Name: an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי שיתוף פעולה עם יושידה הטאקאו FUKOKU ושות', בע מ מ- FUKOKU, בע מ, סיפק את הרעיון של השקית בצורת O תרבות. סאטו Takamasa של FUKOKU ושות', בע מ תמיכה במחקר זה במונחים של סימולציה חישובית לפתח השקית בצורת O תרבות. ברצוננו להעריך השתייכות הנוכחי של המחבר המקביל, באוניברסיטת אוסקה, עבור המאפשר לנו לעבוד על הפרסום.

1. הכנת תאים וחומרים
<ol><li>לטפח HEK293 תאים במדיום נשר שונה של Dulbecco, עם 10% עוברית שור נסיוב (FBS) וחומצות אמינו 1% שאינם חיוניים. להתאים את ה-pH של המדיום תרבות כדי 6.8-7.6.</li>
	<li>לאחר culturing במשך 5 עד 7 d, לנתק את התאים על 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic פתרון חומצה (טריפסין-EDTA), reseed את התאים-5,000-10,000 תאי/ס מ2.</li>
</ol>2. זריעת תאי תיק בצורת O
<ol><li>מביצועם התאים כפי שמתואר בשלב 1.2, resuspend אותם ב 2-5 מ של תרבות בינוני.</li>
	<li>לסנן את המתלים תא דרך מסננת תא (40 מיקרומטר) לאסוף השעיה תא בודד.</li>
	<li>לספור את מספר התאים על ידי צביעת trypan blue מונה אוטומטי תא ולאחר מכן להכין 20 מ"ל של התליה תא (2.0 x 105 תאים/mL).</li>
	<li>להתחבר לים של השקית בצורת O (איור 1 א') מזרק 50 מ ל בחוזקה ללא בוכנה.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig1.jpg"> איור 1: תמונות של כלי בצורת O ותמונות סכמטי. (a1) זוהי דמות סכמתית של תיק בצורת O. (a2) זה תמונה של תיק בצורת O. (b1) זוהי דמות סכמתית של צלחת בצורת O. (b2) זה תמונה של צלחת בצורת O. הקוטר החיצוני והפנימי של השקית בצורת O הם 90 מ מ, 20 מ מ, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="5"><li>Pipette התליה תא מוכן לתוך השקית בצורת O דרך המזרק בחוזקה.</li>
	<li>להחליף את המזרק בחוזקה הראשון עם מזרק נקי. הוסף 55 מ של אוויר נקי דרך המזרק נקי כדי להרחיב את התיק לחלוטין.</li>
	<li>מהדק את צינור כניסת ולאחר מכן סגור את הים. בסופו של דבר, להסיר את המלחציים מהצינור.</li>
	<li>דגירה התאים בשקית בצורת O ע י ניעור אותם ב 45 rpm בתנאים של 37 ° C ו 5% CO2.</li>
</ol>3. בינוני שינוי (אופציונלי)
<ol><li>העברת התליה תא לתוך צינור 50 מ ל דרך הים.</li>
	<li>Centrifuge זה למשך 2 דקות ב- 200 גרם x בטמפרטורת החדר ולאחר מכן וארוקן את תגובת שיקוע.</li>
	<li>הוסף 20 מ של תרבות בינוני, resuspend את התאים.</li>
	<li>להוסיף את התאים resuspended לשקית בצורת O על ידי 2.4 השלבים הבאים-2.7.</li>
	<li>דגירה התאים בשקית בצורת O ע י ניעור אותם ב 45 rpm בתנאים של 37 ° C ו 5% CO2.</li>
</ol>4. איסוף התאים התיק
<ol><li>העברת התליה תא לתוך צינור 50 מ ל דרך הים.</li>
	<li>לשטוף את החלק הפנימי של התיק עם 20 מ של סידן/מגנזיום ללא פוספט buffered מלוחים [PBS(-), pH = 7.4-7.6] ולאחר מכן לרוקן את התוכן לתוך צינור כדי לאסוף את התאים הנותרים מתוך התיק.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא שנאספו במשך 3 דקות ב- 200 גרם x בטמפרטורת החדר ולאחר מכן וארוקן את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 10 מ של PBS(-), לשטוף מצרפי.</li>
	<li>Centrifuge אותם למשך 3 דקות ב- 200 גרם x בטמפרטורת החדר ולאחר מכן וארוקן את תגובת שיקוע לאסוף מצרפי.</li>
	<li>מוסיפים 4 מ"ל של PBS ו 1 מ"ל של טריפסין, דגירה אותם עם מצרפי 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מביצועם התאים עבור ספירה (אופציונלי).</li>
</ol>5. הכנת צלחת בצורת O (אופציונלי)
הערה: ראה איור 1b עבור דמות סכמתית של המנה בצורת O.
<ol><li>לגזור בתחתית צלחת 60 מ מ או 35 מ מ עם סכין חם ולנצל אותו כמו צלחת הפנימי.</li>
