Name: chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a na&#239;ve-like state with improved multilineage differentiation potency
Uploaded: 2018-06-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÂ¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award und die Moseley Foundation unterstützt.

Alle tierische Verfahren wurden nach Tierbetreuung Leitlinien und Protokolle von der Johns Hopkins Schule von Medizin Institut der Tierpflege und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt durchgeführt.
1. Vorbereitung der Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) für Feeder-abhängige konventionelle (hESC Medium/MEF) oder naiv-zurückversetzt (LIF-3i Medium/MEF) hPSC Kultur
<ol><li>
Kaufen oder Inhouse Low-Passage Lieferungen von MEF Feeder von CF1 oder CF1 x DR4 Hybrid E13.5 mausembryonen nac...

<ol>
	<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Human+Naive+Pluripotency+in+the+Embryo+and+in+the+Dish.">Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish.</a> Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).</li><li>Zimmerlin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+inhibition+promotes+a+stable+human+naive+pluripotent+state+with+improved+functionality.">Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality.</a> Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), e3854 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions.">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).</li><li>Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+preparation+from+cultured+cells.">Chromosome preparation from cultured cells.</a> J Vis Exp. (83), e50203 (2014).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).</li><li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor-activated+stem+cell+circuits+and+stromal+signals+cooperatively+accelerate+non-integrated+iPSC+reprogramming+of+human+myeloid+progenitors.">Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors.</a> PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).</li><li>Collier, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Cell+Surface+Protein+Profiling+Identifies+Specific+Markers+of+Human+Naive+and+Primed+Pluripotent+States.">Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+distinct+states+of+human+naive+pluripotency+generated+by+reprogramming.">Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming.</a> Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Mek1/2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Pluripotent+Stem+Cells+with+In+Vivo+Embryonic+and+Extraembryonic+Potency.">Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency.</a> Cell. 169 (2), 243-257 (2017).</li><li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li><li>Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+simultaneous+generation+of+hematopoietic+and+vascular+progenitors+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).</li><li>Park, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+progenitors+from+cord+blood-derived+induced+pluripotent+stem+cells+possess+augmented+capacity+for+regenerating+ischemic+retinal+vasculature.">Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature.</a> Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).</li><li>Taapken, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karotypic+abnormalities+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells.">Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).</li><li>Mitalipova, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells.">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li><li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+the+copy+number+of+pluripotency+and+cell+proliferation+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+during+reprogramming+and+time+in+culture.">Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).</li><li>Hussein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+and+selection+during+reprogramming+to+pluripotency.">Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency.</a> Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).</li></ol>

Das LIF-3i-System wendet eine modifizierte Version des klassischen murinen 2i naiv Rückfall cocktail1 auf menschlicher pluripotenter Stammzellen. Die Selbsterneuerung der hPSC (die in 2i allein erweitern kann) wird in LIF-2i durch Ergänzung dieser Cocktail mit dem Tankyrase-Inhibitor XAV939 stabilisiert. LIF-3i Kultur ermöglicht Bulk und effiziente Umkehrung der konventionellen hPSC in einen pluripotenten Zustand ähnlich der menschlichen Präimplantations Epiblast-<sup...

