Name: an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 5 min 40 s
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Diese Forschung wird durch eine Zusammenarbeit mit Allgemeines, CO., Ltd. Takao Yoshida von Allgemeines, CO., Ltd. lieferte die Idee der O-förmigen Kultur Tasche unterstützt. Takamasa Sato von Allgemeines, CO., Ltd. unterstützt diese Forschung im Hinblick auf eine Computersimulation für die Entwicklung der O-förmigen Kultur-Tasche. Wir würden gerne aktuelle Zugehörigkeit des entsprechenden Autors, Osaka University, für die Erlaubnis zur Veröffentlichung arbeiten zu schätzen wissen.

1. Vorbereitung der Zellen und Materialien
<ol><li>Pflegen Sie HEK293 Zellen in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium mit einem 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren. Den pH-Wert des Kulturmediums auf 6,8-7,6 einstellen.</li>
	<li>Nach der Kultivierung für 5 bis 7 d, die Zellen mit 0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure-Lösung (Trypsin-EDTA) distanzieren und reseed Zellen bei 5.000-10.000 Zellen/cm2.</li>
</ol>(2) Aussaat die Zellen in einer O-förmigen Tasche
<ol><li>Trennen Sie die Zellen zu, wie unter Punkt 1.2 beschrieben und aufzuwirbeln sie in 2-5 mL Kulturmedium.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 µm), eine einzelne Zelle Aussetzung zu sammeln.</li>
	<li>Die Anzahl der Zellen durch Trypan blau einfärben und automatische Zelle Zähler, und bereiten dann 20 mL Zellsuspension (2,0 x 105 Zellen/mL).</li>
	<li>Verbinden Sie den Einlass der O-förmigen Tasche (Abbildung 1a) mit eingespannten 50 mL Spritze ohne einen Kolben.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Bilder und Fotos von O-förmigen Schiffe. (a1) Dies ist eine schematische Bild einer O-förmigen Tasche. (a2) Dies ist ein Bild von einem O-förmigen Tasche. (b1) Dies ist eine schematische Bild einer O-förmige Schale. (b2) Dies ist ein Bild von einem O-förmige Schale. Die äußere und innere Durchmesser der O-förmigen Tasche sind jeweils 90 mm und 20 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="5"><li>Pipette die präparierten Zellsuspension in den O-förmigen Beutel durch die eingespannten Spritze.</li>
	<li>Ersetzen Sie die ersten eingespannte Spritze durch eine saubere Spritze. Fügen Sie 55 mL saubere Luft durch die saubere Spritze, die Tasche komplett zu erweitern.</li>
	<li>Klemmen Sie den Schlauch und schließen Sie dann den Einlass. Schließlich entfernen Sie die Klammer aus der Tube.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in der O-förmigen Tasche durch Schütteln sie bei 45 u/min bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
</ol>3. mittlere Änderung (optional)
<ol><li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 mL Röhrchen durch den Einlass.</li>
	<li>Für 2 min bei 200 X g bei Raumtemperatur Zentrifugieren Sie und aspirieren Sie überstand.</li>
	<li>20 mL Kulturmedium und Aufschwemmen der Zellen.</li>
	<li>Fügen Sie die resuspendierte Zellen um die O-förmigen Tasche, um folgende Schritte 2,4-2,7.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in der O-förmigen Tasche durch Schütteln sie bei 45 u/min bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
</ol>4. sammeln die Zellen aus dem Beutel
<ol><li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 mL Röhrchen durch den Einlass.</li>
	<li>Waschen Sie die Innenseite der Tasche mit 20 mL Kalzium/Magnesium-freies Phosphat gepufferte Kochsalzlösung [PBS(-), pH = 7,4-7,6] und dann abtropfen lassen den Inhalt in ein Rohr, die verbleibenden Zellen aus dem Beutel zu sammeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellsuspension für 3 min bei 200 X g bei Raumtemperatur und aspirieren Sie überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL PBS(-) und waschen Sie der Aggregate.</li>
	<li>Für 3 min bei 200 X g bei Raumtemperatur Zentrifugieren Sie und aspirieren Sie überstand die Aggregate zu sammeln.</li>
	<li>4 mL PBS und 1 mL Trypsin und inkubieren sie mit die Aggregate für 10 min bei 37 ° C, um die Zellen für die Zählung (optional) zu distanzieren.</li>
</ol>5. Vorbereitung eines O-förmige Schale (optional)
Hinweis: Siehe Abbildung 1 b für eine schematische Bild der O-förmige Schale.
