Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) per H-JZ. TMBW è un destinatario di un premio post-laurea in Australia dal governo australiano e la borsa di studio Top-Up di Henderson Ann da Australian Rotary Health in partner con Rotary di Templestowe e Dine per una cura.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Università di Melbourne animale comitato etico.
Nota: Il protocollo di sequenza, di costruzione e di generazione per il adenoviral file vettoriale pAnnuncio-CMV-Td-Tom, pAnnuncio-CMV-GFP e pAnnuncio-CAGA12- Luc/Td-Tom sono stati descritti in precedenza11,12, 13. Tutti i vettori sono disponibili in com...

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	<li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines.">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li><li>Xu, L., Chen, Y. 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C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li><li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li><li>Luwor, R. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Stat3+and+Smad7+to+restore+TGF-beta+cytostatic+regulation+of+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo.</a> Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Method+of+Estimating+Fifty+Per+Cent+Endpoints.">A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. 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K., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-induced+nuclear+localization+of+Smad2+and+Smad3+in+Smad4+null+cancer+cell+lines.">TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines.</a> Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-generation+adenovirus+vectors.">Second-generation adenovirus vectors.</a> Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).</li><li>Durham, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+replication-defective+adenoviral+recombinants+in+dissociated+cultures+of+nervous+tissue.">Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue.</a> Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).</li><li>MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells:+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture.">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li><li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+wild-type+contamination+in+a+recombinant+adenoviral+preparation+by+PCR.">Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR.</a> Biotechniques. 18, 444-447 (1995).</li><li>Choi, Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+vaccine+applications.">Viral vectors for vaccine applications.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).</li><li>de Cassan, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus.">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li><li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling.">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388 (2014).</li></ol>

Abbiamo sviluppato una tecnica per consentire per l'imaging in tempo reale di segnalazione di TGF-β/Smad3 in singole cellule vive. Utilizzando questo metodo novello, precedentemente abbiamo identificato una sottopopolazione di cellule con attività trascrizionale TGF-β/Smad3 dinamica che è stata associata con una maggiore invasione e migrazione8. Questo metodo migliora le analisi tradizionali per la segnalazione di TGF-β, quali macchie occidentali di fosforilazione Smad3 e TGF-β mirati di esp...

Fattore di crescita trasformante β (TGF-β) è una citochina essenziale implicata nello sviluppo umano che segnala attraverso un heterodimeric complesso composto di tipo II e tipo I recettori1. Associazione al tipo di recettore II risultati nel reclutamento e fosforilazione di tipo ricevitore, che a sua volta fosforila a valle Smad2/3 proteine2,3. Questi attivati Smad2/3 proteine legano al Smad4, formando un complesso che trasloca nel nucleo e regola gene trascrizione4. Condizioni omeostatiche TGF-β/Smad signaling è strettamente regolato; Tuttavia, in molte malattie, la via di segnalazione è liberalizzata e spesso sovraespresso leader alla progressione di malattia5,6,7. Studi recenti hanno dimostrato che la risposta cellulare a TGF-β è eterogenea e sottopopolazioni di cellule attive di TGF-β/Smad sono responsabili di funzione biologica in un modo dipendente dal tempo8,9. Analisi cellulare comune di segnalazione di TGF-β/Smad prevede l'utilizzo di analisi di endpoint fisso che offrono solo una panoramica dell'attività cellulare e spesso quantificare il medio di effetto di TGF-β/Smad10. Questi metodi, tuttavia, non possono rappresentare con precisione i comportamenti molecolari di segnalazione di TGF-β/Smad nello stato fisiologico durante la progressione di malattia. Analisi basata su immagine di cellule vive, che cattura la dinamica dei processi biologici e cellulari con entrambi una comprensione spaziale e temporale.
Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo di alto-rendimento sensibile per l'imaging di cellule vive di TGF-β/Smad segnalazione utilizzando reagenti a base dell'adenovirus. Qui, abbiamo infettato la linea cellulare di cancro al seno umane MDA-MB-231 con un adenovirus che esprimono la sequenza di binding motif Smad3 CAGA e luciferasi (Luc) o gene reporter Td-pomodoro (Td-Tom). Sistemi reporter adenoviral forniscono un metodo rapido ed economico per introduzione di plasmide che può provocare un tasso di infezione del 100% in linee cellulari del cancro. Sistemi reporter adenoviral sono inoltre stati applicati con successo a linee cellulari che sono difficili a transfect con convenzionale plasmide11. In questo protocollo descriveremo un processo riproducibile e non invadente per ottenere immagini di cellule vive del pathway di segnalazione del TGFβ/Smad sia in vivo che in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1881024</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Scientifix Life</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td>Heat inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33258</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>5117</td>
			<td>Dilute in to PBS to make final concentration at 1 &#956;L/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Reporter Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>197897</td>
			<td>Dilute 5x in PBS before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>9100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast fluorescence microscopy</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGl Luciferin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Diltue to 0.05% (1x) in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E153A</td>
			<td>Dilute to 1x in DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R70507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRKDC-SCID</td>
			<td>Animal Resources Centre</td>
			<td>SCIDF6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chem-supply</td>
			<td>EA043-10L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Night Time</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>1750D</td>
			<td>Lubricating Eye Ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS-DMEM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% heat inactivated FBS; 10 &#956;g/mL penicillin; 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of the tgf-	&beta;/smad3 signaling pathway in vitro and in vivo using an adenovirus reporter system

