Name: an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates at JoVE.com

Bu araştırma FUKOKU, Co, Ltd Takao Yoshida FUKOKU, CO., Ltd. kültür O şeklinde çanta fikir sağlanan ile bir işbirliği tarafından desteklenmektedir. Takamasa Sato FUKOKU, Co, Ltd bu araştırma bir sayısal simülasyon açısından kültür O şeklinde çanta geliştirmek için desteklenen. Biz ilgili yazarın güncel eğilimleri, Osaka Üniversitesi, yayın üzerinde çalışmak için bize izin verdiği için takdir etmek istiyorum.

1. hücre ve malzemelerin hazırlanması
<ol><li>HEK293 hücreleri bir % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 esansiyel olmayan amino asitler ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal ortamda yetiştirmek. PH 6.8 7.6 kültür ortamına ayarlayın.</li>
	<li>5-7 d için kültür sonra % 0.25 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit solüsyonu (tripsin-EDTA) hücrelerle ayırmak ve 5,000-10,000 hücreler/cm2hücreleri reseed.</li>
</ol>2. O şeklinde bir çanta hücrelerde tohumlama
<ol><li>1.2. adımda açıklandığı gibi hücreleri ayırmak ve onları kültür orta 2-5 mL resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon bir tek hücre süspansiyon toplamak için bir hücre süzgeç aracılığıyla (40 µm) filtre.</li>
	<li>Hücreleri trypan mavi boyama ve otomatik hücre sayaç tarafından saymak ve sonra hücre süspansiyon (2.0) 105 hücre/mL x 20 mL hazırlamak.</li>
	<li>O şeklinde çanta (Şekil 1a) giriş klempe 50 mL şırınga bir dalgıç olmadan bağlanmak.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig1.jpg"> Şekil 1: şematik görüntü ve resimleri O şeklindeki damarlarının. (a1) Bu O şeklinde bir çanta şematik bir görüntüdür. (a2) Bu O şeklinde bir çanta bir resmi vardır. (b1) Bu O şeklinde bir yemeğin şematik bir görüntüdür. (b2) Bu bir O şeklindeki yemek bir resmi vardır. O şeklinde çanta dış ve iç çapını are 90 mm ve 20 mm, anılan sıraya göre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="5"><li>Hazırlanan hücre süspansiyon O şekilli torba içine klempe şırınga pipette.</li>
	<li>İlk klempe şırınga temiz bir şırınga ile değiştirin. Temiz hava 55 mL çanta tamamen genişletmek için temiz şırınga ekleyin.</li>
	<li>Giriş tüpü kelepçe ve giriş kapatın. Son olarak, kelepçe tüpünden kaldırın.</li>
	<li>O şeklinde çanta hücrelerde koşullarında CO237 ° C ve %5 45 RPM sallayarak kuluçkaya.</li>
</ol>3. orta değiştirmek (isteğe bağlı)
<ol><li>Hücre süspansiyon koyu bir 50 mL tüp içine aktarın.</li>
	<li>Vasıl 200 x g oda sıcaklığında 2 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>Kültür orta 20 mL ekleyin ve hücreleri resuspend.</li>
	<li>Resuspended hücreleri aşağıdaki adımları 2,4-2,7 tarafından O şeklinde çanta ekleyin.</li>
	<li>O şeklinde çanta hücrelerde koşullarında CO237 ° C ve %5 45 RPM sallayarak kuluçkaya.</li>
</ol>4. toplama hücreleri çantasından
<ol><li>Hücre süspansiyon koyu bir 50 mL tüp içine aktarın.</li>
	<li>Torbanın içi ile tamponlanmış fosfat kalsiyum/magnezyum-ücretsiz 20 mL serum fizyolojik yıkama [PBS(-), pH 7.4 7.6 =] ve sonra çantasından kalan hücreleri toplamak için bir tüp içine içeriği drain.</li>
	<li>Toplanan hücre süspansiyon için 200 x g oda sıcaklığında, 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>PBS(-) 10 mL ekleyin ve agrega yıkayın.</li>
	<li>Onları vasıl 200 x g oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi ve toplamları toplamak için süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>4 mL PBS ve tripsin 1 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de hücreler (isteğe bağlı) sayma için ayırmak için toplamları ile kuluçkaya.</li>
</ol>5. (isteğe bağlı) bir O şeklindeki yemek hazırlanması
Not: Şekil 1b O şeklindeki çanak şematik bir görüntü için bkz.
<ol><li>60 mm veya 35 mm çanak alt sıcak bir bıçak ile kesmek ve iç bir tabak olarak kullanmaktadır.</li>
	<li>60 mm çanak ters 100 mm çanak ortasına koymak. Not: Bir rehber sayfası 60 mm çanak konumunu karar vermek için yardımcı olabilir.</li>
	<li>Gerekirse, viskozite-düzeltilir cyclohexanone 60 mm çanak içeriden komissür koymak.</li>