<ol><li>Am Ende ein Gericht mit 60 mm oder 35 mm mit einem heißen Messer geschnitten Sie aus und nutzen Sie es als eine innere Schale.</li>
	<li>Setzen Sie die 60 Millimeter-Teller kopfüber in der Mitte eines Tellers 100 mm. Hinweis: Ein Leitfaden Blatt kann helfen, die Position von 60 Millimeter-Teller entscheiden.</li>
	<li>Bei Bedarf setzen Sie Viskosität eingestellt Cyclohexanon auf der Kommissur aus dem Inneren des 60 Millimeter-Teller.</li>
	<li>Trocknen Sie die O-förmige Schale für ein paar Tage und sterilisieren Sie es von Gamma Ray oder Ethylen Oxid-Gas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+three-dimensional+suspension+bioreactor+system.">Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).</li><li>Raven, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaled-up+manufacturing+of+recombinant+antibodies+produced+by+plant+cells+in+a+200-L+orbitally-shaken+disposable+bioreactor.">Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Protein+Expression+for+Structural+Biology+in+HEK+293F+Suspension+Cells:+A+Novel+and+Accessible+Approach.">Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach.</a> Journal of Visualized Experiments. 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B., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-scaling+single+cell-inoculated+suspension+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).</li><li>Horiguchi, I., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+replacement+with+albumin-associated+lipids+prevents+excess+aggregation+and+enhances+growth+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+suspension+culture.">Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture.</a> Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).</li><li>Sutherland, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+and+differentiation+in+multicellular+spheroids+of+human+colon+carcinoma.">Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma.</a> Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).</li><li>Hang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+fluid+dynamics+modeling+of+an+inverted+frustoconical+shaking+bioreactor+for+mammalian+cell+suspension+culture.">Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).</li><li>Einstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cause+of+the+formation+of+meanders+in+the+courses+of+rivers+annd+of+the+so-called+bear's+law.">The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law.</a> Die Naturwissenschaften. 14, (1926).</li><li>Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Einstein's+tea+leaves+and+pressure+systems+in+the+atmosphere.">Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere.</a> The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).</li><li>Miyamoto, D., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+iPS+cells+is+dependent+on+embryoid+body+size+in+microwell+chip+culture.">Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+cotrolled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Singh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactor+for+cell+culture+using+wave-induced+agitation.">Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation.</a> Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie entwickelt O-förmigen Schiffe und ein HEK293 Suspensionskultur in ihnen für einen einheitlichen Aggregate Bildung und Erweiterung durchgeführt. In der konventionellen Kulturschale produziert Orbital schütteln Kultur zwei unterschiedliche Durchmessern der Aggregate, während wir einheitliche Aggregate in den O-förmigen Gefäßen (Abbildung 1) beobachtet. Nach der Beobachtung der Verteilung von bunten Perlen in den orbitalen schütteln Bedingungen sammeln Perlen in der Mitte-unten von einer konventionellen Kulturschale. Diese Versammlung verursacht vermutlich die Dichteunterschiede Zelle führt zu verschiedenen Größen der Aggregate. Alternativ wurden Perlen in der O-förmige Schale verteilt, die nicht über die Mitte-unten-Region (ergänzende Abbildung1). Diese Verteilung verursacht wahrscheinlich die gleichmäßig große Aggregate in O-förmigen Schiffe. Eine weitere – weit verbreitete – Ansatz zur Herstellung einheitlicher Aggregate ist die Kultivierung in Mikrovertiefungen, aber dieser Ansatz hat einige Probleme, wie z. B. bei der Versorgung von einem Nährmedium ohne Aggregate der Ausstieg aus der Mikrovertiefungen13. Bei O-förmigen Schiffen können einheitliche Aggregate in einem einfachen Suspensionskultur hergestellt werden.
