Name: an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates at JoVE.com

ويدعم هذا البحث بتعاون مع فوكوكو، المحدودة تاكاو يوشيدا من فوكوكو، المحدودة المقدمة فكرة حقيبة الثقافة على شكل س. تاكاماسا ساتو من فوكوكو، المحدودة دعمت هذه البحوث من حيث محاكاة الحاسوبية لوضع كيس على شكل س الثقافة. أننا نود أن نقدر انتماء صاحب المقابلة الحالية، جامعة أوساكا، على السماح لنا بالعمل على النشر.

1. إعداد الخلايا والمواد
<ol><li>زراعة الخلايا HEK293 في تعديل النسر المتوسطة دولبيكو مع مصل بقرى الجنين 10% (FBS) والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%. ضبط الأس الهيدروجيني للمتوسط الثقافة إلى 6.8-7.6.</li>
	<li>بعد استزراع لمد 5 إلى 7، فصل الخلايا مع حمض حل التربسين-الإيثيلين (التربسين-يدتا) 0.25% وريسيد الخلايا في 5,000-10,000 الخلايا/سم2.</li>
</ol>2-زرع الخلايا في حقيبة على شكل O
<ol><li>فصل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1، 2 وريسوسبيند عليها في 2-5 مل من الثقافة المتوسطة.</li>
	<li>تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية (40 ميكرومتر) جمع تعليق خلية مفردة.</li>
	<li>حساب عدد الخلايا تلطيخ تريبان الأزرق وعداد تلقائي الخلية، ثم قم بإعداد 20 مل تعليق خلية (2.0 × 105 خلايا/مل).</li>
	<li>قم بتوصيل مدخل الكيس على شكل س (الشكل 1a) حقنه فرضت 50 مل دون المكبس.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig1.jpg"> رقم 1: صور تخطيطية وصور من السفن على شكل س. (a1) هذه صورة تخطيطية لوجود حقيبة على شكل س. (a2) وهذا صورة عن وجود حقيبة على شكل س. (b1) هذه صورة تخطيطية طبق على شكل س. (b2) هذه صورة طبق على شكل س. القطر الخارجي والداخلي للحقيبة على شكل س هي 90 و 20 ملم، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<ol start="5"><li>"الماصة؛" تعليق خلية استعداد في كيس على شكل س عن طريق المحاقن فرضت.</li>
	<li>استبدال المحاقن فرضت الأولى بحقنه نظيفة. إضافة 55 مل هواء النظيف عن طريق المحاقن النظيفة لتوسيع الحقيبة تماما.</li>
	<li>المشبك أنبوب مدخل ثم قم بإغلاق المدخل. وأخيراً، قم بإزالة المشبك من الأنبوب.</li>
	<li>احتضان الخلايا في كيس على شكل س طريق تهتز لها لفة في الدقيقة 45 في ظروف من شركة 37 درجة مئوية و 5%2.</li>
</ol>3-متوسط التغير (اختياري)
<ol><li>نقل تعليق خلية في أنبوب 50 مل من خلال المدخل.</li>
	<li>الطرد المركزي من أجل 2 دقيقة في 200 غ س في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم نضح المادة طافية.</li>
	<li>إضافة 20 مل من الثقافة المتوسطة وريسوسبيند الخلايا.</li>
	<li>إضافة الخلايا ريسوسبينديد إلى كيس على شكل O بالخطوات التالية 2.4-2.7.</li>
	<li>احتضان الخلايا في كيس على شكل س طريق تهتز لها لفة في الدقيقة 45 في ظروف من شركة 37 درجة مئوية و 5%2.</li>
</ol>4-جمع الخلايا من الكيس
<ol><li>نقل تعليق خلية في أنبوب 50 مل من خلال المدخل.</li>
	<li>يغسل داخل الكيس مع 20 مل فوسفات الكالسيوم/المغنيسيوم-الحرة مخزنة المالحة [PBS(-)، ودرجة الحموضة = 7.4-7.6] وثم تصب المحتويات في أنبوب لجمع الخلايا المتبقية من الحقيبة.</li>
	<li>الطرد المركزي من تعليق الخلية التي تم جمعها لمدة 3 دقيقة في 200 غ س في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم نضح المادة طافية.</li>
	<li>أضف 10 مل PBS(-) وتغسل المجاميع.</li>
	<li>الطرد المركزي لهم لمدة 3 دقيقة في 200 غ س في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم نضح المادة طافية على جمع المجاميع.</li>
	<li>إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني و 1 مل من التربسين واحتضانها لهم مع المجاميع لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية فصل الخلايا للعد (اختياري).</li>
</ol>5-إعداد طبق على شكل س (اختياري)
ملاحظة: انظر الشكل 1b لصورة تخطيطية للطبق على شكل س.