	<li>O şeklindeki çanak için birkaç gün kuru ve gama ışını veya etilen oksit gaz tarafından sterilize.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+progenitor+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+three-dimensional+suspension+bioreactor+system.">Production of pancreatic progenitor cells from human induced pluripotent stem cells using a three-dimensional suspension bioreactor system.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (11), 3193-3201 (2017).</li><li>Raven, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaled-up+manufacturing+of+recombinant+antibodies+produced+by+plant+cells+in+a+200-L+orbitally-shaken+disposable+bioreactor.">Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (2), 308-321 (2015).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Protein+Expression+for+Structural+Biology+in+HEK+293F+Suspension+Cells:+A+Novel+and+Accessible+Approach.">Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51897 (2014).</li><li>Himmelfarb, P., Thayer, P. S., Martin, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+filter+culture:+the+propagation+of+mammalian+cells+in+suspension.">Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension.</a> Science. 164 (3879), 555-557 (1969).</li><li>Kropp, C., Massai, D., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+large-scale+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells.">Progress and challenges in large-scale expansion of human pluripotent stem cells.</a> Process Biochemistry. 59, 244-254 (2017).</li><li>Singh, H., Mok, P., Balakrishnan, T., Rahmat, S. N. B., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-scaling+single+cell-inoculated+suspension+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Up-scaling single cell-inoculated suspension culture of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 4 (3), 165-179 (2010).</li><li>Horiguchi, I., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+replacement+with+albumin-associated+lipids+prevents+excess+aggregation+and+enhances+growth+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+suspension+culture.">Serum replacement with albumin-associated lipids prevents excess aggregation and enhances growth of induced pluripotent stem cells in suspension culture.</a> Biotechnology Progress. 32 (4), 1009-1016 (2016).</li><li>Sutherland, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygenation+and+differentiation+in+multicellular+spheroids+of+human+colon+carcinoma.">Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma.</a> Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).</li><li>Hang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+fluid+dynamics+modeling+of+an+inverted+frustoconical+shaking+bioreactor+for+mammalian+cell+suspension+culture.">Computational fluid dynamics modeling of an inverted frustoconical shaking bioreactor for mammalian cell suspension culture.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 16 (3), 567-575 (2011).</li><li>Einstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cause+of+the+formation+of+meanders+in+the+courses+of+rivers+annd+of+the+so-called+bear's+law.">The cause of the formation of meanders in the courses of rivers annd of the so-called bear's law.</a> Die Naturwissenschaften. 14, (1926).</li><li>Tandon, A., Dartmouth, U., Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Einstein's+tea+leaves+and+pressure+systems+in+the+atmosphere.">Einstein's tea leaves and pressure systems in the atmosphere.</a> The Physics Teacher. 48, 292-295 (2010).</li><li>Miyamoto, D., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+iPS+cells+is+dependent+on+embryoid+body+size+in+microwell+chip+culture.">Differentiation of mouse iPS cells is dependent on embryoid body size in microwell chip culture.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 122 (4), 507-512 (2016).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+cotrolled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in cotrolled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Singh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactor+for+cell+culture+using+wave-induced+agitation.">Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation.</a> Cytotechnology. 30, 149-158 (1999).