Die Orbital schütteln Kultur ist ein Popkultur-System für Säugerzellen eingesetzt. Es gibt verschiedene Kulturmethoden für die Massenproduktion von Säugerzellen, wie z. B. die Rührbehälters Bioreaktor14, Welle winkte Taschen15, und drehen der Flaschen. Orbitale schüttelnde Kulturen beinhalten keine innere Laufrad für das Rühren des Mediums, im Gegensatz zu den Rührbehälters Bioreaktor tut. Diese Funktion ist ähnlich wie die Welle winkte Taschen und rotierenden Flaschen. Diese Laufrad-freie Kultur-Systeme vermeiden Zellschädigung aus der Querkraft, die rund um die Laufräder und geringe Schubbeanspruchung in Suspensionskultur zu realisieren. Insbesondere sind orbital schütteln Kultur Systeme wegen ihrer hohen Skalierbarkeit und geringen Schubspannung effektiv für die Massenproduktion von lichtempfindlichen Zellen wie Säugetierzellen.
O-förmigen Schiffe können das verbleibende Problem der orbital schütteln Kultur in der Bildung von Aggregaten verbessern. Im Orbital schütteln Kultur-Systeme Wandern Einzelfeldern zum Zentrum und Boden des Gefässes, bekannt als die "Einsteins Tea leaf Paradox"11. Diese Migration verursacht die inhomogene Aggregation und ungleichmäßige aggregierte Produktion in konventionellen Orbital schütteln Schiffe. In dieser Studie verhindert O-förmigen Schiffe die Konzentration der Zellen in der Mitte unten der Gefäße, die zum Grund des einheitlichen Aggregation im orbital schütteln O-förmigen Schiffe spekuliert wird.
Histologische Analysen ergaben, dass die Aggregate in der konventionellen Schale denucleated Zellen (Abbildung 2a) enthalten. Im Gegensatz dazu erschien denucleated Zellen nicht in den Aggregaten aus O-förmigen Gefäßen (Abb. 2 b und 2 c). Es ist möglich, dass diese denucleated Zellen durch einen Mangel an Substraten wie Glukose, Glutamin und Sauerstoff9verursacht wurden. Entsprechend der Größenmessung hatte Aggregate in den Gefäßen O-förmigen homogene Durchmesser weniger als 400 µm. Im Gegensatz dazu in einem konventionellen Gericht einige Aggregate hatte einen Durchmesser größer als 400 µm, und diese Aggregate enthalten denucleated Zellen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Schaffung homogener Größe Aggregate in O-förmigen Schiffe wirksam bei der Kontrolle der Qualität der Aggregate. Darüber hinaus wird es auch spekuliert, dass die Sauerstoffversorgung durch die gasdurchlässigen Polyethylenfolie das Auftreten von denucleated Zellen in der O-förmigen Tasche verhindert.
Diese Experimente zeigten die Möglichkeit dieser O-förmigen Schiffe als ein einfaches System für die Herstellung einheitlicher Aggregate. Obwohl andere Kultur-Taschen für Suspensionskultur entwickelten15gewesen sein, sind diese Kultur Taschen Quadrat-geformte, die verhindert, dass der Kulturkreis effektiv in orbital schütteln gemischt. Die Tasche in dieser Studie hat einen Runde Form geeignet für orbital schütteln um Aggregate mit einer homogenen Größe produzieren Roman. Diese Eigenschaft der Schiffe ist wichtig für die Steuerung, die Bedingungen und die hohe Reproduzierbarkeit der Zellen in der Massenproduktion. Die mögliche Anwendung des O-förmigen Schiffes ist weit verbreitet. Es kann verwendet werden bei der Produktion von rekombinanten Proteinen aus Zellen und für die regenerative Medizin, beim Umgang mit Stammzellen.
Zusammenfassend haben wir einen Roman O-förmigen Tasche geeignet für die Herstellung von einheitlichen Zelle Aggregate mit einem orbital schütteln Kultur entwickelt. Die Tasche zeigt Möglichkeiten für verschiedene biomedizinische Anwendungen wie z. B. in der regenerativen Medizin.