<ol><li>قطع الجزء السفلي من صحن 60 ملم أو 35 ملم بسكين ساخنة والاستفادة منه كطبق داخلية.</li>
	<li>وضعت الطبق 60 ملم رأسا في وسط صحن 100 مم. ملاحظة: يمكن أن تساعد ورقة دليل تحديد موقف الطبق 60 ملم.</li>
	<li>إذا لزم الأمر، وضع cyclohexanone ضبط اللزوجة على كوميسوري من داخل صحن 60 ملم.</li>
	<li>الجاف للطبق على شكل س لبضعة أيام وتعقيم أنه بغاز أكسيد الإيثيلين أو أشعة غاما.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+three-dimensional+suspension+bioreactor+system.">Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).</li><li>Raven, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaled-up+manufacturing+of+recombinant+antibodies+produced+by+plant+cells+in+a+200-L+orbitally-shaken+disposable+bioreactor.">Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Protein+Expression+for+Structural+Biology+in+HEK+293F+Suspension+Cells:+A+Novel+and+Accessible+Approach.">Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).</li><li>Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter+culture:+the+propagation+of+mammalian+cells+in+suspension.">Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension.</a> Science. 164 (3879), 555-557 (1969).</li><li>Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+large-scale+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells.">Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells.</a> Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).</li><li>Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-scaling+single+cell-inoculated+suspension+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).</li><li>Horiguchi, I., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+replacement+with+albumin-associated+lipids+prevents+excess+aggregation+and+enhances+growth+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+suspension+culture.">Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture.</a> Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).</li><li>Sutherland, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+and+differentiation+in+multicellular+spheroids+of+human+colon+carcinoma.">Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma.</a> Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).</li><li>Hang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+fluid+dynamics+modeling+of+an+inverted+frustoconical+shaking+bioreactor+for+mammalian+cell+suspension+culture.">Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).</li><li>Einstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cause+of+the+formation+of+meanders+in+the+courses+of+rivers+annd+of+the+so-called+bear's+law.">The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law.</a> Die Naturwissenschaften. 14, (1926).</li><li>Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Einstein's+tea+leaves+and+pressure+systems+in+the+atmosphere.">Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere.</a> The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).</li><li>Miyamoto, D., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+iPS+cells+is+dependent+on+embryoid+body+size+in+microwell+chip+culture.">Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+cotrolled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Singh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactor+for+cell+culture+using+wave-induced+agitation.">Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation.</a> Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في هذه الدراسة، وضع السفن على شكل س، ويؤديها ثقافة تعليق HEK293 فيها لتشكيل المجاميع موحدة والتوسع. في الطبق الثقافة التقليدية، أنتجت المداري الهز الثقافة أقطار مختلفة اثنين من المجاميع، بينما لاحظنا المجاميع موحدة في الأوعية الدموية على شكل س (الشكل 1). وفقا لمراقبة توزيع الخرز الملون في ظروف تهز المداري، جمع الخرز في وسط أسفل صحن الثقافة التقليدية. بسبب هذا التجمع المفترض أن الفرق في كثافة الخلية مما يؤدي إلى أحجام مختلفة من المجاميع. وبدلاً من ذلك، وزعت الخرز في الطبق على شكل س الذي ليس لديه منطقة وسط-أسفل (تكميلية الشكل 1). ربما يؤدي هذا التوزيع المجاميع الحجم موحد في السفن على شكل س. آخر — المستخدمة على نطاق واسع-نهج لإنتاج المجاميع موحدة يتم استزراع في ميكروويلس، ولكن هذا النهج له بعض المشاكل، كما هو الحال في توفير وسيلة الثقافة دون المجاميع يتركون ميكروويلس13. وفي حالة السفن على شكل س، يمكن أن تنتج المجاميع موحدة في ثقافة تعليق بسيط.
المدارية تهز الثقافة نظام ثقافة شعبية تستخدم في خلايا الثدييات. هناك أساليب مختلفة من الثقافة لإنتاج كميات كبيرة من خلايا الثدييات، مثل الدبابات المقلبة مفاعل حيوي14،15من أكياس أشير الموجه، وتدوير الزجاجات. الثقافات تهز المدارية لا تقم بتضمين المكره داخلية لإثارة المتوسطة، على عكس المقلبة خزان مفاعل حيوي لا. هذه الميزة مماثلة لأشير موجه أكياس وزجاجات الدورية. يمكن تجنب الأضرار الخلوية من قوة القص المحيطة الضواغط هذه النظم ثقافة خالية من المكره وتحقيق منخفضة الإجهاد القص في الثقافة تعليق. خاصة، نظم الثقافة تهز المداري فعالة لإنتاج كميات كبيرة من الخلايا الحساسة مثل خلايا الثدييات بسبب قابلية عالية ومنخفضة الإجهاد القص.
يمكن تحسين السفن على شكل س المشكلة المتبقية الثقافة تهز المداري في تشكيل المجاميع. المداري تهز أنظمة الثقافة، تهاجر الخلايا العائمة للوسط والسفلي للسفينة، والذي يعرف باسم "مفارقة ورقة الشاي اينشتاين"11. هذه الهجرة يؤدي تجميع متنافرة والإنتاج الكلي غير موحدة في المداري التقليدية التي تهز السفن. في هذه الدراسة، ومنعت السفن على شكل س تركيز الخلايا في وسط أسفل السفن، التي تكهنت كسبب التراكم موحدة في السفن على شكل س تهز المداري.
وأظهرت تحاليل نسيجية أن المجاميع في الطبق التقليدية الواردة دينوكليتيد الخلايا (الشكل 2a). وفي المقابل، لم تظهر الخلايا دينوكليتيد في المجاميع من السفن على شكل س (الشكل 2 و 2 ج). فمن الممكن أن هذه الخلايا دينوكليتيد سببها نقص في ركائز مثل الجلوكوز، الجلوتامين، والأكسجين9. وفقا لقياس حجم، قد المجاميع في الأوعية الدموية على شكل س أقطار متجانسة أقل من 400 ميكرون. وفي المقابل، في صحن تقليدية، بعض المجاميع قد يبلغ قطرها أكبر من 400 ميكرون، وهذه المجاميع تشمل الخلايا دينوكليتيد. هذه النتيجة تشير إلى أن إنشاء مجاميع متجانسة الحجم في السفن على شكل س فعال في السيطرة على نوعية المجاميع. وبالإضافة إلى ذلك، هناك أيضا تكهنات تمنع الأوكسجين من خلال فيلم البولي إيثيلين الغاز نفاذية مظهر الخلايا دينوكليتيد في كيس على شكل س.
وأظهرت هذه التجارب إمكانية هذه السفن على شكل س كنظام بسيط لإنتاج المجاميع موحدة. رغم الأخرى للثقافة تعليق الأكياس الثقافة المتقدمة15، تلك الثقافة الأكياس على شكل مربع، مما يمنع الثقافة من الحصول على فعالية مختلطة في الهز المداري. الحقيبة في هذه الدراسة قد رواية مستديرة الشكل مناسب للهز المداري لإنتاج المجاميع مع حجم متجانسة. هذه الخاصية من سفن مهم للسيطرة على الأوضاع وفي إمكانية تكرار نتائج عالية من الخلايا في الإنتاج الضخم. إمكانية تطبيق السفينة على شكل س على نطاق واسع. يمكن استخدامه عند إنتاج البروتينات المؤتلف من الخلايا والطب التجديدي عند التعامل مع الخلايا الجذعية.
وفي الختام، قمنا بتطوير رواية س-على شكل حقيبة مناسبة لإنتاج المجاميع خلية موحدة مع ثقافة هز مداري. الحقيبة يظهر الإمكانيات للتطبيقات الطبية الحيوية المختلفة كما هو الحال في الطب التجديدي.