Das Kultursystem 2i (MEK/ERK und GSK3β-Hemmer) wurde ursprünglich entwickelt, um heterogene Serum-Maus embryonale Stammzellen (mESC) Kulturen in eine einheitliche Grundzustand der Pluripotenz verwandt mit der Maus Präimplantations Epiblast1zu verfeinern. 2i unterstützt jedoch nicht die stabile Erhaltung der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) Linien2. Die verschiedenen komplexe niedermolekularer Wachstumsfaktor ergänzt, und transgene Ansätze vor kurzem berichtet wurde, vermeintlich erfassen ähnlich menschlichen naiv anmutenden pluripotenten Molekulare heißt es2. Jedoch viele der "naiv-Like" Staaten schuf mit diesen Methoden auch ausgestellt karyotypic Instabilität, epigenomischen Mängel (z. B. globale Verlust der elterlichen genomische Prägung) oder Differenzierungspotenzial beeinträchtigt.
In Kontrast, des Cocktails der dreifache chemische Hemmung der GSK3β, ERK und Tankyrase Signalisierung und Leukämie hemmenden Faktor (LIF-3i) war ausreichend für die stabile naiv anmutenden Umkehr ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien3. LIF-3i-zurückversetzt naiv hPSC (N-hPSC) gepflegt normalen Karyotyp und erhöht ihre Ausdrücke der naiv-spezifische menschliche Präimplantations Epiblast-Gene (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i Rückfall auch übertragenen hPSC mit einer Reihe von molekularen und biochemischen Eigenschaften einzigartig für mESC-wie naiv Pluripotenz, die enthalten erhöhte phosphorylierten STAT3 Signaltechnik, verringerte ERK Phosphorylierung, global 5 Methylcytosine CpG Hypomethylierung, genomweite CpG Demethylierung an embryonalen Stammzellen (ESC)-spezifisches Gen Promotoren und dominanten distal OCT4 Enhancer Verwendung. Darüber hinaus im Vergleich zu anderen naiv Rückfall-Methoden, die akzessorisch hypomethyliert führten eingeprägt genomic Loci, LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC waren frei von systematischen aufgedruckten CpG Muster oder Verlust der DNA Methyltransferase Ausdruck (z.B. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
Eine direkte LIF-3i-Kultur einer breiten Palette von konventionellen humanen embryonalen Stammzellen (hESC) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC) auf Feeder oder E8 Feeder-freien Bedingungen angebaut erzielt schnelle und Schüttgut eine Rückkehr zu einem naiven Epiblast-ähnlichen Zustand. Direkten LIF-3i naiv Rückfall kann jedoch ineffizient in einigen Sparten instabil konventionellen hPSC aufgrund der inhärenten genomic und Abstammung grundiert Variabilitäten aus dem Spender genetisch vielfältigen Hintergründe sein.
So, um das Dienstprogramm der LIF-3i-Methode zu erweitern, eine schrittweise Optimierung wurde entwickelt und wird hier präsentiert ermöglicht universelle naiv Rückfall mit fast jedem herkömmlichen hESC oder Transgen-freie HiPSC Linie auf Feeder kultiviert. Diese universalisierte naiv Rückfall Methode setzt einen transiente anfängliche Kultur Schritt in konventionellen hPSC, die die LIF-3i-Cocktail mit zwei zusätzlichen kleinen Molekülen (LIF-5i) ergänzt, die Proteinkinase (Forskolin) und sonic Hedgehog (sHH) (potenzieren Purmorphamine) signalisiert. Eine erste Passage der konventionellen hPSC in LIF-5i passt sie an nachfolgende stabile LIF-3i Rückfall in Großmengen. Anfängliche LIF-5i Anpassung steigert deutlich die ersten Einzeller klonalen Proliferation von konventionellen hPSC auf E8 oder Feeder (vor ihren späteren stabilen, kontinuierlichen Übergang in LIF-3i allein) angebaut. Konventionelle hPSC Linien angepasst tolerieren zunächst auf eine Passage in LIF-5i nachfolgende Masse klonalen passagierung naiv-zurückversetzt Zellen in LIF-3i Bedingungen, die entfällt die Notwendigkeit für die Kommissionierung und subcloning von den seltenen stabile Kolonien oder den routinemäßigen Einsatz von Anti-apoptotische Moleküle oder Rho-assoziierten Protein Kinase (ROCK)-Inhibitoren.
Die LIF-3i-Methode erfolgreich eingesetzte stabil ausbauen und pflegen ein breites Repertoire von > 30 unabhängige, genetisch vielfältigen konventionellen hPSC Zeilen für > 10 – 30 Passagen mit beiden Methoden nicht-enzymatische oder enzymatischen Dissoziation und ohne Nachweis der Induktion von chromosomalen oder epigenomischen Abweichungen, einschließlich Anomalien am aufgedruckten gen-Loci. Darüber hinaus sequentielle LIF-5i/LIF-3i-Kultur ist die einzige naiv Rückfall Methode, die bisher berichtet wurde, die die funktionale Pluripotenz ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien verbessert durch eine Verringerung ihrer Abstammung grundiert Genexpression und dramatisch verbessern ihre multipotenten Differenzierung Potenz. Die LIF-3i naiv Rückfall Methode löscht die inhärente interline-Variabilität der Differenzierung der Linie grundiert, konventionelle hPSC Linien und haben einen großen Nutzen der Anwendung in der regenerativen Medizin und zelluläre Therapien.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1024px;" width="1023">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated</td>
			<td style="width:161px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">561716</td>
			<td style="width:371px;">use 5&#181;L per assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti- TFCP2L1 antibody</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">HPA029708</td>
			<td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-beta-Actin antibody</td>
			<td style="width:161px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6276</td>
			<td>use at 1:5000 (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-CD146 antibody,&#160; PE conjugated&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">550315</td>
			<td>use 5&#181;L per assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-CD31 antibody, APC conjugated</td>
			<td style="width:161px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">17-0319-42</td>
			<td>use 2&#181;L per assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-CD31 microbead kit</td>
			<td style="width:161px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-NANOG antibody</td>
			<td style="width:161px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab109250</td>
			<td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-NR5A2 antibody</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">HPA005455</td>