Zelle Suspensionskultur spielt eine wichtige Rolle in der Zellproduktion für regenerative Medizin1 und rekombinanter Protein Produktion2 , weil es einfach zu skalieren und zu erreichen hohen Zelldichten, manchmal bis zu mehr als 107 Zellen / mL-5. Chinesische Hamster Eierstock (CHO) Zellen3 und menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) sind vor kurzem in Kultur Federungssysteme für gewachsen und menschliche embryonale Nieren-Zellen 293 (HEK293)4 Suspensionskultur gewachsen worden regenerative Therapien,1,6,7. Die Verwendung von Suspensionskulturen wird voraussichtlich in der Zukunft erhöhen.
In Suspensionskultur einigen Zelllinien nicht als Einzelzellen wachsen und müssen daher Aggregate bilden. Zum Beispiel können hPSCs in Suspension Bedingungen nicht überleben ohne Aggregate zu bilden. Allerdings stellt diese Anforderung für aggregierte Wachstum Schwierigkeiten für homogene Suspensionskulturen. Eine Schwierigkeit ist die Bildung der einheitlichen Aggregate in der Frühzeit der Kultur, die die Effizienz der Aussetzung Kultur8bestimmt. Eine weitere Schwierigkeit ist der Stoffaustausch von Nährstoffen zu Aggregaten. Insbesondere die Versorgung mit Sauerstoff beschränkt die maximale Größe der Aggregate, und eine schlechte Sauerstoffversorgung bewirkt Nekrose in der Mitte der Aggregate9. Suspensionskulturen Zelle Aggregate sind daher schwieriger zu erreichen als herkömmliche Suspensionskulturen. Suspensionskulturen sind jedoch entscheidend für die Biomedizin und Biotechnologieanwendungen.
Orbital schütteln Schiffe sind eines der einfachsten Federungssysteme für Kultur, die Kulturmedium Mischungen ohne Laufrad Erregung zu erreichen. Scherspannung des Laufrades und der dynamischen Medium-Fluss ist das Hauptproblem der Suspensionskultur, weil es Zellschäden und Differenzierung verursacht. Um Agitation mit einer geringeren Scherbeanspruchung zu erreichen, entwickelten Forscher und Industrie eine Vielzahl von orbital schütteln Schiff Systeme2,10.
Konventionelle Kulturgefäße eignen sich jedoch nicht für Orbital schütteln Kulturen. In Orbital schütteln Schiffe Zellen angezogen die Mitte-unten der Gefäße durch eine Art von Medium-Fluss bekannt als die "Einsteins Tea leaf Paradox"11, wodurch die inhomogene Aggregation von Zellen. Die kreisförmige Strömung, verursacht durch eine Fliehkraft und eine Reibung zwischen dem Kulturmedium und ein Schiff fegt Zellen in der Mitte11,12. Darüber hinaus sind konventionelle Kultur Taschen für Massenkultur quadratische, die ist nicht geeignet für orbital schütteln.