تعليق خلية الثقافة تلعب دوراً هاما في إنتاج الخلية للطب التجديدي1 والمؤتلف البروتين الإنتاج2 لأنه من السهل الارتقاء وتحقيق كثافات عالية الخلية، أحياناً ما يصل إلى أكثر من 107 خلايا/ مل5. خلايا مبيض الهمستر الصيني (شو)3 وقد نمت خلايا الكلي الجنينية البشرية 293 (HEK293)4 في الثقافة تعليق الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) قد نمت مؤخرا في أنظمة الثقافة التعليق للتجدد العلاجات1،،من67. ومن المتوقع استخدام الثقافات تعليق زيادة في المستقبل.
في الثقافة، وتعليق بعض خطوط الخلايا لا تنمو كخلايا مفردة ويجب، لذلك، تشكل المجاميع. على سبيل المثال، هبسكس لا يمكن البقاء على قيد الحياة في ظروف تعليق دون تشكيل المجاميع. ومع ذلك، صعوبات هذا الشرط للنمو مجمعة للثقافات التعليق الموحد. إحدى الصعوبات هو تشكيل المجاميع الموحدة في الفترة المبكرة من الثقافة، الذي يحدد كفاءة الثقافة تعليق8. وهناك صعوبة أخرى هو نقل أسلحة من المغذيات في المجاميع. على وجه الخصوص، الإمداد بالأكسجين حدود الحد الأقصى لحجم المجاميع، وإمدادات الأوكسجين فقيرة يسبب نخر في وسط المجاميع9. ونتيجة لذلك، تعليق الثقافات المجاميع الخلية أكثر صعوبة للحصول على من الثقافات التقليدية تعليق. ومع ذلك، تعليق الثقافات حاسمة بالنسبة للطب الأحيائي وتطبيقات التكنولوجيا الأحيائية.
سفن تهز المدارية هي واحدة من أبسط أنظمة الثقافة التعليق أن تحقيق الخلائط المتوسطة الثقافة دون الانفعالات المكره. إجهاد القص من المكره وديناميكية تدفق المتوسط هو المشكلة الرئيسية للثقافة تعليق لأنه يسبب تلف الخلايا وتمايزها. لتحقيق الإثارة مع إجهاد القص السفلي، الباحثين والصناعات قد وضعت مجموعة متنوعة من نظم السفينة تهتز المداري2،10.
ومع ذلك، سفن الثقافة التقليدية ليست مصممة للمدارى تهز الثقافات. في المداري تهز السفن، الخلايا تنجذب نحو المركز أسفل للسفن من نوع من التدفق المتوسط المعروف باسم "مفارقة ورقة الشاي اينشتاين"11، الذي يسبب تجميع متنافرة من الخلايا. تدفق دائري، بسبب قوة الطرد المركزي ومن احتكاك بين المتوسط الثقافة وسفينة، والاحتلالات الخلايا إلى11،مركز12. وبالإضافة إلى ذلك، الثقافة التقليدية وأكياس للثقافة الجماهيرية على شكل مربع، التي لا تصلح للهز المداري.
في هذه الدراسة، قمنا بتطوير حقيبة ثقافة رواية مناسبة للمدارى تهز الثقافات. الجدة من هذه الحقيبة هو شكله س التي لا تحتوي على منطقة مركز، حيث يمنع الخلايا من التجمع في منطقة مركز القاع. قد أثبتنا أيضا التعامل مع هذه السفن مع ثقافة HEK293 لإثبات إمكانية هذه الأكياس لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">HEK293</td>
			<td style="width:123px;">RIKEN Bio resorce centre</td>
			<td style="width:156px;">RCB1637</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Dulbecco&#39;s PBS (&#8211;)</td>
			<td style="width:123px;">Cell Science &#38; Technology Institute</td>
			<td style="width:156px;">1102P05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td style="width:123px;">CORNING</td>
			<td style="width:156px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50 mL Syringe</td>
			<td style="width:123px;">TERUMO</td>
			<td style="width:156px;">SS-50ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Shaker</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">2-1987-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge Tube 50 mL</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">1-3500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Automated cell counter</td>
			<td style="width:123px;">BioRad</td>
			<td style="width:156px;">TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates

