Name: an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 5 min 40 s
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이 연구는 주식회사 FUKOKU 다카오 요시다 FUKOKU, (주) 문화 O 모양 가방의 아이디어를 제공와 협력에 의해 지원 됩니다. FUKOKU, (주)에서 타 사토 문화 O 모양의 가방을 개발 하기 위한 전산 시뮬레이션 측면에서이 연구를 지원 합니다. 우리는 해당 작가 현재 제휴, 오사카 대학, 우리는 게시 작업을 수 있도록 감사 하 고 싶습니다.

1입니다. 세포와 자료의 준비
<ol><li>1% 비필수 아미노산 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 수정된이 글 중간에 HEK293 세포 배양. 6.8 7.6을 문화 매체의 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>5-7 d 경작 후 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 성 솔루션 (트립 신-EDTA) 세포 분열 하 고 5000-10, 000 셀/c m2에서 셀을 다시 시드하십시오.</li>
</ol>2. 시드 O 모양 가방 셀
<ol><li>1.2 단계에서 설명한 대로 셀을 해리 하 고 문화 매체의 2-5 mL에 그들을 resuspend.</li>
	<li>단일 세포 현 탁 액을 수집 하 셀 스 트레이너 (40 µ m)를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.</li>
	<li>Trypan 푸른 얼룩 및 자동 셀 카운터, 셀의 수를 계산 하 고 셀 서 스 펜 션 (105 셀/mL x 2.0) 20 mL를 준비.</li>
	<li>플런저 없이 채워 50 mL 주사기를 O 모양 가방 (그림 1a)의 입구를 연결 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig1.jpg"> 그림 1: 회로도 이미지와 사진의 O 모양 혈관. (a1) 이것은 O 모양 가방 회로도 이미지 이다. (a2) 이 O 모양 가방 사진입니다. (b1) 이것은 O 모양 접시의 회로도 이미지 이다. (b2) 이것은 O 모양 접시의 그림입니다. O 모양 가방의 외부 및 내부 직경은 90 밀리미터 및 20 밀리미터, 각각. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="5"><li>클램핑 된 주사기를 통해 O 모양 가방에 준비 된 세포 현 탁 액을 플라스틱.</li>
	<li>첫 번째 채워 주사기를 깨끗 한 주사기를 바꿉니다. 가방을 완전히 확장 하려면 깨끗 한 주사기를 통해 깨끗 한 공기의 55 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>입구 튜브 클램프 한 다음 입구를 닫습니다. 마지막으로, 튜브에서 클램프를 제거 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2의 조건에서 45 rpm에서 그들을 흔들어 셀 O 모양 가방에 품 어.</li>
</ol>3. 매체 변경 (선택 사항)
<ol><li>입구를 통해 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.</li>
	<li>실내 온도에, 200 x g에서 2 분 동안 원심 하 고에 상쾌한 발음.</li>
	<li>문화 매체의 20 mL를 추가 하 고 셀을 resuspend.</li>
	<li>다음 단계 2.4-2.7 여 O 모양 가방 resuspended 셀을 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2의 조건에서 45 rpm에서 그들을 흔들어 셀 O 모양 가방에 품 어.</li>
</ol>4. 가방에서 세포 수집
<ol><li>입구를 통해 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.</li>
	<li>칼슘/마그네슘 자유로운 인산 염 버퍼의 20 mL와 가방의 내부 식 염 수 세척 [PBS(-), pH = 7.4-7.6] 다음 내용을 가방에서 나머지를 수집 하는 관으로 배수.</li>
	<li>실내 온도에, 200g x 3 분에 대 한 수집 된 세포 현 탁 액을 원심 하 고에 상쾌한 발음.</li>
	<li>PBS(-)의 10 mL을 추가 하 고 집계를 세척.</li>
	<li>실내 온도에, 200 x g에서 3 분 동안 원심 고 수집 집계 상쾌한 발음.</li>
	<li>4 mL PBS의 고 1 mL의 트립 신을 추가 하 고 계산 (선택 사항)에 대 한 셀을 해리를 37 ° C에서 10 분에 대 한 집계와 함께 그들을 품 어.</li>
</ol>5. (선택 사항) O 모양 요리 준비
주: O 모양 접시의 회로도 이미지 그림 1b 를 참조 하십시오.
<ol><li>뜨거운 칼으로 60 m m 또는 35 mm 접시의 바닥 고 내부 접시로 활용.</li>
	<li>거꾸로 100 mm 접시의 중앙에 60 m m 접시를 넣어. 참고: 가이드 시트 60 mm 접시의 위치를 결정을 도울 수 있다.</li>
	<li>필요한 경우 위에 점도 조정 cyclohexanone는 commissure 60 mm 접시의 안쪽에서.</li>
	<li>O 모양 접시 몇 일 동안 말리 고 감마선 또는 에틸렌 산화물 가스에 의해 소독.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+three-dimensional+suspension+bioreactor+system.">Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).</li><li>Raven, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaled-up+manufacturing+of+recombinant+antibodies+produced+by+plant+cells+in+a+200-L+orbitally-shaken+disposable+bioreactor.">Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Protein+Expression+for+Structural+Biology+in+HEK+293F+Suspension+Cells:+A+Novel+and+Accessible+Approach.">Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).</li><li>Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter+culture:+the+propagation+of+mammalian+cells+in+suspension.">Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension.</a> Science. 164 (3879), 555-557 (1969).</li><li>Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+large-scale+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells.">Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells.</a> Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).</li><li>Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-scaling+single+cell-inoculated+suspension+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).