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada gemiler O şeklinde geliştirilen ve bir HEK293 süspansiyon kültürü içinde gerçekleştirilen bir üniforma toplamları oluşumu ve genişleme için. Biz O şeklindeki gemiler (Şekil 1) tek tip toplamları gözlenen ise geleneksel kültür tabakta kültür sallayarak bir orbital toplamları, iki farklı çaplarda üretilen. Yörünge sallayarak koşullarında lekeli boncuk dağıtımını gözlem göre boncuk bir geleneksel kültür tabak merkezi-alt toplamak. Bu toplama muhtemelen toplamları çeşitli boyutlarda önde gelen hücre yoğunluğu farklılığı neden oldu. Alternatif olarak, boncuk merkezi-alt bölge (Tamamlayıcı Şekil 1) sahip olmayan O şeklindeki yemeği dağıtıldı. Bu dağıtım muhtemelen O şeklindeki damarlarının birörnek boyutlu toplamları neden olur. Başka bir — yaygın olarak kullanılan — Tekdüzen toplamları üreten yaklaşımdır microwells içinde kültür ama bu yaklaşımın bazı sorunlar gibi dışarı microwells13bırakarak toplamları olmadan bir kültür ortamı sağlamak vardır. O şeklindeki gemiler söz konusu olduğunda, tek tip toplamları bir basit süspansiyon kültürde üretilebilir.
Kültür sallayarak orbital memeli hücreleri için kullanılan bir popüler kültür sistemidir. Karıştırılmış tank biyoreaktör14, dalga işaret etti çanta15, gibi memeli hücrelerinin seri üretim için çeşitli kültür Yöntem vardır ve şişe döner. Yörünge sallayarak kültürler orta karıştırma için bir iç fan dahil değildir, karıştırılmış tank biyoreaktör yapar. Bu özellik, çanta dalga işaret etti ve dönen şişe benzer. Bu fan-Alerjik kültür sistemleri çarklar çevreleyen kesme kuvvetleri hücresel hasarı önlemek ve düşük kesme stres süspansiyon kültürü farkındayız. Özellikle, yörünge sallayarak kültür sistemleri kendi yüksek ölçeklenebilirlik ve düşük kesme stres nedeniyle memeli hücreleri gibi duyarlı hücrelerin seri üretim için etkilidir.
Gemiler O şeklinde yörünge sallayarak kültür toplamları oluşumunda kalan sorunu artırabilir. Kültür sistemleri sallayarak, orbital içinde yüzen hücreleri "Einstein'ın çay yaprak paradoksu"11bilinen gemi, alt ve merkezi göç. Bu inhomogeneous toplama ve düzgün olmayan toplu üretim geleneksel orbital damarları sallayarak neden olabilir. Bu çalışmada, hücre konsantrasyonu dibine Merkezi-hangi Tekdüzen toplama yörünge titreyen O şeklindeki damarlarının nedeni olarak düşünülmektedir gemiler, gemiler O şeklindeki engelledi.
Histolojik analizler geleneksel çanak toplamları denucleated hücrelerin (Şekil 2a) bulunan gösterdi. Buna ek olarak, denucleated hücreleri toplamları O şeklindeki gemiler (Şekil 2b ve 2 c) içinde görünmedi. Bu denucleated hücreleri glikoz, glutamin ve oksijen9gibi yüzeylerde yetersizliğinden kaynaklandığını mümkündür. Boyutu ölçüm göre homojen çapları 400 µm alt toplamları O şeklindeki damarları vardı. Buna ek olarak, geleneksel bir yemek, bazı toplamları 400 µm büyük bir çap vardı ve denucleated hücreleri bu toplamları dahil. Bu sonuç O şeklindeki damarlarının homojen ölçekli toplamları oluşturma toplamları kalite kontrolünde etkili olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda gaz geçirgen polietilen film ile oksijenasyonu O şeklinde çanta içinde denucleated hücrelerinin görünümü engelledi düşünülmektedir.
Bu deneyler bu O şeklindeki gemiler olasılığı Tekdüzen toplamları üretmek için basit bir sistem olarak gösterdi. Diğer kültür çanta süspansiyon kültürü için Gelişmiş15olmasına rağmen o kültür çantaları etkili yörünge sallayarak karışık alıyorum gelen kültür engelleyen kare şeklindeki. Bu çalışmada çantada yuvarlak şekil için yörünge sallayarak homojen bir boyutu olan toplamları üretmek için uygun bir roman var. Bu gemiler koşulları ve hücre içinde yığın üretim yüksek tekrarlanabilirlik denetlemek için önemli özelliğidir. Mümkün O şeklinde geminin yaygın uygulamadır. Rekombinant proteinler hücrelerden ve rejeneratif tıp için kök hücreleri ile uğraşırken üretirken kullanılabilir.
Sonuç olarak, biz bir roman O şeklinde çanta bir yörünge sallayarak kültürü ile tek tip hücre toplamları üretmek için uygun geliştirilmiştir. Çanta gibi çeşitli Biyomedikal uygulamaları için olanaklar içinde rejeneratif tıp gösterir.