In dieser Studie haben wir eine neue Kultur-Tasche geeignet für Orbital schütteln Kulturen entwickelt. Die Neuheit dieser Tasche ist die O-Form, die nicht über ein Zentrum-Gebiet, so dass Raffung an der unteren Mittelbereich Zellen verhindert werden. Wir haben auch den Umgang mit dieser Schiffe mit einer HEK293 Kultur zu zeigen, die Möglichkeit, diese Taschen für biotechnologische Anwendungen gezeigt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">HEK293</td>
			<td style="width:123px;">RIKEN Bio resorce centre</td>
			<td style="width:156px;">RCB1637</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Dulbecco&#39;s PBS (&#8211;)</td>
			<td style="width:123px;">Cell Science &#38; Technology Institute</td>
			<td style="width:156px;">1102P05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td style="width:123px;">CORNING</td>
			<td style="width:156px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50 mL Syringe</td>
			<td style="width:123px;">TERUMO</td>
			<td style="width:156px;">SS-50ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Shaker</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">2-1987-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge Tube 50 mL</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">1-3500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Automated cell counter</td>
			<td style="width:123px;">BioRad</td>
			<td style="width:156px;">TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates

Suspensionskulturen Säugerzelle Aggregate sind für verschiedene Anwendungen im medizinischen und biotechnologischen Bereich erforderlich. Die Einweg-Beutel-basierte Methode ist eine der einfachsten Techniken für die Massenproduktion von zellulären Aggregate, aber es schützt nicht die Kulturen gegen übermäßige Anhäufung, die auftritt, wenn sie in der unteren Mitte Kulturgefäß zu sammeln. Um dieses Problem zu lösen, entwickelten wir eine O-förmige Schale und eine O-förmigen Tasche, von die keine zentrale Region enthält. Aggregate in beiden O-förmigen Kulturgefäß angebaut wurden deutlich gleichmäßiger Größe als Aggregate in konventionellen Schiffen gewachsen. Histologische Analysen zeigten, dass die Aggregate, die in herkömmlichen Kultur Gerichte enthalten nekrotische Kerne sehr wahrscheinlich verursacht durch eine schlechte Sauerstoffversorgung. Im Gegensatz dazu zeigte Aggregate, die in der O-förmigen Tasche, auch solche mit ähnlichen Durchmessern bis Aggregate in herkömmlichen Kultur Gerichte angebaut wurden nicht nekrotische Kerne. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die O-förmigen Tasche ausreichend Sauerstoff zu den Aggregaten durch die Sauerstoff-Durchlässigkeit des Materials Tasche bietet. Wir schlagen daher vor, dass diese neuartige gasdurchlässigen O-förmigen Kultur-Tasche für die Massenproduktion von einheitlicher Aggregate geeignet ist, die in verschiedenen biotechnologischen Felder notwendig sind.

Nach unseren Messungen hatte Aggregate in der herkömmlichen Petrischale gezüchtet nach 5D orbital schütteln Durchmesser variiert. Aggregate in O-förmigen Schiffe für 5D angebaut hatte dagegen viel mehr einheitlichen Durchmesser. Die konventionellen Gericht Kultur zeigte kleine Aggregate (50-200 µm), während die Kulturen in den O-förmigen Gefäßen keine kleine Aggregate (Abbildung 2a) enthielten. Laut der bildbasierten Größenmessung zeigte die konventionellen Gericht Kultur zwei verschiedene Gipfel (Abbildung 2 b 1), eine große Abweichung der aggregierten Größe angibt. Dieses Ergebnis impliziert, dass Aggregate in der konventionellen Schale unter zwei verschiedenen Bedingungen in der gleichen Kultur, wuchsen die heterogenen Zelle Qualität führen könnten. Auf der anderen Seite Aggregate in O-förmigen Gefäßen zeigte eine einzelne Spitze und weniger Abweichung im Durchmesser als die in der konventionellen Schale (Abbildung 2 b2 und 2b3), darauf hindeutet, dass solche Aggregate von mehr einheitliche Qualität sein können.