この作品は H JZ に国立保健医療研究審議会 (NHMRC) からの助成金によって支えられました。TMBW は、Templestowe ロータリーと治療のための食事のパートナーにオーストラリア政府からオーストラリア大学院賞、オーストラリアのロータリー健康からアン ヘンダーソン トップアップ奨学金の受信者であります。

すべての動物実験は、メルボルンの動物倫理委員会の大学によって承認されました。
注: シーケンス、建設、世代プロトコル、アデノ ウイルスのベクトル p広告 CMV Td トム、p広告 CMV GFPと p広告 CAGA12- リュック ・/Td-トム前述11,12となっています。 13。すべてのベクトルが市?...

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus.">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li><li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. 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TGF-β/Smad3 は単一生細胞におけるシグナル伝達のリアルタイム イメージングを可能にする技術を開発しました。この手法を使用すると、動的の TGF-β/Smad3 転写活性強化された侵入および移行8に関連付けられていたと以前セルのサブ人口を同定しました。このメソッドが TGF-β シグナル、Smad3 リン酸化の西部のしみなどの伝統的なアッセイに向上し、TGF-β は、不均一性をキャ?...

トランスフォーミング増殖因子 β (TGF-β) は、信号をヘテロ二量体複合体 II 型を介して人間の開発に関与している重要なサイトカイン受容体1型します。募集およびタイプのリン酸化のタイプ II の受容体に結合結果 I 受容体は、順番に下流 Smad2/3 タンパク質2,3を廃止します。これらは核に移行し、4遺伝子の転写を調節する複合体を形作る Smad4 へ Smad2/3 蛋白質のバインドを活性化。TGF-β/Smad の恒常条件下で信号が堅く調整される;ただし、多くの病気のシグナル伝達経路は自由化は、しばしば病5,6、7の進行につながる過剰に発現します。最近の研究は、TGF β 細胞応答が異種 TGF-β/Smad アクティブな細胞の集団は、時間依存的8,9の生物学的機能を実証しています。TGF-β/Smad シグナリングの一般的な細胞解析は、細胞の活動のスナップショットのみを提供し、しばしば平均 TGF-β/Smad 効果10量的に表わす固定エンドポイント アッセイの使用を含みます。これらのメソッドは、ただし、可能性があります正確に表していない TGF-β/Smad は病気の進行時生理状態の伝達の分子の挙動。生きているセルのイメージ ベース解析は、時空の理解の両方の細胞および生物学的プロセスのダイナミクスをキャプチャします。
私たちの目標は、TGF-β/Smad アデノ ウイルス ベースの試薬を用いるシグナリングの生きているセルイメージ投射のための高感度ハイスループット法を開発することでした。ここでは、我々 感染ひと乳癌癌セルライン MDA MB 231 Smad3 CAGA モチーフ バインド シーケンスとルシフェラーゼ (リュック) または Td トマト (Td トム) レポーターの遺伝子を表現するアデノ ウイルス。アデノ ウイルス レポーター システムは、癌細胞株における 100% 感染率につながるプラスミド導入クイックで安価な方法を提供します。アデノ ウイルス レポーター系も正常に従来のプラスミド11transfect に困難細胞に適用されています。このプロトコルでは TGFβ/Smad のシグナル伝達経路の生きているセルイメージ投射を達成するために、再現性と非侵襲的プロセスを述べる体内と体外の両方。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1881024</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Scientifix Life</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td>Heat inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33258</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>5117</td>
			<td>Dilute in to PBS to make final concentration at 1 &#956;L/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Reporter Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>197897</td>
			<td>Dilute 5x in PBS before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>9100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast fluorescence microscopy</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGl Luciferin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Diltue to 0.05% (1x) in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E153A</td>
			<td>Dilute to 1x in DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R70507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRKDC-SCID</td>
			<td>Animal Resources Centre</td>
			<td>SCIDF6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chem-supply</td>
			<td>EA043-10L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Night Time</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>1750D</td>
			<td>Lubricating Eye Ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS-DMEM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% heat inactivated FBS; 10 &#956;g/mL penicillin; 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of the tgf-	&beta;/smad3 signaling pathway in vitro and in vivo using an adenovirus reporter system

増殖因子 β (TGF-β) シグナル変換生体のホメオスタシスに必要な多くの重要な機能を調節して、一般的に発見がんなど多くの疾患で過剰に発現します。TGF β が強く関与している転移の遅段階の癌の進行中に渡り鳥や侵襲性の腫瘍細胞のサブセットをアクティブにします。シグナル伝達経路解析のための現在の方法はしばしば生物学的イベントのシグナリング事後を測定しようとし、病気の進歩的な性質を反映していないエンドポイント モデルに焦点を当てます。ここでは、TGF-β/Smad3 シグナリングパス生細胞における転写活性化を検出するための新規アデノ ウイルス レポーター システム固有を示します。広告 CAGA12-Td トム記者を活用し、24 時間体外内の MDA MB 231 セルの 100% 感染率を実現できます。蛍光レポーターの使用により、活単一細胞のイメージングの転写活性状態の細胞の直接同定とリアルタイム。TGF-β と感染細胞の刺激が転写活性アクティブで、特定の生物学的機能に関与する細胞のサブセットのみが表示されます。このアプローチは高い特異性と単一細胞レベルでの感度の TGF-β シグナリング体外に関連する生物学的機能の理解を高めることできます。Smad3 転写活性することができます報告体内でリアルタイムのアプリケーションを介して、広告 CAGA12- リュック ・記者。広告 CAGA12- リュック伝統的な固定して transfected ルシフェラーゼの細胞と同じ方法で測定することができます。Smad3体内移植細胞の転写活性は従来の IVIS イメージングによる解析でき、TGF-β シグナル伝達経路のダイナミクスにユニークな洞察力を提供すること、腫瘍の進行中にライブ モニターします。我々 のプロトコルを記述する生きている細胞のシグナル伝達経路のクイック高速イメージングを可能にする有利な記者配信システムの in vitroとin vivoの両方。このメソッドは、イメージ ベースのアッセイや基礎生物学と治療開発のため高感度で再現性のあるアプローチとして提示の範囲に拡張できます。

単一細胞の in vitroイメージングをライブします。
TGF-β/Smad 基づくアデノ ウイルス試薬を用いた単一細胞におけるシグナル伝達の活性化を正確に評価するには、まず、最適な多重度の感染症 (MOI) の各セルの行を調べることが重要です。最適な MOI は、細胞の 100% がない存在の細胞変性または細胞毒性効果を持つアデノ ...

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Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノ ウイルス レポーター システムを使用しての細胞イメージングをライブします。

ここでは、TGF-β/Smad3 シグナル伝達活性アデノ ウイルス レポーター システムを使用しての生きているセルイメージ投射のためのプロトコルを提案する.このシステムはリアルタイムで転写活性を追跡し、両方単一細胞の in vitroおよび生きている動物に適用できますモデル。

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

放射性核種蛍光レポーターの遺伝子齧歯動物腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡するイメージング

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

信号経路活性ルシフェラーゼ ベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオ センサーを用いたカバを監視

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

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Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノ ウイルス レポーター システムを使用しての細胞イメージングをライブします。

TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノウイルスレポーターシステムを使用しての細胞イメージングをライブします。