Name: pancreatic islet embedding for paraffin sections
Uploaded: 2018-06-29T14:30:00
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Nous remercions le groupe de biologie cellules bêta au UMass Diabetes Center of Excellence pour discussions et conseils utiles. Des îlots pancréatiques humaines ont été fournis par le NIDDK-financé intégré îlot Distribution programme (IIDP) à la cité de l’espoir. Ce travail a été financé par le NIH/NIDDK : R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) et par l’American Diabetes Association subvention #1-15-BS-003 (LCA) en collaboration avec l’ordre de l’amarante.

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité de l’utilisation et de UMass Medical School institutionnels Animal Care. Études des îlots pancréatiques humains ont été déterminées par la Commission de révision institutionnelle UMass à ne sont ne pas admissibles à l’examen de la CISR ou exemption parce qu’ils n’impliquent pas l’utilisation de sujets humains.
1. culture et l’isolement de l’îlot
<ol><li>Isoler les îlots et séparer de...

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1.">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li><li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cell+block+processing:+The+Cell-Gel+method.">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li><li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

Cette méthode d’encastrement mis à jour le gel-disque-base fournit un simple, peu coûteux et un moyen efficace pour générer un rendement élevé des îlots par section. Construire la Couronne gel sur une surface de verre plat facilite l’épandage îlots dans une distribution uniforme sur une zone bien définie. Répandre les îlots dans un disque plat offre l’avantage de placer plusieurs îlots dans le plan de section, optimiser le rendement et permettant des îlots moins à utiliser. L’épaisseur du disque ...