	<li>לשים את הצלחת 60 מ מ הפוך במרכז צלחת 100 מ מ. הערה: גיליון מדריך יכול לעזור לקבוע את המיקום של המנה 60 מ מ.</li>
	<li>אם נדרש, לשים מנוכים צמיגות cyclohexanone על commissure מבפנים של מאכל 60 מ מ.</li>
	<li>יבש את הצלחת בצורת O לכמה ימים, לעקר אותה על ידי גמא או אתילן אוקסיד גז.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+three-dimensional+suspension+bioreactor+system.">Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).</li><li>Raven, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaled-up+manufacturing+of+recombinant+antibodies+produced+by+plant+cells+in+a+200-L+orbitally-shaken+disposable+bioreactor.">Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Protein+Expression+for+Structural+Biology+in+HEK+293F+Suspension+Cells:+A+Novel+and+Accessible+Approach.">Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).</li><li>Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter+culture:+the+propagation+of+mammalian+cells+in+suspension.">Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension.</a> Science. 164 (3879), 555-557 (1969).</li><li>Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+large-scale+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells.">Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells.</a> Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).</li><li>Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-scaling+single+cell-inoculated+suspension+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).</li><li>Horiguchi, I., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+replacement+with+albumin-associated+lipids+prevents+excess+aggregation+and+enhances+growth+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+suspension+culture.">Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture.</a> Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).</li><li>Sutherland, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+and+differentiation+in+multicellular+spheroids+of+human+colon+carcinoma.">Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma.</a> Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).</li><li>Hang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+fluid+dynamics+modeling+of+an+inverted+frustoconical+shaking+bioreactor+for+mammalian+cell+suspension+culture.">Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).</li><li>Einstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cause+of+the+formation+of+meanders+in+the+courses+of+rivers+annd+of+the+so-called+bear's+law.">The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law.</a> Die Naturwissenschaften. 14, (1926).</li><li>Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Einstein's+tea+leaves+and+pressure+systems+in+the+atmosphere.">Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere.</a> The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).</li><li>Miyamoto, D., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+iPS+cells+is+dependent+on+embryoid+body+size+in+microwell+chip+culture.">Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+cotrolled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Singh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactor+for+cell+culture+using+wave-induced+agitation.">Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation.</a> Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקר זה, אנחנו פיתח כלי בצורת O וביצע תרבות הבולם HEK293 בהם היווצרות אגרגטים אחיד, הרחבה. בצלחת תרבות המקובלת, אורביטל רועד תרבות הפיק שני קטרים שונים של אגרגטים, ואילו הבחנו אגרגטים אחיד בכלי בצורת O (איור 1). על-פי התצפית של ההתפלגות של חרוזים מוכתם בתנאים חזק מסלולית, חרוזים לאסוף ב המרכז-התחתית לצלחת תרבות קונבנציונלי. איסוף זה נגרם ככל הנראה ההפרש בצפיפות תא שמוביל גדלים שונים של אגרגטים. לחלופין, חרוזים הופצו בצלחת בצורת O אשר אין אזור מרכז-התחתון (משלימה איור 1). הפצה זו כנראה גורם מצרפי בגודל אחיד בכלי בצורת O. אחר — בשימוש נרחב — גישה לייצור אגרגטים אחיד היא culturing ב microwells, אבל גישה זו יש כמה בעיות, כמו למשל באספקת מדיום תרבות ללא אגרגטים נושרת microwells13. במקרה של כלי בצורת O, אגרגטים אחיד יכול להיות מיוצר בתרבות התליה פשוטה.
אורביטל רועדת התרבות היא מערכת התרבות הפופולרית מנוצל עבור בתרבית של תאים. קיימות שיטות שונות תרבות עבור ייצור המוני של בתרבית של תאים, כמו טנק מנוער ביוריאקטור14, שקיות גל-רמז15, וסיבוב בקבוקים. מסלולית תרבויות חזק אינם כוללים את המדחף הפנימי עבור ערבוב של המדיום, בניגוד לטנק מנוער ביוריאקטור עושה. תכונה זו דומה שקיות גל-רמז ובקבוקים מסתובב. מערכות התרבות ללא המדחף אלה ניתן למנוע נזק תאי מהמשטרה ההטיה המקיף את המדחפים ולממש גזירה נמוכה בתרבות ההשעיה. במיוחד, מערכות התרבות חזק מסלולית יעילים לייצור המוני של תאים רגישים כגון בתרבית של תאים בגלל שלהם מדרגיות גבוהה, גזירה נמוכה.
כלי בצורת O יכול לשפר את הבעיה הנותרים של תרבות חזק מסלולית להיווצרות של אגרגטים. במסלולית רועד מערכות התרבות, העברת תאים צף למרכז ואת התחתון של הספינה, אשר מכונה "התה של איינשטיין העלה פרדוקס"11. העברה זו גורמת צבירה inhomogeneous בין הייצור צבירה לא אחידה המקובלת מסלולית טלטול כלי. במחקר זה, כלי בצורת O מנעו את הריכוז של תאים המרכז-החלק התחתון כלי הדם, אשר speculated כסיבה של צבירה במדים מסלולית כלי חזק בצורת O.
ניתוחים היסטולוגית הראה כי מצרפי בצלחת קונבנציונלי כולל תאים denucleated (איור 2 א). לעומת זאת, תאים denucleated אינה מופיעה מצרפי מכלי בצורת O (איור 2b ו- 2 c). זה אפשרי כי תאים denucleated אלה נגרמו על ידי מחסור של סובסטרטים כגון גלוקוז, גלוטמין ו חמצן9. על פי גודל המדידה, אגרגטים של כלי בצורת O היה נמוך יותר מאשר מיקרומטר 400 הומוגנית קטרים. לעומת זאת, בקערה קונבנציונאלי, אגרגטים כמה היה בקוטר גדול יותר 400 מיקרומטר, אגרגטים אלה כללו תאים denucleated. תוצאה זו עולה כי יצירת הומוגניות בגודל אגרגטים בכלי בצורת O הוא יעיל בשליטה האיכות של אגרגטים. בנוסף, זה גם הוא העריך, כי חמצון דרך הסרט פוליאתילן גז-חדיר למנוע את הופעת תאים denucleated בשקית בצורת O.
הניסויים הראו את האפשרות של אלו כלי בצורת O כמערכת פשוטה לייצור אגרגטים אחיד. אמנם שאר התיקים תרבות לתרבות ההשעיה כבר מפותחת15, תרבות השקיות האלו בצורת ריבוע, והדבר מונע התרבות של מקבל ביעילות מעורבות לוחצים מסלולית. השקית במחקר זה יש רומן מתאים רועד מסלולית לייצר אגרגטים עם גודל הומוגנית צורה עגולה. מאפיין זה של כלי חשוב עבור שליטה התנאים של הפארמצבטית גבוהה של תאים בייצור המוני. היישום אפשרי של כלי השיט בצורת O נפוצה. ניתן להשתמש בעת הפקת חומרים מתאי ו עבור רפואה רגנרטיבית בהתמודדות עם תאי גזע.
לסיכום, פיתחנו רומן בצורת O תיק מתאים לייצור אגרגטים תא אחיד עם תרבות חזק מסלולית. השקית מציג אפשרויות שונות ביו יישומים כגון רפואה רגנרטיבית.