Süspansiyon hücre kültürü bir önemli rol oynar rejeneratif tıp1 ve Rekombinant protein üretim2 hücre üretimi büyütmek ve bazen 10'dan fazla7 hücre kadar yüksek hücre yoğunluğu elde etmek kolaydır çünkü / mL5. Çin hamster Over (CHO)3 hücreleri ve insan embriyonik böbrek hücreleri 293 (HEK293)4 süspansiyon kültüründe yetiştirilen ve insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için süspansiyon kültür sistemlerindeki büyümüş son zamanlarda yeniden üretim terapiler1,6,7. Süspansiyon kültürler kullanımı gelecekte artması beklenmektedir.
Süspansiyon kültür, bazı hücre hatları tek hücreler olarak büyümek değil ve bu nedenle, toplamları oluşturması gerekir. Örneğin, hPSCs süspansiyon koşullarda toplamları kurma olmadan hayatta kalamaz. Ancak, bu gereksinim için toplanan büyüme tek tip süspansiyon kültürler için zorluklar sunar. Bir zorluk süspansiyon kültür8verimliliğini belirler ve kültürünün erken dönemde Tekdüzen toplamları oluşumdur. Başka bir zorluk içine toplamaları besinlerin kitle Transfer'dir. Özellikle, oksijen kaynağı toplamları en büyük boyutunu sınırlar ve zavallı bir oksijen nekroz toplamları9ortasında neden olur. Sonuç olarak, hücre toplamları kültürleri süspansiyon daha geleneksel süspansiyon kültürleri elde etmek zordur. Yine de, süspansiyon kültürler için çok önemlidir biyomedikal ve biyoteknoloji uygulamaları.
Yörünge sallayarak damarları kültür orta karışımları fan ajitasyon olmadan elde basit süspansiyon kültür sistemleri biridir. Hücre hasarı ve farklılaşma neden olur çünkü kesme stres fan ve dinamik orta akış süspansiyon kültürünün önemli sorundur. Ajitasyon daha düşük bir makaslama stres ile elde etmek için araştırmacılar ve Sanayi yörünge sallayarak geminin sistemleri2,10çeşitli geliştirdik.
Ancak, geleneksel kültür damarları kültürler sallayarak orbital için tasarlanmamıştır. Damarları sallayarak, orbital içinde hücre hücre inhomogeneous toplama neden "Einstein'ın çay yaprak paradoksu"11, bilinen orta akış türüne göre gemilerin merkezi-dibe doğru çekilmek. Dairesel akış merkezkaç kuvveti ve kültür orta ve bir gemi arasında sürtünme nedeniyle, hücre merkezi11,12süpürür. Buna ek olarak, geleneksel kültür çanta kitle kültürü için kare şeklinde, hangi yörünge sallayarak için uygun değildir.
Bu çalışmada, kültürler sallayarak orbital için uygun bir roman kültür çanta geliştirdik. Bu çanta yenilik hücre alt merkezi bölge toplantıda engellenir bu yüzden Merkezi bölge yok onun O şekli olmasıdır. Biz de bu gemi biyoteknolojik uygulamaları için bu çanta olasılığını göstermek için bir HEK293 kültür ile işlenmesi göstermiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">HEK293</td>
			<td style="width:123px;">RIKEN Bio resorce centre</td>
			<td style="width:156px;">RCB1637</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11995040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:156px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Dulbecco&#39;s PBS (&#8211;)</td>
			<td style="width:123px;">Cell Science &#38; Technology Institute</td>
			<td style="width:156px;">1102P05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td style="width:123px;">CORNING</td>
			<td style="width:156px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50 mL Syringe</td>
			<td style="width:123px;">TERUMO</td>
			<td style="width:156px;">SS-50ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Shaker</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">2-1987-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Centrifuge Tube 50 mL</td>
			<td style="width:123px;">AS ONE</td>
			<td style="width:156px;">1-3500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Automated cell counter</td>
			<td style="width:123px;">BioRad</td>
			<td style="width:156px;">TC20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orbital shaking culture of mammalian cells in o-shaped vessels to produce uniform aggregates

