이 작품은 H JZ를 국가 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. TMBW는 Templestowe 로타리와 치료에 대 한 식사 파트너에 호주 정부에서 오스트레일리아 대학원 포상 및 호주 로타리 건강에서 앤 헨 더 슨 최고 최대 장학금 받는 사람입니다.

모든 동물 실험 동물 윤리 위원회는 멜버른의 대학에 의해 승인 되었다.
참고: 있는 adenoviral에 대 한 순서, 건설 및 세대 프로토콜 벡터 p광고-CMV-Td-톰, p광고-CMV-GFP 와 p광고 CAGA12-뤽/Td-톰 이전 설명된11,12, 13. 모든 벡터를 상업적으로 사용할 수 있습니다.
1. 바...

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	<li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines.">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li><li>Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+import+function+of+Smad2+is+masked+by+SARA+and+unmasked+by+TGFbeta-dependent+phosphorylation.">The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+signaling+in+context.">TGFbeta signaling in context.</a> Nature reviews. 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C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li><li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+reagents+for+improved+in+vitro+and+in+vivo+examination+of+TGF-beta+signalling.">New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling.</a> Growth factors. 29, 211-218 (2011).</li><li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene.">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).</li><li>Luwor, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells:+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture.">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li><li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus.">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li><li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+with+modified+fibers+for+altering+viral+tropism.">Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism.</a> Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).</li><li>Wickham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer+by+adenovirus+vectors+containing+chimeric+fiber+proteins.">Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins.</a> Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).</li><li>Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling.">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388 (2014).</li></ol>

TGF-β/Smad3 단일 라이브 셀에 신호의 실시간 이미징에 대 한 수 있도록 기술을 개발 했습니다. 이 새로운 방법을 사용 하 여, 우리는 이전 확인 셀의 하위 인구 동적 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 향상 된 내 습 및 마이그레이션8에 연결. 이 방법은 Smad3 인 산화의 서쪽 오 점 등 TGF-β 신호에 대 한 전통적인 분석 실험에 개선 및 TGF-β는이 포착 하 여 유전자 발현을 대상 TGF-β/Smad3 종양 인...

변형 시키는 성장 인자 (TGF-β) β는 heterodimeric 유형 II의 구성 된 복잡 한을 통해 인간 발달에 연루는 필수적인 cytokine 이며 유형 I 수용 체1. 유형 II 수용 체에 바인딩 결과 신규 모집과 인 산화의 유형 내가 차례로 다운스트림 Smad2/3 단백질2,3phosphorylates 수용 체. 이 핵에 translocates 유전자 전사4규제 하는 복잡 한 형성 하 Smad4에 Smad2/3 단백질 바인딩 활성화. 항상성 조건 TGF-β/Smad 신호는 단단히 통제; 그러나, 많은 질병, 신호 통로 폐지 되 고 종종 overexpressed 질병5,,67의 진행 하는 최고의. 최근 연구는 TGF-β 세포 응답은 이기종 및 TGF-β/Smad 활성 세포의 부분 모집단은 시간에 따른 방식으로8,9생물 학적 기능에 대 한 책임을 증명 하고있다. 종종 평균 TGF-β/Smad 효과10을 quantitate만 세포 활동의 스냅샷을 제공 하는 고정된 끝점 분석 실험의 사용을 포함 하는 TGF-β/Smad 신호의 일반적인 세포 분석. 그러나이 방법,, 수 있습니다 정확 하 게 대표 하지 질병의 진행 하는 동안 생리 적인 상태에서 TGF-β/Smad 신호 분자 행동. 이미지 기반 라이브 셀 캡처 공간 및 시간 이해 세포 및 생물 학적 과정의 역동성의 분석.
우리의 목표는 TGF-β/Smad 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 신호의 라이브 셀 이미징에 대 한 중요 한 높은 처리 방법을 개발 했다. 여기, 우리 Smad3 CAGA 모티브 바인딩 시퀀스와 luciferase (루크) 또는 Td-토마토 (Td-톰) 리포터 유전자를 표현 하는 아 데 노비 루스 인간 유 방 암 세포 선 MDA-MB-231 감염. Adenoviral 기자 시스템 암 세포 라인에 100% 감염 속도에서 발생할 수 있는 플라스 미드 소개에 대 한 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 합니다. Adenoviral 기자 시스템은 또한 성공적으로 적용 되었습니다 기존의 플라스 미드11transfect 하기 어려운 셀 라인에. 이 프로토콜에서 TGFβ/Smad 신호 통로의 라이브 셀 이미징 달성을 재현할 수 및 비 침범 성 과정 설명 합니다 및 모두 에서 vivo에서 체 외.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1881024</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Scientifix Life</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td>Heat inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33258</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>5117</td>
			<td>Dilute in to PBS to make final concentration at 1 &#956;L/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Reporter Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>197897</td>
			<td>Dilute 5x in PBS before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>9100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast fluorescence microscopy</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGl Luciferin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Diltue to 0.05% (1x) in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E153A</td>
			<td>Dilute to 1x in DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R70507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRKDC-SCID</td>
			<td>Animal Resources Centre</td>
			<td>SCIDF6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chem-supply</td>
			<td>EA043-10L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Night Time</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>1750D</td>
			<td>Lubricating Eye Ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS-DMEM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% heat inactivated FBS; 10 &#956;g/mL penicillin; 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of the tgf-	&beta;/smad3 signaling pathway in vitro and in vivo using an adenovirus reporter system