תרבית תאים ההשעיה ממלא תפקיד חשוב בייצור תאים עבור רפואה רגנרטיבית1 ו רקומביננטי חלבון ייצור2 כי זה קל קנה המידה של ולהשיג צפיפות גבוהה תא, לפעמים אפילו יותר מ- 107 תאים / מ ל5. אוגר סיני השחלה (CHO) תאים3 , כליות עובריים אנושיים תאים (HEK293) 2934 גדלו בתרבות ההשעיה ואת תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) גדלו לאחרונה במערכות תרבות השעיה על ההתחדשות טיפולים1,6,7. השימוש של תרבויות ההשעיה צפוי להגדיל בעתיד.
בתרבות ההשעיה, כמה שורות תאים לא יכול להתפתח כבני תאים בודדים ויוצרים חייב, לכן, אגרגטים. לדוגמה, hPSCs לא יכול לשרוד בתנאים המתלים ללא ויוצרים אגרגטים. אולם, דרישה זו לצמיחה צבורים מציג קשיים על תרבויות ההשעיה אחיד. קושי אחד הוא היווצרות של אגרגטים אחיד בתקופה המוקדמת של התרבות, הקובע את היעילות של תרבות ההשעיה8. קושי נוסף הוא העברה המונית של חומרים מזינים לתוך אגרגטים. בפרט, אספקת החמצן מגביל את הגודל המרבי של אגרגטים, וגורם אספקת החמצן המסכן נמק במרכז של אגרגטים9. כתוצאה מכך, תרבויות השעיה של התא אגרגטים קשים יותר לקבל יותר קונבנציונאלי ההשעיה תרבויות. למרות זאת, ההשעיה תרבויות מכריעים עבור ביו ויישומים ביוטכנולוגיה.
מסלולית כלי חזק הם אחת ממערכות התרבות הפשוטה השעיה זה להשיג תערובות תרבות בינוני בלי עצבנות המדחף. מאמץ גזירה מן את המדחף ואת זרימת בינוני דינמי הוא הבעיה העיקרית של תרבות ההשעיה כיוון שזה גורם נזק לתאים ובידול. כדי להשיג עצבנות תוך מתן דגש הטיה התחתון, חוקרים, תעשיות פיתחו מגוון רחב של אורביטל חזק כלי מערכות2,10.
עם זאת, תרבות קונבנציונאלי כלי לא מיועדים מסלולית רועד תרבויות. במסלולית טלטול כלי, תאים יתלהבו המרכז-התחתון של כלי על ידי סוג של זרימה בינונית המכונה "תה של איינשטיין עלים פרדוקס"11, הגורמת צבירה inhomogeneous של תאים. הזרימה המעגלית, הנגרמת על ידי כוח צנטריפוגלי וחיכוכים בין המדיום תרבות כלי קיבול, מטאטא תאים לתוך מרכז11,12. בנוסף, תרבות קונבנציונאלי שקיות לתרבות המונים הם בצורת ריבוע, אשר אינו מתאים רועד מסלולית.
במחקר זה, פיתחנו תיק תרבות הרומן מתאים מסלולית רועד תרבויות. החידוש של התיק הזה הוא O-צורתו אשר לא קיים אזור המרכז, כך התאים תימנע איסוף בבת-ים התחתון. הראו גם טיפול אלו כלי עם תרבות HEK293 כדי להדגים את האפשרות של השקיות ליישומים הביו-טכנולוגיה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">HEK293</td>
			<td style="width:123px;">RIKEN Bio resorce centre</td>
			<td style="width:156px;">RCB1637</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Dulbecco&#39;s PBS (&#8211;)</td>
			<td style="width:123px;">Cell Science &#38; Technology Institute</td>
			<td style="width:156px;">1102P05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td style="width:123px;">CORNING</td>
			<td style="width:156px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50 mL Syringe</td>
			<td style="width:123px;">TERUMO</td>
			<td style="width:156px;">SS-50ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Shaker</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">2-1987-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge Tube 50 mL</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">1-3500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Automated cell counter</td>
			<td style="width:123px;">BioRad</td>
			<td style="width:156px;">TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates

ההשעיה תרבויות בתרבית של תאים האגרגטים נדרשים לצורך ישומים שונים בתחומי הרפואה, הביו-טכנולוגיה. השיטה מבוססת על התיק חד פעמיות היא אחת מהטכניקות הפשוטה ביותר לייצור המוני של אגרגטים הסלולר, אך זה אינו מגן התרבויות נגד צבירת יתר, אשר מתרחשת כאשר הם מתאספים במרכז התחתון של כלי השיט תרבות. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו צלחת בצורת O ותיק בצורת O, אף לא אחד מהם מכיל אזור מרכזי. אגרגטים גדל גם כלי בצורת O תרבות היו באופן ניכר יותר אחידים בגודלם מאשר אגרגטים גדל בכלי קונבנציונלי ניתוחים היסטולוגית הראה כי אגרגטים במנות תרבות קונבנציונאלי הכיל ליבות עם נמק הנראה כתוצאה של אספקת חמצן המסכן. לעומת זאת, אגרגטים שגודלו בשקית בצורת O, אפילו אלה עם קטרים דומה עד אגרגטים במאכלים תרבות קונבנציונאלי, לא הראה ליבות עם נמק. תוצאות אלו מראים כי השקית בצורת O מספק מספיק חמצן כדי מצרפי בשל החדירות חמצן של החומר בתיק. אנו, לכן, מציע כי התיק תרבות בצורת O גז-חדיר הרומן הזה מתאים לייצור המוני של אגרגטים אחיד הנחוצים במגוון תחומים הביו-טכנולוגיה.

