Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) a H-JZ. TMBW es un recipiente de un premio de postgrado Australia del gobierno australiano y la beca de Top-Up de Ann Henderson de Australian Health de Rotary en pareja con Rotary de Alicante y Cene una cura.

Todos los experimentos en animales fueron aprobados por la Universidad de Melbourne Comité de ética Animal.
Nota: El protocolo de secuencia, la construcción y la generación para el adenoviral vectores pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP y pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom se han descrito previamente11,12, 13. Los vectores están disponibles en el mercado.
<p class="jove_tit...

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells:+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture.">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li><li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus.">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li><li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. 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Hemos desarrollado una técnica para permitir la proyección de imagen en tiempo real de señalización de TGF-β/Smad3 en células vivas individuales. Mediante este novedoso método, previamente hemos identificado una subpoblación de células con actividad transcripcional del TGF-β/Smad3 dinámico que se asoció con mayor invasión y migración8. Este método mejora los análisis tradicionales de señalización de TGF-β, como manchas blancas /negras occidentales de fosforilación del Smad3 y T...

Factor de crecimiento de transformación β (TGF-β) es una citoquina fundamental implicado en el desarrollo humano que las señales a través de un complejo de tipo II heterodiméricos y tipo de receptores1. Unión a receptor II tipo resultados en el reclutamiento y la fosforilación del tipo I del receptor, que a su vez fosforila Smad2/3 aguas abajo proteínas de2,3. Estos activan bind Smad2/3 de proteínas a Smad4, formando un complejo que se transloca en el núcleo y regula la transcripción de gen4. Condiciones homeostáticas de TGF-β/Smad signaling es estrictamente regulado; sin embargo, en muchas enfermedades, la vía de señalización está desregulada y sobreexpresa con frecuencia conducen a la progresión de la enfermedad5,6,7. Estudios recientes han demostrado que la respuesta celular a TGF-β es heterogénea y subpoblaciones de células activadas TGF-β/Smad son responsables de la función biológica en una forma dependiente del tiempo8,9. Análisis celular común de señalización de TGF-β/Smad implica el uso de ensayos de punto final fijo que ofrecen sólo una instantánea de la actividad celular y con frecuencia cuantificar el promedio de efecto de TGF-β/Smad10. Estos métodos, sin embargo, pueden no exactamente representan el comportamiento molecular de señalización de TGF-β/Smad en el estado fisiológico durante la progresión de la enfermedad. Análisis basado en imágenes de células vivas capturar la dinámica de procesos celulares y biológicos con una comprensión espacial y temporal.
Nuestro objetivo fue desarrollar un método sensible de alto rendimiento para obtener imágenes de células vivas de TGF-β/Smad signaling reactivos basados en adenovirus. Aquí, estamos infectados por la línea de celular del cáncer de mama MDA-MB-231 con un adenovirus que expresan la secuencia de enlace de adorno de CAGA de Smad3 y luciferasa (Luc) o gen reportero de Td-tomate (Td-Tom). Adenoviral reportero sistemas proporcionan un método rápido y barato para la introducción de plásmidos que puede resultar en una tasa de infección del 100% en líneas celulares de cáncer. Sistemas de adenoviral reportero también se han aplicado con éxito a líneas celulares difíciles de transfectar con plásmido convencional11. En este protocolo se describe un proceso reproducible y no invasivo para obtener células vivas imágenes de la vía de señalización TGFβ/Smad tanto en vivo como en vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1881024</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Scientifix Life</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td>Heat inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33258</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>5117</td>
			<td>Dilute in to PBS to make final concentration at 1 &#956;L/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Reporter Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>197897</td>
			<td>Dilute 5x in PBS before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>9100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast fluorescence microscopy</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGl Luciferin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Diltue to 0.05% (1x) in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E153A</td>
			<td>Dilute to 1x in DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R70507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRKDC-SCID</td>
			<td>Animal Resources Centre</td>
			<td>SCIDF6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chem-supply</td>
			<td>EA043-10L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Night Time</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>1750D</td>
			<td>Lubricating Eye Ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS-DMEM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% heat inactivated FBS; 10 &#956;g/mL penicillin; 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of the tgf-	&beta;/smad3 signaling pathway in vitro and in vivo using an adenovirus reporter system

Transformación de Factor de crecimiento β (TGF-β) señalización regula muchas funciones importantes para la homeostasis celular y se encuentra comúnmente sobre expresa en muchas enfermedades, incluyendo cáncer. TGF-β está implicado fuertemente en metástasis durante la progresión del cáncer de etapa tardía, activando un subconjunto de las células del tumor invasivo y migratorias. Los métodos actuales de análisis de la vía de señalización se centran en modelos de punto final, que a menudo tratan de medir señales post-hoc del evento biológico y no reflejan la naturaleza progresiva de la enfermedad. Aquí, demostramos un adenovirus novela reportero sistema específico para la vía de señalización de TGF-β/Smad3 que puede detectar la activación transcripcional en células vivas. Utilizando un reportero Ad-CAGA12-Td-Tom , podemos lograr una tasa de infección del 100% de las células MDA-MB-231 dentro de 24 h in vitro. El uso de un reportero fluorescente permite la proyección de imagen de células vivas en tiempo real con identificación directa de las células transcripcionalmente activas. Estimulación de las células infectadas con TGF-β muestra sólo un subconjunto de las células que son transcripcionalmente activas y participan en funciones biológicas específicas. Este enfoque permite alta especificidad y sensibilidad a un nivel unicelular para mejorar la comprensión de las funciones biológicas relacionadas con TGF-β señalización en vitro. Smad3 actividad transcripcional puede ser también registrados en vivo en tiempo real a través de la aplicación de un Ad-CAGA12- Luc reportero. Ad-CAGA12- Luc puede medirse de la misma manera que las líneas celulares de luciferase estable transfected tradicional. Smad3 actividad transcripcional de las células implantadas en vivo se puede analizar a través de la proyección de imagen convencional de IVIS y seguimiento directo durante la progresión del tumor, proporcionando una visión única en la dinámica de la vía de señalización de TGF-β. Nuestro protocolo describe un sistema reportero ventajosa que permite proyección de imagen de alto rendimiento rápido de vías de señalización de células vivas in vitro e in vivo. Este método puede ser ampliado a una gama de análisis de imagen basado y presenta como un enfoque sensible y reproducible para la biología básica y desarrollo terapéutico.

Vivo sola célula en vitro
Evaluar con precisión la activación de TGF-β/Smad de señalización en las células adenovirus basado en reactivos, es importante primero determinar el óptimo multiplicidad de infección (Ministerio del interior) para cada línea celular. El Ministerio del interior óptima se determina cuando 100% de las células son positivas para infección adenoviral sin efectos citopáticos o citotóxicos...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of the TGF-	ÃŽÂ²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System at JoVE.com

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Proyección de imagen de células del TGF-β/Smad3 señalización vía In Vitro y In Vivo utilizando un Adenovirus reportero sistema en vivo

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes de células vivas de la actividad de señalización de TGF-β/Smad3 utilizando un adenovirus reportero sistema. Este sistema rastrea actividad transcripcional en tiempo real y puede ser aplicado a ambas células en vitro y en animales vivosmodelos.

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

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Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

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