</li><li>Horiguchi, I., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+replacement+with+albumin-associated+lipids+prevents+excess+aggregation+and+enhances+growth+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+suspension+culture.">Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture.</a> Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).</li><li>Sutherland, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+and+differentiation+in+multicellular+spheroids+of+human+colon+carcinoma.">Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma.</a> Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).</li><li>Hang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+fluid+dynamics+modeling+of+an+inverted+frustoconical+shaking+bioreactor+for+mammalian+cell+suspension+culture.">Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).</li><li>Einstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cause+of+the+formation+of+meanders+in+the+courses+of+rivers+annd+of+the+so-called+bear's+law.">The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law.</a> Die Naturwissenschaften. 14, (1926).</li><li>Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Einstein's+tea+leaves+and+pressure+systems+in+the+atmosphere.">Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere.</a> The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).</li><li>Miyamoto, D., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+iPS+cells+is+dependent+on+embryoid+body+size+in+microwell+chip+culture.">Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+cotrolled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Singh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactor+for+cell+culture+using+wave-induced+agitation.">Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation.</a> Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 우리 O 모양 혈관을 개발 하 고 균일 한 집계 형성 및 확장에 대 한 그들의 HEK293 서 스 펜 션 문화를 수행. 기존의 문화 접시에 문화를 떨고는 궤도 유니폼 집계 O 모양 혈관 (그림 1)에서 관찰 하는 반면 집계의 두 개의 다른 직경 생산. 궤도 떨고 조건에 얼룩진된 구슬의 분포의 관찰에 따라 구슬 기존의 문화 접시의 중앙 하단에 모입니다. 그 집회는 아마도 셀 밀도의 다양 한 크기에 선도에 차이 발생 합니다. 또는, 비즈 센터 하단 영역 (보충 그림 1) 없는 O 모양 접시에 배 부 되었다. 이 배포는 아마 O 모양 혈관에 균일 하 게 크기의 집계를 발생합니다. 또 다른-널리-유니폼 집계 생산 접근 microwells에서 경작 하지만이 이렇게 몇 가지 문제가 있다와 같은 집계 microwells13에서 떨어지는 없이 문화 매체를 제공. O 모양 혈관의 경우 균일 한 집계는 간단한 현 탁 액 문화에서 생산 수 있습니다.
문화를 떨고 궤도 포유류 세포에 대 한 활용 대 중 문화 시스템 이다. 흔들된 탱크 생물14, 파 놓 가방15, 같은 포유류 세포의 대량 생산을 위한 다양 한 문화 방법 병을 회전. 궤도 떨고 문화 매체 교 반에 대 한 내부 임 펠 러를 포함 하지 않습니다, 그리고 흔들된 탱크와는 달리 생물. 이 기능은 파 놓 가방과 회전 병 비슷합니다. 이 임 펠 러 무료 문화 체계는 날개를 둘러싼 전단 력에서 세포 손상을 방지 하 고 현 탁 액 문화에서 낮은 전단 응력을 실현 수 있습니다. 특히, 궤도 떨고 문화 시스템은 그들의 높은 확장성과 낮은 전단 응력 때문에 포유류 세포와 같은 중요 한 세포의 대량 생산에 대 한 효과적입니다.
O 모양 혈관의 형성에서 궤도 떨고 문화의 나머지 문제를 개선할 수 있습니다. 궤도 문화 시스템을 떨고, 떠 있는 세포 센터와 "아인슈타인의 차 잎 역설"11라고 그릇의 하단을 마이그레이션합니다. 이 마이그레이션 기존의 궤도 배를 흔들어에 휘도가 집계 및 비균일 집계 생산을 발생 합니다. 이 연구에서 O 모양 혈관 센터-하단에는 혈관의 궤도 떨고 오 모양의 혈관에 균일 한 집계의 원인으로 추측 되는 세포의 농도 방지.
조직학 분석 denucleated 셀 (그림 2a) 전통적인 접시에 집계에 포함 된 것으로 나타났다. 대조적으로, denucleated 세포 O 모양 혈관 (그림 2b 와 2c)에서 집계에 나타나지 않았다. 이 denucleated 세포 포도 당, 글루타민, 및 산소9같은 기판의 부족에 의해 발생 했다 가능 하다. 크기 측정 집계 O 모양 혈관에서 균질 직경 400 µ m 보다 낮은 했다. 대조적으로, 전통적인 접시에서 일부 집계 했다 400 µ m 보다 큰 직경 하 고 이러한 집계 포함 denucleated 셀 키를 누릅니다. 이 결과 집계의 품질 제어에 효과적입니다 오 모양의 혈관에서 동종 크기의 집계를 만드는 제안 합니다. 또한, 그것은 또한 가스 침투성 폴 리 에틸렌 필름을 통해 산소 O 모양 가방에서 denucleated 셀의 모양을 방지 추측 이다.
이러한 실험 유니폼 집계 생성을 위한 간단한 시스템으로 이러한 O 모양 혈관의 가능성을 보여주었다. 서 스 펜 션 문화에 대 한 다른 문화 가방 개발 된15왔다, 하지만 그 문화 부 대는 사각 모양, 어떤 궤도 흔들어 혼합 효과적으로 점점에서 문화를 방지. 이 연구에 가방 모양 균질 크기 집계를 생산 궤도 떨고 적합 라운드 소설이 있다. 혈관의이 특성은 조건 및 대량 생산에 전지의 높은 재현성을 제어 하기 위한 중요 합니다. O 모양 그릇의 가능한 응용 프로그램은 광범위 한. 그것은 줄기 세포를 다룰 때 재생 의학 및 세포에서 재조합 단백질을 생산 하는 경우 사용할 수 있습니다.
결론적으로, 우리가 개발 소설 O 모양 가방 균일 한 셀 집계를 궤도 동요 문화 생산에 적합. 가방 재생 의학에서와 같은 다양 한 생물 의학 응용 프로그램에 대 한 가능성을 보여줍니다.