Trasformando la segnalazione di fattore di crescita β (TGF-β) regola molte funzioni importanti richieste per l'omeostasi cellulare e si trova comunemente sovraespresso in molte malattie, compreso il cancro. TGF-β è fortemente implicata nella metastasi durante la progressione di cancro fase tarda, attivando un sottoinsieme delle cellule del tumore di migratori e invasivo. Attuali metodi per l'analisi dei percorsi di segnalazione concentrano su modelli di endpoint, che spesso tentano di misurare segnalazione post-hoc dell'evento biologico e non riflettono la natura progressiva della malattia. Qui, dimostriamo un romanzo dell'adenovirus reporter sistema specifico per la via di segnalazione di TGF-β/Smad3 che può rilevare l'attivazione trascrizionale in cellule vive. Utilizzando un reporter di Annuncio-CAGA12-Td-Tom , possiamo ottenere un tasso di infezione del 100% delle cellule MDA-MB-231 entro 24 h in vitro. L'uso di un reporter fluorescente permette per l'imaging delle cellule vive sola in tempo reale con identificazione diretta delle cellule trascrizionalmente attive. Stimolazione delle cellule infettate con TGF-β Visualizza solo un sottoinsieme delle cellule che sono trascrizionalmente attivi e coinvolti in funzioni biologiche specifiche. Questo approccio permette elevata specificità e sensibilità a livello di singola cellula per migliorare la comprensione delle funzioni biologiche legate alla TGF-β segnalazione in vitro. Smad3 attività trascrizionale può anche essere segnalato in vivo in tempo reale attraverso l'applicazione di un annuncio-CAGA12- Luc reporter. Annuncio-CAGA12- Luc può essere misurata nello stesso modo come linee cellulari tradizionali stabilmente trasfettate luciferasi. Smad3 attività trascrizionale di cellule impiantate in vivo può essere analizzata attraverso l'imaging convenzionale IVIS e monitorati dal vivo durante la progressione tumorale, fornendo una visione unica delle dinamiche del pathway di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo descrive un sistema di consegna reporter vantaggioso permettendo per rapido ad alta produttività imaging delle vie di segnalazione delle cellule dal vivo sia in vitro che in vivo. Questo metodo può essere espansa a una gamma di analisi di immagine basata e presenta come un approccio sensibile e riproducibile per biologia di base e sviluppo terapeutico.

Vivere la singola cella imaging in vitro
Per valutare con precisione l'attivazione di segnalazione di TGF-β/Smad in singole cellule utilizzando reagenti dell'adenovirus basato, è importante determinare innanzitutto la molteplicità ottimale di infezione (MOI) per ogni linea cellulare. Il MOI ottimo è determinato quando il 100% delle cellule sono positivi per l'infezione adenoviral con gli effetti citopatici o citotossic...

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Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging del TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro e In Vivo utilizzando un sistema di Reporter dell'Adenovirus

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging di cellule vive di attività di segnalazione di TGF-β/Smad3 utilizzando un sistema di reporter dell'adenovirus. Questo sistema tiene traccia di attività trascrizionale in tempo reale e può essere applicato a entrambi singole cellule in vitro e nell'animale vivomodelli.

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

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In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caratterizzare i mutanti correlati alla malattia di RAF Family Kinases utilizzando una serie di metodi pratici e fattibili

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Creazione di una linea cellulare di cancro di Murine geneticamente ingegnerizzato e collo utilizzando un sistema Adeno-Associated Virus-Cas9

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...