de transgénicos integrado translacional exl-1::gfp (com um promotor e uma sequência genética completa) foi criada por transformação e γ-radiação e estàvel expressa o gene e gfp. Pesquisas recentes mostraram que em cima de stress de calor, estresse oxidativo não, EXL-1::GFP acumula-se no núcleo. Sobrepondo o sinal GFP com a estrutura de núcleos e o DAPI sinais confirma as alterações de Localização subcellular EXL-1 sob estresse. Este protocolo apresenta dois métodos de fixação diferentes para coloração de DAPI: fixação de etanol e fixação de acetona. O protocolo de coloração de DAPI apresentado neste artigo é rápido e eficiente e preserva tanto o sinal GFP e as mudanças de Localização subcellular da proteína. Este método requer apenas um microscópio de fluorescência com Nomarski, um filtro FITC e um filtro DAPI. É apropriado para um ajuste pequeno laboratório, pesquisa de estudante de graduação, pesquisa de estudantes de ensino médio e salas de aula de biotecnologia.

As proteínas intracelulares do canal de cloreto (CLIC) são proteínas multifunctional que são altamente conservadas em toda espécie de12. Muita pesquisa mostra que os CLICs regular stress celular, autofagia, apoptose, carcinogênese, angiogênese e a resposta imune inata do macrófago no sistema mamíferos13,14,15,16 ,<sup...

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Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Este protocolo demonstra como controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor, usando uma fluorescência verde (GFP) de proteína proteína da fusão como um marcador e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração. O DAPI protocolo de coloração é rápido e preserva os sinais de Localização subcellular GFP e proteína.

Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

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Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Preparação do Mgm101 recombinação de proteínas por Estratégia Tagging baseado MBP

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Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

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Localização de quantitativa de uma proteína de Golgi por imagem sua massa centro de fluorescência

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...