על פי המידות שלנו, אגרגטים גדל לתוך המנה המקובלת היו מגוונות קטרים אחרי 5 d של טלטול מסלולית. לעומת זאת, אגרגטים גדל בכלי בצורת O עבור 5 d היה קטרים אחיד הרבה יותר. התרבות המנה המקובלת הראה אגרגטים קטנים (50-200 מיקרומטר), ואילו התרבויות של כלי בצורת O אינה מכילה שום אגרגטים קטנים (איור 2 א). לפי המדידה מבוססת תמונה בגודל, התרבות המנה המקובלת הראה שתי הפסגות שונים (איור 2b1), המעידים על סטייה רחב בגודל צבירה. תוצאה זו משתמעת אגרגטים המנה המקובלת צמחו תחת שני תנאים שונים בתרבות זהה, אשר יכול לגרום איכות התא הטרוגנית. מצד שני, אגרגטים בכלי בצורת O הראה לשיא יחיד ופחות סטייה בקוטר יותר מאלו של המנה המקובלת (איור 2b2 ו- 2b3), רומז כי אגרגטים כזה עשוי להיות באיכות אחידה יותר.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig2.jpg"> איור 2: מורפולוגיות, קטרים של אגרגטים גדלו ב ספינות שונות. לוחות אלה להראות תמונות brightfield () ו- (b) היסטוגרמות האגרגטים גדל או (a1 ו- b1) קונבנציונאלי מאכל, (a2 ו- b2) בצורת O צלחת, או (a3 ו- b3) תיק בצורת O. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
Hematoxylin ואאוזין מכתים של חתכים צבירה הראו שיש אגרגטים גדל לתוך המנה המקובלת כמה תאים denucleated, נמק ליבות (איור 3 א). עם זאת, אגרגטים גדל בכלי בצורת O לא הראה כל הליבות נמק (איור 3b ו- 3 c). בפרט, אגרגטים גדל בשקית בצורת O הם כל כך גדולים כמו אלה לתוך המנה המקובלת עדיין לא היה כל הליבות נמק (איור 3 c). תוצאות אלה הציע כי השקית גז-חדיר סיפק מספיק חמצן אל התרבות.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig3.jpg"> איור 3: חתכי רוחב של אגרגטים בכלי שונים. חתכים בעובי 12 מיקרומטר, התכוננו מדגימות קפוא. הסעיפים היו מוכתמים hematoxylin ואאוזין להמחיש את התאים. () התא אגרגטים גדלו בתרבות המקובלת ההשעיה הראה ליבות עם נמק. אגרגטים תא גדל גם (b) של צלחת בצורת O או (ג) תיק בצורת O הראה נמק מעט מאוד ליבות שלהם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
תא ספירת הראה כי יותר מ-85% מהתאים שרד במשך 5 d תרבות השעיית כל כלי (איור 4a). צפיפות התא האחרון היה כ 1.5-2.0 x 106 תאים למ"ל. למרות שהיה הבדל משמעותי, היחס צמיחה בשקית בצורת O היה גבוה יותר מאשר אלו בכלי אחרים (איור 4b). שיעורי צמיחה ספציפיים של התאים המנה המקובלת, המנה בצורת O ו השק בצורת O בין יום 2 יום 5 היו 0.018 0.025, 0.020 h-1, בהתאמה.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig4.jpg"> איור 4: תא הכדאיות וצמיחה. אלה מראות () תא הכדאיות ו- (b) תא צפיפות של תאים HEK293 בכלי תרבות שונים לאחר 2 d של תרבות (יום 2) ו 5 d של תרבות (יום 5). הערכים המוצגים מייצגים הממוצע של התוצאות של ניסויים עצמאית 3. הערכים עבור ניסוי חושבו מתאי trypan blue מוכתמת החשבת מונה הניתן תא אוטומטית. קווי השגיאה מציינות סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
משלימה איור 1: חרוז הפצה 2 תבניות מאכל שונים בתנאים שונים חזק. לוח זה מציג את התפלגות חרוז בתקופת התנאים השונים חזק (30, 40 ו 45 rpm) תבשיל קונבנציונאלי בצורת O. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/Figure_S1.pdf">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates at JoVE.com