성장 인자 (TGF-β) β 신호 변환 세포 항상성에 필요한 많은 중요 한 기능을 조절 하 고 암 등 많은 질병에 overexpressed 일반적으로 있다. TGF-β는 강하게 연루 전이에 늦게 단계 암 진행 동안 철새 및 침략 적인 종양 세포의 하위 집합을 활성화. 신호 경로 분석에 대 한 현재 메서드 끝점 모델, 종종 생물 학적 이벤트의 신호 포스트-임시 측정을 시도 하 고 질병의 진보적인 성격을 반영 하지 않습니다에 초점. 여기, 라이브 셀에 transcriptional 활성화를 검색할 수 있는 TGF-β/Smad3 신호 전달 경로 대 한 소설 아 데 노비 루스 기자 시스템 특정을 설명 합니다. 광고 CAGA12-Td-톰 기자를 활용 하 여, 우리 24 시간 시험관내의 MDA-MB-231 셀의 100% 감염 속도 얻을 수 있습니다. 형광 기자의 사용에 살아있는 단일 세포의 영상에 대 한 수 있습니다 transcriptionally 활성 셀의 직접 식별과 실시간. TGF-β와 감염 된 세포의 자극 transcriptionally 활성화 하 고 특정 한 생물학 기능에 관련 된 셀의 하위 집합만 표시 됩니다. 이 이렇게 높은 특이성 및 단일 세포 수준에서 감도 TGF-β 신호 vitro에관련 생물 학적 기능의 이해 향상을 수 있습니다. Smad3 transcriptional 활동 수도 있습니다 보고 vivo에서 에서 응용 프로그램을 통해 실시간으로 광고 CAGA12-루크 기자. 광고-CAGA12-루크 전통적인 안정적 transfected luciferase 셀 라인으로 동일한 방식으로 측정 될 수 있다. Vivo에서 이식 세포의 Smad3 transcriptional 활동 통해 기존의 IVIS 이미징 분석 하 고 종양 진행, TGF-β 신호 통로의 역학에 대 한 독특한 통찰력을 제공 하는 동안 라이브 모니터 수 있습니다. 우리의 프로토콜 설명 라이브 세포 신호 통로의 빠른 높은 처리량 이미징에 대 한 허용 하는 유리 기자 전달 시스템 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 메서드는 이미지를 기반으로 분석 및 기본 생물학 및 치료 개발에 대 한 과민 하 고 재현 가능한 방식으로 선물의 범위를 확장할 수 있습니다.

단일 세포 생체 외에서 이미징 라이브
정확 하 게 평가 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 단일 세포에서 TGF-β/Smad 신호의 활성화, 그것은 먼저는 최적의 다양성의 감염 (MOI) 각 셀 라인을 결정 하는 것이 중요. 최적의 나 셀의 100%는 아니 현재 cytopathic 또는 세포 독성 효과 adenoviral 감염에 대 한 긍정적인 결정 됩니다. ...

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Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

연구

암 연구학

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

Hippo 신호 Luciferase 기반 큰 종양 억제기 (라트) 바이오 센서를 사용 하 여 경로 활동 모니터링

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...