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig2.jpg"> Abbildung 2: Morphologien und Durchmessern von Aggregaten in verschiedenen Behältern gewachsen. Diese Tafeln zeigen (ein) Hellfeld-Bilder und (b) die Histogramme der Aggregate in entweder (a1 und b1) angebaut, eine konventionelle Gericht (a2 und b2) ein O-förmige Schale, oder (a3 und b3) eine O-förmigen Tasche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Hämatoxylin und Eosin Färbung des aggregierten Querschnitte zeigten, dass Aggregate in der herkömmlichen Petrischale gezüchtet einige denucleated Zellen und nekrotischen Kerne (Abbildung 3a hatten). Aggregate in O-förmigen Schiffe gewachsen zeigen nekrotischen Kerne (Abb. 3 b und 3 c) jedoch nicht. Insbesondere Aggregate in der O-förmigen Tasche gewachsen waren so groß wie die in der konventionellen Schale noch haben keine nekrotischen Kerne (Abb. 3 c). Diese Ergebnisse vorgeschlagen, dass die gasdurchlässigen Tasche genügend Sauerstoff, um die Kultur geliefert.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig3.jpg"> Abbildung 3: Querschnitte von Aggregaten in verschiedenen Gefäßen. Die Querschnitte sind 12 µm dick und bereiteten aus gefrorenen Proben. Die Abschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin visualisieren die Zellen gefärbt. (ein) die Zelle Aggregate in einer konventionellen Suspensionskultur gewachsen zeigte nekrotische Kerne. Zelle Aggregate in beiden (b) angebaut, eine O-förmige Schale oder (c) eine O-förmigen Tasche zeigte sehr wenig Nekrose in ihren Kernen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Zellzahlen zeigte, dass mehr als 85 % der Zellen für 5D Suspensionskultur in jedes Schiff (Abbildung 4a) überlebt. Die endgültige Zelldichte war ca. 1,5-2,0 x 106 Zellen/mL. Zwar gab es keinen signifikanten Unterschied, war das Wachstum-Verhältnis in der O-förmigen Tasche höher als in anderen Schiffen (Abbildung 4 b). Die spezifischen Wachstumsraten der Zellen in der konventionellen Gericht, die O-förmige Schale und den O-förmigen Beutel zwischen Tag 2 und 5 waren 0,018 und 0,025 0,020 h-1, beziehungsweise.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig4.jpg"> Abbildung 4: Zelle, Rentabilität und Wachstum. Diese Tafeln zeigen die (eine) Lebensfähigkeit und (b) Zelle Zelldichte HEK293 Zellen in verschiedenen Kulturgefäße nach 2 d Kultur (Tag 2) und 5 d Kultur (Tag 5). Die dargestellten Werte repräsentieren den Mittelwert der Ergebnisse aus 3 unabhängigen Experimenten. Die Werte für jedes Experiment wurden aus Trypan blau gefärbten Zellen gezählt mit einem automatischen Zelle Zähler berechnet. Die Fehlerbalken zeigen Standardabweichung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Abbildung1: Verteilung in 2 verschiedenen Gericht Formate in verschiedenen schütteln Bedingungen Bead. Dieses Fenster zeigt die Wulst bei verschiedenen schütteln (30, 40 und 45 u/min) in einer konventionellen und O-förmige Schale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/Figure_S1.pdf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von O-förmigen Schiffe, spezialisiert für Suspensionskulturen zellulären Aggregate mit orbital schütteln. Die HEK293 Zellen gewachsen in diese Tasche zu bilden mehr homogene Aggregate als die in herkömmlichen Kulturgefäße angebaut.

Orbital schütteln Kultur von Säugerzellen in O-förmigen Schiffe, einheitliche Aggregate zu produzieren

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Diese Methode ist sehr weit fortgeschritten. Es hat die Bereiche des Biobiotikums wie Tissue Engineering, freie generative Therapie und Arzneimittelscreening. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass gleichmäßige Größenaggregate in einfacher Federungskultur hergestellt werden können.Diese Tafel stellt die Möglichkeit der neuartigen O-förmigen Gefäße zur Herstellung einheitlicher Aggregate von Säugetierzellen in der Orbital-Schüttelungssuspensionskultur dar. In der orbitalen Schüttelkultur mit konventionellen Gefäßen tritt der kreisförmige Fluss aufgrund der Fliehkraft der mittleren Oberfläche auf, und dieser mittlere Fluss überträgt Zellen in Richtung Mittelboden der Gefäße. Dieser Effekt ist bekannt als Einsteins Teeblatt Paradoxon.Dieser Effekt verursacht eine übermäßige Ansammlung von Zellen in der Mitte-Unterseite der Zellen und die inhomogene Aggregation. Auf der anderen Seite eliminieren O-förmige Gefäße den Mittelbereich, der verhindert, dass mittlere Strömungszellen in den Mittel-Boden-Bereich fließen. Dies begrenzt die Anhäufung von Zellen, die eine homogene Aggregation realisieren können.Beginnen Sie mit einem 25-Quadrat-Zentimeter-Kolben HEK-293-Zellen für jedes zu sitzende Gefäß. Dissoziieren Sie die Zellen mit 0.25%Trypsin-EDTA-Lösung und sammeln Sie Zellen über Zentrifugation. Setzen Sie das resultierende Pellet in einem Milliliter Kulturmedium aus.Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb, um eine einzellige Suspension zu sammeln. Fügen Sie Trypan blue zu einem Aliquot der Zellsuspension hinzu und führen Sie eine Zellanzahl aus. Dann bereiten Sie 20 Milliliter Zellsuspension bei 2 mal 10 bis zur 5. Zelle pro Milliliter.Schließen Sie den Einlass des O-förmigen Beutels an eine geklemmte 50-Milliliter-Spritze an und lösen Sie dann den Kolben. Senken Sie die vorbereitete Zellsuspension durch die geklemmte Spritze in den O-förmigen Beutel. Ersetzen Sie die erste Klemme durch eine saubere Spritze.Fügen Sie 55 Milliliter Luft durch die saubere Spritze, um den Beutel vollständig zu erweitern. Klappen Sie das Einlassrohr und schließen Sie dann den Einlass. Entfernen Sie schließlich die Klemme aus dem Rohr.Inkubieren Sie die Zellen in der O-förmigen Tasche mit Schütteln bei 45 U/min bei Bedingungen von 35 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um das Medium in den Zellen zu ändern, übertragen Sie zuerst die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Rohr, über den Einlass. Dann Zentrifuge für zwei Minuten bei 200G bei Raumtemperatur.Nach dem Angieren des Überstandes 20 Milliliter Kulturmedium hinzufügen und die Zellen wieder aussetzen. Fügen Sie die resuspendierten Zellen wie zuvor in den O-förmigen Beutel und geben Sie den versiegelten Beutel an den Schüttelinkubator zurück. Um die Zellen zu sammeln, übertragen Sie die Zellsuspension wie zuvor durch den Einlass in eine 50-Milliliter-Röhre.Waschen Sie das Innere des Beutels mit 20 Milliliter Calcium, Magnesium-freie Phosphat-gepufferte Saline und dann den Inhalt in ein Rohr abtropfen lassen, um die restlichen Zellen aus dem Beutel zu sammeln. Zentrifugieren Sie die gesammelte Zellsuspension für drei Minuten bei 200 mal G bei Raumtemperatur und aspirieren Sie dann das Supernate. Fügen Sie 10 Milliliter Kalzium, Magnesium freie PBS und beobachten Sie die Aggregate.Nach dem Zentrifugieren wie zuvor, entfernen Sie das Supernate und lassen Sie das Pellet enthalten die Aggregate. Wenn eine Zellanzahl erforderlich ist, fügen Sie vier Milliliter PBS und einen Milliliter Trypsin zu den Aggregaten hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen für die Zählung zu trennen. Experimentelle Messungen zeigen, dass Aggregate, die in der konventionellen Schale angebaut werden, nach fünf Tagen im Orbitalschütteln unterschiedliche Durchmesser hatten.Im Gegensatz dazu hatten Aggregate, die fünf Tage lang in O-förmigen Geschirren oder Beuteln angebaut wurden, wesentlich gleichmäßigere Durchmesser. Nach der bildbasierten Größenmessung zeigte die konventionelle Schalenkultur zwei verschiedene Spitzen, was auf eine große Abweichung der Aggregatgröße hindeutet. Auf der anderen Seite zeigten Aggregate in O-förmigen Geschirren und O-förmigen Beuteln eine einzige Spitze und eine geringere Durchmesserabweichung als in der herkömmlichen Schale, was darauf hindeutet, dass solche Aggregate von gleichmäßigerer Qualität sein können.Haematoxylin und Eosin-Färbung von Aggregatquerschnitten zeigten, dass die in der konventionellen Schale angebauten Aggregate einige denucleatierte Zellen und einen nekrotischen Verlauf enthielten; jedoch zeigten Aggregate, die in O-förmigen Gefäßen angebaut wurden, keinen nekrotischen Verlauf und die im O-förmigen Beutel angebauten Aggregate waren so groß wie die in der herkömmlichen Schale. Die Zellzählungen zeigten, dass mehr als 85% der Zellen fünf Tage Suspensionskultur in jedem Gefäß überlebten. Dieses Video zeigt, wie man neuartige O-förmige Gefäße zur Herstellung einheitlicher Standortaggregate von Säugetierzellen in einfacher Suspensionskultur handhabt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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