현 탁 액 셀 문화는에 중요 한 역할 재생 의학1 과 재조합 단백질 생산2 셀 생산 최대 규모 및 10 이상7 셀까지 때로는 높은 세포 밀도 달성 하기 쉽습니다 때문에 / mL5. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포3 인간 미 발달 신장 세포 293 (HEK293)4 현 탁 액 문화에서 재배 하 고 있고 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs) 최근 현 탁 액 문화 시스템에서 재배 되어 재생 치료1,,67. 서 스 펜 션 문화를 사용 하 여 미래에 증가 예정 이다.
현 탁 액 문화에서 일부 셀 라인 단일 세포로 성장 수 없습니다 하 고 집계를 형성 해야 합니다, 따라서. 예를 들어 hPSCs 집계를 형성 하지 않고 정지 조건에서 살아남을 수 없다. 그러나, 집계 된 성장에 대 한 이러한 요구 사항을 균일 한 현 탁 액 문화에 대 한 어려움을 선물 한다. 한 어려움 정지 문화8의 효율성을 결정 하는 문화권의 이른 기간에서 균일 한 집계의 형성 이다. 또 다른 어려움은 집계에 영양분의 대량 전송. 특히, 산소 공급 집계의 최대 크기를 제한 하 고 가난한 산소 공급 집계9의 센터에 괴 사를 발생. 따라서, 세포의 현 탁 액 문화는 더 평범한 현 탁 액 문화 보다 얻기 어렵다. 그럼에도 불구 하 고, 현 탁 액 문화는 중요 한 생물 의학 및 생명 공학 응용 프로그램.
궤도 떨고 배 임 펠 러 동요 없이 문화 매체 혼합물을 달성 하는 가장 간단한 현 탁 액 문화 시스템 중 하나입니다. 임 펠 러 및 동적 중간 흐름에서 전단 응력은 세포 손상 원인과 감 별 법 때문에 서 스 펜 션 문화의 주요 문제 이다. 낮은 전단 응력으로 동요를 위해 연구자 및 산업 궤도 떨고 선박 시스템2,10의 다양 한을 개발 했습니다.
그러나, 기존의 문화 혈관은 문화를 떨고 궤도 설계 되지 않았습니다. 궤도 혈관을 떨고, 셀 "아인슈타인의 차 잎 역설"11, 셀의 휘도가 집계를로 알려진 중간 흐름의 형식에 의해 혈관의 센터 밑 쪽으로 몰리는. 문화 매체와 선박, 사이 마찰과는 원심력으로 인 한 순환 흐름으로 센터11,12셀 스윕. 또한, 대량 문화에 대 한 기존의 문화 가방은 사각형 모양의 궤도 동요에 적합 하지 않습니다.
이 연구에서 우리 문화를 흔들어 하는 궤도 대 한 적합 한 새로운 문화 가방을 개발 했다. 이 가방의 참신 없는 센터 지역 셀 하단 센터 지역에서 집회에서 막힌다 그래서 그것의 O 모양입니다. 우리 또한이 가방 바이오 응용 프로그램의 가능성을 입증 하는 HEK293 문화 이러한 혈관의 처리를 설명 했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">HEK293</td>
			<td style="width:123px;">RIKEN Bio resorce centre</td>
			<td style="width:156px;">RCB1637</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Dulbecco&#39;s PBS (&#8211;)</td>
			<td style="width:123px;">Cell Science &#38; Technology Institute</td>
			<td style="width:156px;">1102P05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td style="width:123px;">CORNING</td>
			<td style="width:156px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50 mL Syringe</td>
			<td style="width:123px;">TERUMO</td>
			<td style="width:156px;">SS-50ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Shaker</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">2-1987-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge Tube 50 mL</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">1-3500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Automated cell counter</td>
			<td style="width:123px;">BioRad</td>
			<td style="width:156px;">TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates

포유류 세포의 현 탁 액 문화는 의료 및 바이오 분야에서 다양 한 응용 프로그램에 필요 합니다. 일회용 가방 기반 방법, 세포의 대량 생산을 위한 가장 간단한 방법 중 하나 이지만 그들은 문화 선박의 하단 중앙에서 수집 하는 때 발생 하는 이상 집계에 대 한 문화를 보호 하지는 않습니다. 이 문제를 해결 하려면 우리 개발 O 모양 접시는 O 모양 가방, 어느 것도 중앙 지역 포함. 집계 중 문화 오 모양의 용기에 재배 현저 하 게 더 획 일 한 크기에 집계 기존의 선박에 성장 보다 있었다. 조직학 분석을 기존의 문화 요리에 집계 했다 가난한 산소 공급에 발생 하는 괴 사 성 코어 포함. 반면, 집계 O 모양 가방, 심지어 그 기존의 문화 요리, 집계에 유사한 직경에서에서 성장 했다 괴 코어를 보여주지 않았다. 이 결과 O 모양 가방 가방 재료의 산소 침투성으로 인해 집계에 충분 한 산소를 제공 합니다 것이 좋습니다. 우리는, 따라서,이 소설 가스 투과성 O 모양의 문화 가방 다양 한 바이오 분야에 있는 필요한 유니폼의 대량 생산에 적합은 제안 합니다.