الثقافات تعليق خلية الثدييات المجاميع مطلوبة من أجل تطبيقات مختلفة في المجالات الطبية والتكنولوجيا الحيوية. الأسلوب القائم على حقيبة المتاح واحد من أبسط أساليب الإنتاج الضخم للمجاميع الخلوية، ولكن أنها لا تحمي الثقافات ضد التراكم المفرط، الذي يحدث عندما يجتمعون في وسط أسفل السفينة الثقافة. لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير طبق على شكل O وحقيبة على شكل س، أي من الذي يحتوي على منطقة وسط. المجاميع التي نمت في السفينة على شكل س الثقافة أما كانت ملحوظة أكثر توحيدا في الحجم من المجاميع التي نمت في السفن التقليدية. تحاليل نسيجية أظهرت أن المجاميع في أطباق الثقافة التقليدية الواردة النوى نخرية على الأرجح سبب إمدادات الأوكسجين فقيرة. وفي المقابل، لم تظهر المجاميع التي كانت تزرع في كيس على شكل س، حتى تلك ذات أقطار مشابهة للمجاميع في أطباق الثقافة التقليدية، النوى نخرية. وتوحي هذه النتائج أن الحقيبة على شكل س يوفر الأكسجين كافية للمجاميع بسبب نفاذية الأكسجين من المواد حقيبة. لذلك، نقترح أن هذه الحقيبة رواية الغاز نفاذية الثقافة على شكل س مناسبة لإنتاج كميات كبيرة من المجاميع الموحدة التي ضرورية في مختلف المجالات الحيوية.