			<td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">4695</td>
			<td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">4370</td>
			<td>use at 1:1000 (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">9145</td>
			<td>use at 1:1000 (Western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated</td>
			<td style="width:161px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">E0432</td>
			<td>use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated&#160;</td>
			<td style="width:161px;">R&#38;D System</td>
			<td style="width:119px;">FAB1435A</td>
			<td>use 5&#181;L per assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated</td>
			<td style="width:161px;">R&#38;D System</td>
			<td style="width:119px;">NLLC1435G</td>
			<td>use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-STAT3 antibody</td>
			<td style="width:161px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">9139</td>
			<td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-STELLA/DPPA3 antibody</td>
			<td style="width:161px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB4388</td>
			<td>use at a 1:50 dilution (immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated&#160;</td>
			<td style="width:161px;">R&#38;D System</td>
			<td style="width:119px;">NLLC4770R</td>
			<td>use at&#160; a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td>
			<td style="width:161px;">Stemgent</td>
			<td style="width:119px;">09-0068</td>
			<td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td>
			<td style="width:161px;">Stemgent</td>
			<td style="width:119px;">09-0069</td>
			<td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated</td>
			<td style="width:161px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">560193</td>
			<td>use 10&#181;L per assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated</td>
			<td style="width:161px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">560161</td>
			<td>use 10&#181;L per assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">APEL2-Li</td>
			<td style="width:161px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CellAdhere dilution buffer</td>
			<td style="width:161px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7183</td>
			<td>dilutent for Vitronectin XF&#8482; matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CF1 mouse</td>
			<td style="width:161px;">Charles river</td>
			<td style="width:119px;">023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:161px;">R&#38;D System</td>
			<td style="width:119px;">L5283</td>
			<td>reconstitute at 100mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">confocal microscope system</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">cord blood CD34+ derived iPSC line</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A18945</td>
			<td>also referred as 6.2 line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">Countess&#160; cell counting chamber slide</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Countess automated cell counter</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">DR4 mouse</td>
			<td style="width:161px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Essential 8 (E8) medium</td>
			<td style="width:161px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">Fetal bovin serum (FBS)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forskolin</td>
			<td style="width:161px;">Stemgent</td>
			<td style="width:119px;">04-0025</td>
			<td>reconstitute at 100mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Gelatin (porcine)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1890-100G</td>
			<td>resuspend in water and sterilize with an autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">mTeSR1 medium</td>
			<td style="width:161px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">Nalgene cryogenic vials</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS</td>
			<td style="width:161px;">USB Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PD0325901</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PZ0162</td>
			<td>reconstitute at 100mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:161px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:119px;">02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Purmorphamine</td>
			<td style="width:161px;">Stemgent</td>
			<td style="width:119px;">04-0009</td>
			<td>reconstitute at 10mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">recombinant human Activin A</td>
			<td style="width:161px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">AF-120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4</td>
			<td style="width:161px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">120-05ET</td>
			<td>resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">recombinant human FGF-basic (bFGF)</td>
			<td style="width:161px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">recombinant human LIF</td>
			<td style="width:161px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">300-05</td>
			<td>resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">SB431542&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Stemgent</td>
			<td style="width:119px;">04-0010-05</td>
			<td>reconstitute at 100mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stemolecule Y27632 in Solution</td>
			<td style="width:161px;">Stemgent</td>
			<td style="width:119px;">04-0012-02</td>
			<td>ROCK inhibitor in solution (10mM)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Streptavidin-Cy3 conjugate</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6402</td>
			<td>use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165</td>
			<td style="width:161px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-21</td>
			<td>resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Vitronectin XF matrix</td>
			<td style="width:161px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7180</td>
			<td>dilute at 40&#181;L/mL in CellAdhere&#8482; dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XAV939</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X3004</td>
			<td>reconstitute at 100mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:373px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a na&#239;ve-like state with improved multilineage differentiation potency