우리의 측정 집계 전통적인 접시에서 성장 궤도 동요의 5 d 후 직경 변화 했다. 반면, 집계 5 d O 모양 혈관에서 성장 했다 훨씬 더 균일 한 직경. 기존의 요리 문화 문화 O 모양 혈관에 어떤 작은 집계 (그림 2a)을 포함 하지 않은 반면 작은 집계 (50 ~ 200 µ m), 보였다. 이미지 기반 크기 측정에 따라 기존의 요리 문화 집계 크기의 넓은 편차를 나타내는 두 개의 다른 봉우리 (그림 2b1), 보였다. 이 결과 집계 전통적인 접시에서 이기종 셀 품질에서 발생할 수 있는 동일한 문화에서 2 개의 다른 조건 성장 했다 암시. 다른 한편으로, 집계 단일 피크를 보여 O 모양 혈관에 편차 (그림 2b2 와 2b3), 기존의 요리 보다는 직경에서 더 적은 제안 더 균일 한 품질의 이러한 집계 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig2.jpg"> 그림 2: 형태학 및 다양 한 용기에 재배의 직경. O 모양의 접시, 또는 (a3 및 b3)이이 패널 (는) 명시 이미지와 집계는 전통적인 접시 (a2 , b2) 중 하나 (a 1 과 b1)에서 재배의 (b) 히스토그램 표시 O 모양의 가방. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
되며 오신 집계 횡단면의 얼룩 보여주었다 집계 전통적인 접시에서 성장 했다 몇 가지 denucleated 세포와 괴 코어 (그림 3a). 그러나, 집계 O 모양 혈관 성장 (그림 3b 와 3c) 어떤 괴 코어를 보여주지 않았다. 특히, 집계 O 모양 가방에서 성장 했다 전통적인 접시에 그 만큼 큰 아직 어떤 괴 코어 (그림 3c) 하지 않은. 이러한 결과 가스 침투성 가방 문화에 충분 한 산소 공급을 제안 했다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig3.jpg"> 그림 3: 다양 한 선박에 집계의 횡단면. 횡단면 12 µ m 두께 이며 냉동된 샘플에서 준비 했다. 섹션은 hematoxylin와 셀 시각화에 오신 얼룩이 있었다. 재래식 서 스 펜 션 문화에서 성장 하는 (한) 셀 집계 괴 코어를 보여주었다. 셀 집계를 O 모양 접시 또는 (c) O 모양 가방 중 (b)에서 재배 그들의 코어에서 아주 작은 괴 사를 보여주었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
셀 계산의 각 선박 (그림 4a)에 현 탁 액 문화 5 d 셀의 85% 이상 살아 보여주었다. 마지막 셀 밀도 약 1.5-2.0 x 106 셀/mL 이었다. 비록 큰 차이, O 모양 가방에서 성장 비율 (그림 4b) 다른 선박에 비해 더 높은 했다. 기존의 요리, 오 모양 접시에 2 일과 5 일 사이의 O 모양 가방 셀의 특정 성장 속도 각각 0.018, 0.025, 0.020 h-1했다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig4.jpg"> 그림 4: 세포 생존 및 성장. 문화 (주 2)의 2 d 후 다양 한 문화 혈관이이 패널 표시 (한) 셀 생존 및 (b) 세포의 밀도 HEK293 세포와 문화 (5 일)의 5 d. 표시 된 값에서 3 독립적인 실험 결과의 평균을 나타냅니다. 각 실험에 대 한 값은 trypan 블루 스테인드 세포를 자동 셀 카운터 계산에서 계산 했다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1: 다양 한 진동 조건에서 2 다른 접시 형태로 배포 구슬. 이 패널은 전통과 O 모양 접시에 다양 한 진동 조건 (30, 40, 그리고 45 rpm) 동안 구슬 배포를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/Figure_S1.pdf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

여기 선물이 O 모양 배, 궤도 동요와 셀룰러 집계의 현 탁 액 문화에 대 한 전문화를 사용 하기 위한 프로토콜. 이 가방에 성장 HEK293 세포 형성 더 기존의 문화 혈관 성장 보다 균질 집계.