وفقا لقياسات لدينا، قد تختلف المجاميع التي نمت في الطبق التقليدية أقطار بعد 5 د الهز المداري. وفي المقابل، كان المجاميع التي نمت في السفن على شكل س د 5 أقطار موحدة أكثر بكثير. أظهر الثقافة التقليدية صحن المجاميع الصغيرة (50-200 ميكرومتر)، بينما الثقافات في الأوعية الدموية على شكل س لم تتضمن أي المجاميع الصغيرة (الشكل 2a). وفقا لقياس حجم المستند إلى الصور، أظهر الثقافة التقليدية صحن قمم مختلفة اثنين (الرقم 2b1)، مما يشير إلى انحراف واسعة من المساحة الإجمالية. هذه النتيجة تعني أن المجاميع في الطبق التقليدية كانت تنمو تحت ظروف مختلفة في الثقافة نفسها، مما قد يؤدي إلى نوعية الخلية غير متجانسة. من ناحية أخرى، المجاميع في السفن على شكل س أظهر ذروة واحدة وأقل انحراف في قطر من تلك في الطبق التقليدية (الشكل 22 و 2b3)، مما يوحي بأن هذه المجاميع قد تكون من نوعية موحدة أكثر.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig2.jpg"> رقم 2: مورفولوجيس وأقطار من المجاميع التي نمت في سفن مختلفة. هذه اللوحات إظهار الصور برايتفيلد () و (ب) رسوم بيانية للمجاميع التي نمت في أما (a1 و b1) التقليدية صحن (a2 و b2)، على شكل س الطبق، أو (a3 و b3) كيس على شكل س. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
توضع وتلطيخ ويوزين تجميع المقاطع العرضية أظهر أن المجاميع التي نمت في الطبق التقليدية بعض الخلايا دينوكليتيد والنوى نخرية (الشكل 3a). ومع ذلك، لم تظهر المجاميع التي نمت في السفن على شكل س أي النوى نخرية (الشكل 3 و 3 ج). على وجه الخصوص، المجاميع التي نمت في كيس على شكل س كانت كبيرة مثل تلك التي في الطبق التقليدية حتى الآن لم يكن أي النوى نخرية (الشكل 3 ج). واقترحت هذه النتائج أن الحقيبة الغاز نفاذية توفير ما يكفي من الأوكسجين إلى الثقافة.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig3.jpg"> الشكل 3: المقاطع العرضية للمجاميع في سفن مختلفة. المقاطع العرضية 12 ميكرومتر سميكة وكانوا مستعدين من العينات المجمدة. كانت ملطخة المقاطع توضع وثم تصور الخلايا. () الخلية المجاميع التي نمت في ثقافة تقليدية تعليق أظهرت النوى نخرية. وأظهرت المجاميع الخلية التي نمت في أما (ب) الطبق على شكل س أو (ج) وجود حقيبة على شكل س نخر القليل جداً بهم النوى. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
عدد خلايا أظهر أن أكثر من 85% الخلايا نجا د 5 تعليق الثقافة في كل سفينة (الشكل 4 أ). وكانت كثافة الخلية النهائية حوالي 1.5-2.0 × 106 خلايا/مل. على الرغم من أنه لا فرق كبير، كانت نسبة النمو في كيس على شكل س أعلى من تلك الموجودة في السفن الأخرى (الشكل 4 باء). وكانت معدلات نمو محددة من الخلايا في الطبق التقليدية وطبق على شكل س والحقيبة على شكل س بين اليوم الثاني واليوم 5 0.018 و 0.025 ح 0.020-1، على التوالي.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig4.jpg"> الشكل 4: خلية بقاء ونمو. إظهار هذه الألواح () خلية السلامة) و (ب) خلية كثافة الخلايا HEK293 في مختلف الثقافة السفن بعد 2 (د) الثقافة (اليوم 2) و 5 د للثقافة (اليوم الخامس). وتمثل القيم المعروضة متوسط النتائج من 3 التجارب المستقلة. القيم الخاصة بكل تجربة حسبت من الخلايا الملون الأزرق تريبان عدها مع عداد خلايا تلقائية. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
تكميلية الشكل 1: حبة التوزيع في تنسيقات مختلفة طبق 2 في مختلف الظروف تهز. هذا الفريق يوضح توزيع حبة خلال مختلف الظروف تهز (في الدقيقة 30 و 40 و 45) في صحن التقليدية وعلى شكل س. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/Figure_S1.pdf">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates at JoVE.com