Memeli hücre toplamları kültürleri süspansiyon tıbbi ve biyoteknolojik alanlarında çeşitli uygulamalar için gereklidir. Tek kullanımlık poşet tabanlı yöntemi bir hücresel toplamları seri üretim için basit teknikleri, ancak kültür kültür gemi alt ortasına de toplanıp oluşan aşırı toplama karşı koruma sağlamaz. Bu sorunu çözmek için O şeklinde bir çanak ve ikisi de bir merkez bölgesi içeren bir O şeklinde çanta geliştirdi. Ya O şeklindeki kültür gemi yetiştirilen toplamları boyutunda belirgin bir şekilde daha düzgün daha geleneksel damarlarının yetiştirilen toplamları. Histolojik analizler bu geleneksel kültür yemekleri toplar gösterdi nekrotik çekirdek büyük olasılıkla bir zavallı oksijen kaynağı tarafından neden olduğu yer. Buna ek olarak, O şeklinde çanta, hatta geleneksel kültür yemekleri, toplamları için benzer çaplarda yetiştirilmiştir toplamları nekrotik çekirdek belli etmedi. Bu sonuçlar O şeklinde çanta çanta malzeme oksijen geçirgenliği nedeniyle toplamları için yeterli oksijen sağlar öneririz. Biz, bu nedenle, bu roman gaz geçirgen O şeklindeki kültür çanta çeşitli biyoteknolojik alanlarında gerekli olan üniforma toplamları seri üretim için uygundur öneriyoruz.