Naive menschliche pluripotenten Stammzellen (N-hPSC) mit verbesserter Funktionalität möglicherweise einen großen Einfluss in der regenerativen Medizin. Das Ziel dieses Protokolls ist effizient Abstammung grundiert, konventionellen menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gepflegt Feeder-frei oder Feeder-abhängige Bedingungen ein naiv anmutenden Pluripotenz mit verbesserter Funktionalität wiederherzustellen. Diese chemischen naiv Rückfall-Methode setzt den klassischen Leukämie hemmenden Faktor (LIF), GSK3β, MEK/ERK Hemmung und cocktail (LIF-2i), ergänzt mit nur einem Tankyrase Inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i wird konventionelle hPSC einen stabilen pluripotenten Zustand Annahme biochemische, transkriptionelle und epigenetischen Merkmale des Menschen vor der Implantation Epiblast zurückgesetzt. Diese LIF-3i-Methode erfordert minimale Zelle Kultur Manipulation und ist in ein breites Repertoire an humanen embryonalen Stammzellen (hESC) und Transgen-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC) Linien sehr reproduzierbar. Die LIF-3i-Methode erfordert keinen erneut grundieren Schritt vor der Differenzierung; N-hPSC unterscheiden sich direkt mit sehr hohen Wirkungsgraden und pflegen karyotypic und epigenomischen Stabilitäten (unter Einschluss der aufgedruckten Loci). Um die Universalität der Methode zu erhöhen, werden die konventionellen hPSC zuerst in der LIF-3i-Cocktail, ergänzt durch zwei zusätzliche kleine Moleküle, die Proteinkinase (Forskolin) und sonic Hedgehog (sHH) (Purmorphamine) Signalisierung (LIF-5i) potenzieren kultiviert. Dieser kurze LIF-5i Anpassung Schritt deutlich verbessert die erste klonale Expansion der konventionellen hPSC und ihnen erlaubt, anschließend naiv-zurückversetzt mit LIF-3i allein in Großmengen, damit die Notwendigkeit einer Kommissionierung/subcloning seltene N-hPSC vermieden werden später Kolonien. LIF-5i-stabilisierten hPSCs anschließend in LIF-3i allein ohne die Notwendigkeit von Anti-apoptotische Molekülen bestehen. Am wichtigsten ist, verbessert LIF-3i Rückfall deutlich die funktionelle Pluripotenz ein breites Repertoire von konventionellen hPSC durch Verringerung ihrer Abstammung grundiert Genexpression und löschen die Interline-Variabilität der gerichteten Differenzierung häufig unter den unabhängigen hPSC Linien beobachtet. Repräsentative Charakterisierungen von LIF-3i-zurückversetzt N-hPSC sind vorgesehen ist, und experimentelle Strategien für funktionale Vergleiche der isogenen hPSC in Linie grundiert Vs. naiv-ähnliche Zustände werden beschrieben.

Dieses Protokoll optimiert effizient naiv anmutenden Rückfall mit LIF-3i in beiden Feeder-abhängige und Feeder-unabhängige Linie grundiert konventionellen hPSC Kulturen (Abbildung 1). Das ausführliche Protokoll beschriebenen Umrisse fortlaufende Anpassung an LIF-3i entweder Feeder-abhängige oder Feeder-freien konventionellen hPSC Bedingungen (z. B. E8 Mittel) ab.
Vertreter ergibt sich ...

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Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemischen Rückfall von herkömmlichen menschlichen pluripotenten Stammzellen in eine naiv-artigen Zustand mit verbesserten Multilineage Differenzierung Potenz

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die effiziente, Bulk und schnelle chemische Rückfall von konventionellen Linie grundiert menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) in einen Epigenomically-Stall naiv Präimplantations Epiblast-ähnliche pluripotenten Zustand. Diese Methode ergibt verringerte Abstammung grundiert Genexpression und deutliche Verbesserung der gerichteten multilineage Differenzierung über ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien.

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...