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

وهنا يقدم بروتوكول لاستخدام السفن على شكل س والمتخصصة للثقافات تعليق المجاميع الخلوية، مع الهز المداري. تشكل الخلايا HEK293 تزرع في هذه الحقيبة أكثر مجاميع متجانسة من تلك التي نمت في سفن الثقافة التقليدية.

المداري تهز ثقافة خلايا الثدييات في السفن على شكل س لإنتاج المجاميع الموحدة

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

هذا الأسلوب متقدم جداً. لديها أقسام في مجال التكنولوجيا الحيوية مثل هندسة الأنسجة والعلاج التوليدي المجاني وفحص المخدرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المجاميع حجم موحدة يمكن أن تنتج في ثقافة بسيطة والتعليق.ويمثل هذا اللوح إمكانية وجود سفن جديدة على شكل حرف O لإنتاج مجاميع موحدة من خلايا الثدييات في ثقافة التعليق الاهتزاز المداري. في ثقافة الهز المداري مع السفن التقليدية ، يحدث التدفق الدائري بسبب قوة الطرد المركزي للسطح المتوسط ، وينقل هذا التدفق المتوسط الخلايا نحو وسط القاع من السفن. هذا التأثير هو معروف جيدا باسم آينشتاين الشاي ورقة مفارقة.هذا التأثير يسبب تراكم الزائدة من الخلايا في وسط أسفل الخلايا وتجميع غير متجانسة. من ناحية أخرى، أوعية على شكل O القضاء على المنطقة الوسطى التي تمنع الخلايا كاسحة تدفق المتوسطة في منطقة وسط القاع. وهذا يحد من تراكم الخلايا التي يمكن أن تحقق التجميع متجانسة.تبدأ مع قارورة 25 سم مربع من خلايا HEK-293 لكل سفينة أن يجلس. افصل الخلايا باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA حل وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه الناتجة في ملليلتر واحد من المتوسطة الثقافة.قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلايا 40 ميكرون لجمع تعليق أحادي الخلية. إضافة Trypan الأزرق إلى aliquot من تعليق الخلية وإجراء عدد الخلايا. ثم إعداد 20 ملليلتر من تعليق الخلية في 2 مرات 10 إلى الخلايا 5 في المليلتر.قم بتوصيل مدخل الكيس على شكل O بحقنة 50 ملليلتر مشبكة ثم قم بفصل المكبس. خفض تعليق الخلية المعدة في كيس على شكل O من خلال حقنة فرضت. استبدال الحقنة المشبك الأول مع حقنة نظيفة.إضافة 55 ملليلتر من الهواء من خلال حقنة نظيفة لتوسيع الحقيبة تماما. رفرف أنبوب مدخل ثم أغلق المدخل. وأخيرا، إزالة المشبك من الأنبوب.احتضان الخلايا في كيس على شكل O مع اهتزاز في 45 دورة في الدقيقة في ظروف 35 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتغيير الوسط في الخلايا، قم أولاً بنقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر، عبر المدخل. ثم الطرد المركزي لمدة دقيقتين في 200G في درجة حرارة الغرفة.بعد التعرق، إضافة 20 ملليلتر من الثقافة المتوسطة وإعادة تعليق الخلايا. إضافة الخلايا resuspended إلى كيس على شكل O كما كان من قبل وإعادة كيس مختومة إلى حاضنة تهتز. لجمع الخلايا، نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر من خلال مدخل، كما كان من قبل.اغسل داخل الكيس بـ 20 ملليلتر من الكالسيوم والمغنيسيوم الخالي من الفوسفات والملوحة العازلة ثم استنزف المحتويات في أنبوب لجمع الخلايا المتبقية من الحقيبة. الطرد المركزي تعليق الخلية التي تم جمعها لمدة ثلاث دقائق في 200 مرة G في درجة حرارة الغرفة ومن ثم الpirate supernate. إضافة 10 ملليلتر من الكالسيوم، المغنيسيوم برنامج تلفزيوني مجانا ومشاهدة المجاميع.بعد الطرد المركزي كما كان من قبل، وإزالة supernate وترك بيليه تحتوي على المجاميع. إذا كان هناك حاجة إلى عدد الخلايا، أضف أربعة ملليلترات من PBS ومليلتر واحد من التربسين إلى المجاميع واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية لفك الخلايا للعد. وتبين القياسات التجريبية أن المجاميع التي تزرع في الطبق التقليدي، كانت لها أقطار متفاوتة بعد خمسة أيام في الاهتزاز المداري.في المقابل، كان المجاميع التي تزرع في أطباق أو أكياس على شكل O لمدة خمسة أيام، أقطار أكثر اتساقا. وفقا لقياس حجم الصورة القائمة على, وأظهرت ثقافة طبق التقليدية اثنين من القمم المختلفة, مما يدل على انحراف واسع من حجم الكلي. من ناحية أخرى، أظهرت المجاميع في الأطباق على شكل O والحقائب على شكل O ذروة واحدة وانحراف أقل في القطر من تلك الموجودة في الطبق التقليدي، مما يشير إلى أن مثل هذه المجاميع قد تكون ذات جودة أكثر اتساقا.Haematoxylin وeosin-تلطيخ من المقاطع العرضية الكلية، وأظهرت أن المجاميع التي تزرع في الطبق التقليدي كان بعض الخلايا الناسخة ومسار نخري؛ ولكن المجاميع التي نمت في السفن على شكل O لم تظهر أي مسار والمجاميع التي تزرع في كيس على شكل O كانت كبيرة مثل تلك الموجودة في الطبق التقليدي. وأظهرت أعداد الخلايا أن أكثر من 85٪ من الخلايا نجا لمدة خمسة أيام من ثقافة التعليق في كل سفينة. يوضح هذا الفيديو كيفية التعامل مع رواية على شكل سفن O لإنتاج مجاميع موقع موحدة من خلايا الثدييات في ثقافة تعليق بسيطة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

مزيج من Microstereolithography وElectrospinning لإنتاج أغشية مجهزة الكوات لتجديد القرنية

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

المفاعلات الحيوية الألياف المجوفة ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تشبه الثدييات زراعة الأنسجة

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

استزراع خلايا الثدييات في السقالات ببتيد ثلاثي الأبعاد

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

المراقبة المجهرية متعددة الفوتون للأوعية في أنسجة كبد الفأر

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

منصة تقنية مفتوحة المصدر لتصنيع نماذج ثقافة 3D القائمة على الهيدروجيل بطريقة آلية وموحدة

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

تجزئة نمو الخلايا البطانية في لوحات 6-Well على شاكر المداري للدراسات الميكانيكية الحيوية

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...