Bizim ölçümlerine göre geleneksel çanak içinde yetişen toplamları yörünge sallayarak 5 d sonra çapları farklı. Buna ek olarak, O şeklindeki kapları 5 d yetiştirilen toplamları çok daha Tekdüzen çapları vardı. O şeklindeki damarları kültürde herhangi bir küçük toplamları (Şekil 2a) içermiyor, ancak geleneksel çanak kültür küçük toplamları (50-200 µm), gösterdi. Yansıma tabanlı boyutu ölçüm göre toplam boyutu geniş bir sapma gösteren iki farklı tepeler (Şekil 2b1), geleneksel yemek kültürü gösterdi. Bu sonuç geleneksel çanak toplamları türdeş olmayan hücre kalitesine neden aynı kültür, iki farklı koşullarda büyüyen edildi ima etti. Öte yandan, toplamları tek bir tepe gösterdi O şeklindeki gemiler ve daha az sapma daha fazla olan (2b şekil2 ve 2b3), geleneksel çanak çapı böyle toplamları-ebilmek var olmak daha fazla Tekdüzen kalitesini öne.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig2.jpg"> Şekil 2: türleri Morfoloji ve çapları toplamları çeşitli damarlarının büyüdü. Bu paneller bir O şeklindeki yemek, veya (a3 ve b3) (bir) aydınlık alan görüntüleri ve (b) çubuk ya (a1 ve b1) bir geleneksel yemek, (a2 b2) yetiştirilen ve toplamları göstermek O şeklinde bir çanta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Hematoksilen ve eozin toplam kesit boyama toplamları geleneksel çanak içinde yetişen bazı denucleated hücreleri ve nekrotik çekirdek (Şekil 3a) olduğunu göstermiştir. Ancak, O şeklindeki damarlarının yetiştirilen toplamları çürümüş herhangi bir çekirdek (Şekil 3b ve 3 c) belli etmedi. Özellikle, O şeklinde çanta içinde yetiştirilen toplamları bu geleneksel tabak büyüklüğünde henüz çürümüş herhangi bir çekirdek (Şekil 3 c) yoktu. Bu sonuçlar gaz geçirgen çanta yeterince oksijen kültürüne sağlanan önerdi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig3.jpg"> Şekil 3: kesit toplamları çeşitli damarlarının. Kesit 12 µm kalınlığında ve donmuş numuneler hazırlanmış edildi. Bölümleri Hematoksilen ve eozin hücreleri görselleştirmek için ile lekeli. geleneksel süspansiyon kültüründe yetiştirilen (bir) hücre toplamları nekrotik çekirdek gösterdi. Hücre toplamları büyümek ya da (b) bir çanak O şeklinde ya da (c) O şeklinde bir çanta onların göbek çok az nekroz gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Hücre sayımları hücreleri % 85'den fazla her araç (4a rakam) süspansiyon kültürünün 5 d için hayatta kaldığını gösterdi. Son hücre yoğunluğu yaklaşık 1.5-2.0 x 106 hücre/mL yapıldı. Anlamlı bir fark olsa da, O şeklinde çanta içinde büyüme oranı daha fazla diğer gemileri (Şekil 4b) olan daha yüksek. Geleneksel yemek, O şeklindeki çanak ve 2 gün ve 5 gün arasında O şeklinde çanta hücrelerde belirli büyüme oranları 0,018, 0,025 ve 0,020 h-1, sırasıyla idi.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57922/57922fig4.jpg"> Şekil 4: hücre canlılığı ve büyüme. Bu paneller (bir) hücre canlılığı ve (b) hücre yoğunluğu HEK293 hücrelerin çeşitli kültür damarlarının 2 d Kültür (2 gün) sonra göster ve 5 d Kültür (5 gün). Gösterilen değerler 3 bağımsız deney sonuçları ortalamasını temsil eder. Her deneme için değerleri olan bir otomatik hücre sayaç sayılan trypan mavi lekeli hücreleri hesaplanır. Hata çubukları standart sapma gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/57922fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı Şekil 1: boncuk dağıtım çeşitli sallayarak koşullarda 2 farklı yemek biçimlerde. Bu panel boncuk dağıtım sırasında çeşitli sallayarak koşullar (30, 40 ve 45 rpm) geleneksel ve O şeklinde bir tabak gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57922/Figure_S1.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates at JoVE.com