균일 한 골 재를 생산 하 오 모양의 혈관에 포유류 세포의 문화를 떨고는 궤도

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

이 방법은 매우 고급입니다. 조직 공학, 무료 생성 요법 및 약물 스크리닝과 같은 생명 공학 분야의 부서를 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 균일 한 크기 응집체가 간단하고 서스펜션 문화에서 생성 될 수 있다는 것입니다.이 보드는 궤도 흔들림 현탁액 배양에서 포유류 세포의 균일 한 응집체의 생산을위한 새로운 O 자형 선박의 가능성을 나타냅니다. 종래의 선박을 가진 궤도 흔들림 배양에서, 원형 유량은 중간 표면의 원심력 때문에 발생하며, 이러한 중간 유량은 혈관의 중심 바닥으로 세포를 전달한다. 이 효과 아인슈타인 티 잎 역설로 잘 알려져 있다.이 효과는 세포의 중앙 바닥에 있는 세포의 과잉 축적 및 불동성 집계를 일으키는 원인이 됩니다. 한편, O자형 용기는 중간유류를 방지하는 중심 영역을 제거하여 중간-바닥 영역으로 세포를 스위핑한다. 이것은 균질성 응집을 실현할 수 있는 세포의 축적을 제한합니다.각 용기가 앉을 수 있도록 HEK-293 셀의 25 평방 센티미터 플라스크로 시작합니다. 0.25%의 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 분리하고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 배양 배지의 1 밀리리터에서 결과 펠릿을 다시 중단합니다.40 미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 필터링하여 단일 세포 현탁액을 수집합니다. 세포 현탁액의 알리쿼트에 Trypan blue를 추가하고 셀 수를 수행합니다. 그런 다음 밀리리터 당 5 세포에 2 회 10 회 10 에서 세포 현탁액의 20 밀리리터를 준비합니다.O자형 가방의 입구를 50밀리리터 주사기에 연결한 다음 플런저를 분리합니다. 준비된 셀 서스펜션을 고정 주사기를 통해 O자형 가방에 넣습니다. 첫 번째 클램프 주사기를 깨끗한 주사기로 교체합니다.깨끗한 주사기를 통해 55밀리리터의 공기를 추가하여 가방을 완전히 확장합니다. 입구 튜브를 플랩한 다음 입구를 닫습니다. 마지막으로 튜브에서 클램프를 제거합니다.섭씨 35도, 이산화탄소 5%의 조건에서 45rpm에서 흔들리는 O자형 가방에 세포를 배양합니다. 세포내의 배지를 변경하려면 먼저 셀 현탁액을 입구를 통해 50 밀리리터 튜브로 옮는다. 그런 다음 실온에서 200G에서 2 분 동안 원심 분리기.상체를 달아난 후, 배양 배지의 20 밀리리터를 추가하고 세포를 다시 중단합니다. 다시 매달린 셀을 이전과 같이 O 자형 가방에 넣고 밀봉된 가방을 흔들어 있는 인큐베이터에 반품합니다. 세포를 수집하려면 세포 현탁액을 이전과 마찬가지로 유입구를 통해 50 밀리리터 튜브로 옮킨다.20 밀리리터의 칼슘, 마그네슘 프리 인산염 완충식식염으로 가방 내부를 씻은 다음 내용물을 튜브로 배출하여 가방에서 남은 세포를 수집합니다. 수집된 셀 서스펜션을 실온에서 200배 G로 3분간 원심분리한 다음 슈퍼네이트를 흡입합니다. 칼슘 10밀리리터, 마그네슘 프리 PBS를 추가하고 골재를 시청하세요.원심 분리 후, 슈퍼네이트를 제거하고 골재를 포함하는 펠릿을 둡니다. 세포 수가 필요한 경우, PBS의 4 밀리리터와 트립신1밀리리터를 골재에 넣고 37도에서 10분 동안 배양하여 셀을 분리하여 계산에 대한 세포를 해리시합니다. 실험적인 측정에 따르면 종래의 접시에서 자란 골재는 궤도 흔들림에서 5일 후에 직경이 다양했다는 것을 보여줍니다.대조적으로, O 자형 요리 나 가방에서 5 일 동안 재배 된 집계는 훨씬 더 균일 한 직경을 가지고 있었다. 이미지 기반 크기 측정에 따르면, 종래의 접시 배양은 두 개의 상이한 피크를 보였으며, 이는 골재 크기의 폭 넓은 편차를 나타낸다. 한편, O자형 요리와 O자형 가방의 골재는 기존 요리에 비해 직경이 한 개 나 낮아 지름이 적어 균일한 품질이 더 균일할 수 있음을 시사합니다.헤마톡시린과 에신 염색골은 종래의 접시에서 자란 골재가 일부 탈핵세포와 괴사 과정을 가지고 있음을 보여주었지만, O자형 용기에서 자란 골재는 괴사 코스와 O자형 가방에서 재배된 골재가 기존 요리에 비해 크지 않았다. 세포 수는 세포의 85% 이상이 각 용기에서 5일간의 현탁액 배양동안 살아남았다는 것을 보여주었습니다. 이 비디오는 간단한 현탁액 배양에서 포유류 세포의 균일 한 사이트 집계의 생산을위한 새로운 O 자형 혈관을 처리하는 방법을 보여줍니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

연구

생체공학

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

마이크로 광 및 전기 방사의 조합은 각막 재생을위한 틈새를 장착 멤브레인을 생산하는

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

발광 공명 에너지는 포유 동물 세포에 표현 막 단백질의 구조 변화를 연구에 전송

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

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에 대한 중공의 생물 반응<em&gt; 생체</em&gt; -처럼 포유류 조직 문화

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

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<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

마우스 간 조직에서 혈관의 다광 현미경 관찰

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

메카노생물학적 연구를 위한 궤도 셰이커에 6웰 플레이트에서 내피 세포의 분할 성장

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...