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

כאן אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות כלי בצורת O, התמחה במשך תרבויות השעיה של אגרגטים הסלולר, ברעידות מסלולית. התאים HEK293 גדל בתיק הזה יוצרים יותר אגרגטים הומוגנית מאשר אלה גדל בכלי תרבות קונבנציונלי.

אורביטל טלטול התרבות של תאים בתרבית של צורת O כלי לייצר אגרגטים אחיד

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

שיטה זו מתקדמת מאוד. יש לו את החלוקות של תחום הביוטכנולוגיה כגון הנדסת רקמות, טיפול גרני חינם הקרנת סמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי אגרגטים בגודל אחיד יכול להיות מיוצר פשוט, תרבות השעיה.לוח זה מייצג את האפשרות של כלי בצורת O הרומן לייצור אגרגטים אחידים של תאי יונקים בתרבות המתלים המטלטלת מסלולית. בתרבות הרעידות מסלולית עם כלי שיט קונבנציונליים, הזרימה המעגלית מתרחשת בגלל הכוח הצנטריפוגלי של פני השטח הבינוניים, וזרימה בינונית זו מעבירה תאים לכיוון מרכז-תחתית כלי הדם. אפקט זה ידוע בשם פרדוקס עלי התה של איינשטיין.אפקט זה גורם הצטברות עודפת של תאים במרכז התחתון של התאים ואת הצבירה inhomogeneous. מצד שני, כלי שיט בצורת O מחסלים את אזור המרכז המונע זרימה בינונית של תאים סוחפים לאזור המרכז-תחתון. זה מגביל את הצטברות התאים שיכולים לממש צבירה הומוגנית.התחל עם בקבוק 25 ס"מ מרובע של תאי HEK-293 עבור כל כלי לשבת. נתק את התאים באמצעות פתרון טריפסין-EDTA של 0.25%Trypsin-EDTA ואאסוף תאים באמצעות צנטריפוגה. תן מחדש את גלולת וכתוצאה מכך במיליליטר אחד של מדיום תרבות.סנן את השעיית התא באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרון כדי לאסוף השעיה של תא יחיד. הוסף את טריפאן כחול לאליקוט של ההשעיה של התא ובצע ספירת תאים. ואז להכין 20 מיליליטר של השעיית תא ב 2 פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר.חבר את הכניסה של השקית בצורת O למזרק מהודק 50 מיליליטר ולאחר מכן לנתק את הבוכנה. מנמיכים את מתלי התא המוכנים לשקית בצורת O דרך המזרק המהודק. החלף את מזרק המזרק הראשון במזרק נקי.מוסיפים 55 מיליליטר של אוויר דרך המזרק הנקי כדי להרחיב את התיק לחלוטין. תנפנפי את צינור ההנפה ואז תסגור את היכנסות. לבסוף, להסיר את המהדק מהצינור.הדגירה את התאים בשקית בצורת O עם רעידות ב 45 סל"ד בתנאים של 35 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כדי לשנות את המדיום בתאים, העבר תחילה את מתלי התא לצינור של 50 מיליליטר, דרך המפרצון. ואז צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 200G בטמפרטורת החדר.לאחר שאפו את העל-טבעי, הוסיפו 20 מיליליטר של מדיום תרבותי והשקיעו מחדש את התאים. מוסיפים את התאים המתווסכלים לשקית בצורת O כבעבר ומחזירים את השקית האטומה לאנקובטור הרועד. כדי לאסוף את התאים, להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 50 מיליליטר דרך התוך, כמו קודם.לשטוף את החלק הפנימי של השקית עם 20 מיליליטר של סידן, מגנזיום חינם פוספט מאגר מלוחים ולאחר מכן לנקז את התוכן לתוך צינור כדי לאסוף את התאים הנותרים מהשקית. צנטריפוגה ההשעיה התא שנאסף במשך שלוש דקות ב 200 פעמים G בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשאוף את supernate. מוסיפים 10 מיליליטר של סידן, PBS ללא מגנזיום וצופים באגטים.לאחר צנטריפוגה כמו קודם, להסיר את supernate ולהשאיר את גלולה המכילה את הצבירה. אם נדרשת ספירת תאים, הוסף ארבעה מיליליטר של PBS ומיליליטר אחד של טריפסין לאגרגטים ודגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנטרל את התאים לספירה. מדידות ניסיוניות מראות כי אגרגטים שגדלו בצלחת הקונבנציונלית, היו בקטרים מגוונים לאחר חמישה ימים של רעידות מסלוליות.לעומת זאת, אגרגטים שגדלו במנות או בשקיות בצורת O במשך חמישה ימים, היו בקוטר הרבה יותר אחיד. על פי מדידת הגודל המבוססת על תמונה, תרבות הכלים הקונבנציונלית הראתה שתי פסגות שונות, מה שמצביע על סטייה רחבה של גודל המצטבר. מצד שני, אגרגטים במנות בצורת O ושקיות בצורת O הראו שיא אחד ופחות סטייה בקוטר מאשר אלה במנה הקונבנציונלית, מה שמרמז כי אגרגטים כאלה עשויים להיות באיכות אחידה יותר.Haematoxylin וכתמי אאוסין של חתך צבירה, הראו כי אגרגטים שגדלו בצלחת הקונבנציונלית היו כמה תאים מנוקלים כמובן נמק; עם זאת אגרגטים גדל בכלי בצורת O לא הראו שום כמובן נמק אגרגטים גדל בשקית בצורת O היו גדולים כמו אלה בצלחת קונבנציונאלי. ספירת תאים הראתה שיותר מ-85% מהתאים שרדו במשך חמישה ימים של תרבות השעיה בכל כלי. סרטון זה מדגים כיצד להתמודד עם כלי שיט חדשניים בצורת O לייצור אגרגטים אחידים של תאי יונקים בתרבות השעיה פשוטה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

שילוב של Microstereolithography וElectrospinning כדי לייצר ממברנות מצויד בגומחות להתחדשות קרנית

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

ריאקטורים סיבים חלולים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; תרבות הרקמות היונקת-כמו

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

תצפית מיקרוסקופית מולטיפוטון של כלי רקמת כבד עכבר

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

פלטפורמת טכנולוגיית קוד פתוח לייצור דגמי תרבות תלת-ממדית מבוססי הידרוג'ל באופן אוטומטי ומתוקנן

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...