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Burada yörünge sallayarak ile hücresel toplamları kültürleri süspansiyon için özel gemiler, O şeklinde kullanmak için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çantanın içinde yetiştirilen HEK293 hücreleri daha fazla form bu geleneksel kültür damarlarının yetiştirilen daha homojen toplamları.

Memeli hücre kültür Tekdüzen toplamları üretmek için O şeklindeki damarlarının sallayarak bir Orbital

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Bu yöntem çok gelişmiştir. Doku mühendisliği, serbest generatif terapi ve ilaç taraması gibi biyoteknoloji alanında bölümlere sahiptir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek düze boyuttaa agregaların basit, süspansiyon kültüründe üretilebiliyor olmasıdır.Bu tahta yörüngesel sallayarak süspansiyon kültüründe memeli hücrelerinin tek tip agrega üretimi için roman O-şekilli damarların olasılığını temsil eder. Konvansiyonel gemilerle orbital sallayarak kültürde, dairesel akış orta yüzeyin santrifüj kuvvet nedeniyle oluşur, ve bu orta akış damarların merkez-alt doğru hücreleri aktarır. Bu etki iyi Einsteins çay yaprağı paradoksu olarak bilinir.Bu etki hücrelerin merkez-alt ve homojen toplama hücrelerin aşırı birikimine neden olur. Öte yandan, O-şekilli damarlar orta-alt bölgeye orta akım süpürme hücreleri önler merkezi bölge ortadan kaldırır. Bu homojen toplama gerçekleştirebilirsiniz hücrelerin birikimini sınırlar.Oturtulacak her bir kap için 25 santimetre karelik hek-293 hücreleri ile başlayın. %0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanarak hücreleri ayrıştırın ve santrifüj yoluyla hücreleri toplayın. Ortaya çıkan peleti bir mililitre kültür ortamında yeniden askıya alın.Tek hücreli süspansiyon toplamak için hücre süspansiyonuna 40 mikronluk bir süzgeçten süzün. Hücre süspansiyonunun bir aliquot'una Trypan mavisi ekleyin ve hücre sayısını gerçekleştirin. Daha sonra 2 kez 10 mililitre mililitre lik hücre süspansiyonu hazırlayın.O şeklindeki çantanın girişini kelepçeli 50 mililitreşile bağlayın ve sonra pistonu ayırın. Hazırlanan hücre süspansiyonuna kenetlenmiş şırınga aracılığıyla O şeklindeki torbaya indirin. İlk kelepçe şırıngasını temiz bir şırıngayla değiştirin.Tamamen çanta genişletmek için temiz şırınga ile hava 55 mililitre ekleyin. Giriş tüpünü çırpın ve girişi kapatın. Son olarak, kelepçeyi tüpten çıkarın.35 santigrat derece ve% 5 karbondioksit koşullarında 45 rpm sallayarak O-şekilli torbadaki hücreleri kuluçka. Hücrelerdeki ortamı değiştirmek için, önce hücre süspansiyonuna giriş yoluyla 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Sonra oda sıcaklığında 200G iki dakika santrifüj.Supernatant aspirating sonra, kültür orta 20 mililitre ekleyin ve hücreleri yeniden askıya. Daha önce olduğu gibi O-şekilli torbaya resuspended hücreleri ekleyin ve sallayarak inkübatör için mühürlü çanta dönmek. Hücreleri toplamak için, daha önce olduğu gibi, giriş yoluyla 50 mililitrelik bir tüp içine hücre süspansiyon aktarın.Kalsiyum 20 mililitre ile çantanın içini yıkayın, magnezyum içermeyen fosfat-tamponlu tuzlu ve sonra torbadan kalan hücreleri toplamak için bir tüp içine içeriğini drenaj. Toplanan hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında 200 kat G'de üç dakika santrifüj edin ve sonra süperat aspire edin. Kalsiyum 10 mililitre ekleyin, magnezyumsuz PBS ve agregaları izleyin.Daha önce olduğu gibi santrifüj sonra, supernate çıkarın ve agregalar içeren pelet bırakın. Hücre sayısı gerekiyorsa, dört mililitre PBS ve bir mililitre Trypsin ekleyin ve hücreleri saymak için ayrıştırmak için 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Deneysel ölçümler, konvansiyonel çanak yetiştirilen agregalar, orbital sallayarak beş gün sonra çeşitli çapları olduğunu göstermektedir.Buna karşılık, agregalar O-şekilli yemekler veya çanta beş gün boyunca yetiştirilen, çok daha düzgün çapları vardı. Görüntü tabanlı boyut ölçümüne göre, geleneksel çanak kültürü iki farklı zirve göstererek toplam boyutunda geniş bir sapma olduğunu göstermiştir. Öte yandan, O-şekilli tabaklar ve O-şekilli torbalarda agregalar, bu tür agregalar daha düzgün kalitede olabileceğini düşündüren, geleneksel çanak daha tek bir tepe ve çapı daha az sapma gösterdi.Agrega kesitlerinin hematoksilin ve eozin boyaması, konvansiyonel çanakta yetişen agregaların bazı nükleoz hücrelere ve nekrotik seyretlere sahip olduğunu gösterdi;ancak O-şekilli damarlarda yetiştirilen agregalar herhangi bir nekrotik seyretmedi ve O şekilli torbada yetiştirilen agregalar geleneksel çanaktakiler kadar büyüktü. Hücre sayımları, hücrelerin %85'inden fazlasının her bir kapta beş günlük süspansiyon kültürü boyunca hayatta kaldığını gösterdi. Bu video basit süspansiyon kültüründe memeli hücrelerinin tek tip site agregaları üretimi için yeni O-şekilli damarları işlemek için nasıl gösterir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Microstereolithography ve ELEKTROÜRETİM kombinasyonu Kornea Yenilenme Nişli ile donatılmış Membranlarını Üretiliyor

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

için içi boş fiber Biyoreaktörler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Benzeri Memeli Doku Kültürü

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

Fare Karaciğer Dokusunda Damarların Multifotoğraf Mikroskobik Gözlemi

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Hidrojel Tabanlı 3D Kültür Modellerini Otomatik ve StandartLaştırılmış Bir Şekilde Üretecek Açık Kaynaklı Bir Teknoloji Platformu

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Mechanobiyolojik Çalışmalar için Orbital Çalkalayıcıda Endotel Hücrelerinin 6 Kuyu Plakalarında Parçalanması

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...