Pancréas, îlots de Langerhans, la seule source d’insuline, en circulation sont un tissu de critique pour les chercheurs étudient le diabète sucré. De tout organisme donné, les îlots ont taille variable, la fréquence de type cellulaire et architecture1,2,3. La stratégie conventionnelle à l’étude in vivo de structure et la composition de la cellule endocrine des îlots pancréatiques est en sectionnant le pancréas tissus4,5. Puisque les îlots composent seulement une petite fraction du total contenu cellulaire pancréatique, études moléculaires sont effectuées sur les îlots isolés. Ex vivo îlot cultures expérimentales test réponse aux nutriments, modulation de gène (transfection, transduction), ou des traitements expérimentaux donnent un aperçu important des mécanismes modulant la fonction, la prolifération et la survie des cellules endocrines 5 , 6.
Ex vivo des expériences îlot sont souvent analysées à l’aide des études moléculaires des îlots entiers ou des études histologiques ou moléculaires dispersé des cellules des îlots cultivés en monocouche5,6. Analyse moléculaire des îlots entiers introduit la mise en garde sérieuse de mélanger types de cellules, qui peut produire des résultats faussement négatifs ou des faux positifs lorsque extrapolés à n’importe quel type de cellule individuelle. Dispersion de cellule sur lamelles couvre-objet pour la microscopie après culture permet la mesure des résultats de la cellule-type spécifique, mais perturbe l’architecture de l’îlot, qui peut-être altérer la réponse à l’intervention et s’oppose à une identification des résultats axés sur l’architecture. En outre, en général seulement un seul résultat peut être mesuré ; par exemple, pour mesurer la prolifération des cellules bêta et la mort des cellules bêta dans les mêmes conditions, deux expériences distinctes doivent être effectuées. Ces approches sont aussi aveugles à la variabilité inter-îlot, un domaine d’intérêt croissant dans le domaine. Tri des cellules des îlots par cytométrie de flux pour cellule-type spécifique études moléculaires, ou unicellulaires RNA sont élégantes mais cher, beaucoup de temps, limité par l’abondance de tissus, architecture-éradication et pas bien adapté aux analyses de routine cell culture 5 , 7. imagerie confocale des îlots entiers immunomarquage fournit des données intactes-architecture de qualité, mais il est beaucoup de travail, et les données obtenues à partir de chaque échantillon sont limitées aux résultats identifiables dans un seul immunostaining8.
La capacité de générer des sections de paraffine de haute qualité des îlots entiers après culture permettrait de résoudre nombre de ces préoccupations. Tissu de l’îlot de desserte à coût élevé, faible abondance de modèles génétiques uniques ou de donneurs d’organes humains, ou îlots statut post in vivo ou in vitro la manipulation expérimentale, sont précieux. Obtention de plusieurs sections de paraffine d’îlots mêmes permettrait plusieurs analyses de cellule-type spécifique, intact-architecture de la même expérience.
Les techniques existantes pour générer des pastilles de l’îlot pour le sectionnement sont imparfaits. Histologie-optimisé agarose est un gel aqueux bas point de fusion qui est employé couramment dans le traitement des spécimens cytologiques et histologiques, y compris des échantillons de tissus petit ou fragmentée qui sont difficiles à processus9. Un îlot enraciner approche consiste à suspendre les îlots dans l’agarose dans un tube de microcentrifuge, centrifuger pour le matériel de granule, récupérer la fiche de gélose, puis traiter et intégrer pour le sectionnement10,11. Extraire l’échantillon solidifiée par le bas du tube est longue et difficile, conduisant à une fragmentation occasionnelle de l’échantillon et risque de blessures corporelles. Les îlots sont concentrés dans la pointe de la fiche, conduisant à une répartition inadéquate îlot aux points obtenues par cette méthode. Le fond rond du bouchon complique incorporation telle qu’une région pauvre en îlot peut être présentée à la section. Dans l’ensemble, cette méthode conduit à faible rendement et de la distribution d’îlot contagieuse dans les sections qui en résulte.
Cette nouvelle méthode est une approche simplifiée et améliorée pour la préparation des sections de l’îlot. Îlots sont concentrées dans un petit volume et ensuite placées sur la surface lisse d’une lame de microscope pour former un petit disque, avec les îlots dans un seul plan. Le disque Histogel-îlot est traité par la suite pour incorporation dans un protocole de l’infiltration de xylène et déshydratation raccourcie de paraffine. L’approche précédente, qui concentre les îlots dans le fond d’un tube à centrifuger, est également réalisée en guise de comparaison. Cette nouvelle technique améliore le rendement des îlots par section, la répartition des îlots dans chaque section et prend moins de temps pour transférer les blocs de l’îlot à cassettes. Cette technique est utile pour les biologistes de l’îlot ou autres scientifiques qui étudient les petits morceaux de tissu souhaitent maximiser productif utilisent un tissu de faible abondance en mesurant les résultats multiples sur un seul échantillon dans son architecture native de tissu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Norgen Bioteck Corp</td>
			<td>P/N 10113&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin Classic Starter Kit</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin ClassicPipette PR-2</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (1000 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (200 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (20 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (10 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>949312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose blue beads- Affi-gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing cassette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M492-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Wraps</td>
			<td>Leica-Surgipath</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citadel 2000 tissue processor</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X5SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td>Finesse ME+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

Expériences utilisant des îlots pancréatiques isolés sont importantes pour la recherche sur le diabète, mais les îlots sont coûteux et d’abondance limitée. Îlots contiennent une population de cellules mixtes dans une architecture structurée ayant une incidence sur la fonction et îlots humains varient largement dans la composition de type cellulaire. Cours méthodes fréquemment utilisées pour étudier les îlots cultivés comprennent des études moléculaires effectuées des îlots entiers, mettre types de cellules d’îlot disparates ensemble, ou microscopie ou études moléculaires sur des cellules des îlots dispersés, perturbant l’architecture de l’îlot. Pour les études in vivo îlot, coupes de pancréas de paraffine est une technique puissante pour évaluer les résultats spécifiques des cellules dans l’environnement natif du pancréas. Étude après culture des îlots en paraffine sectionnant offrirait plusieurs avantages : détection des résultats multiples sur le mêmes îlots (peut-être même les îlots exact-même, à l’aide de coupes sériées), mesures de cellule-type spécifique et maintien native Îlot cellule-cellule et cellule-substrat interactions tant pendant l’exposition expérimentale et pour l’analyse. Cependant, les techniques existantes pour l’enrobage isolement îlots après culture sont inefficaces, votre temps, enclins à la perte de matière et produisent généralement des sections avec des nombres insuffisants îlot utile pour quantifier les résultats. Installations de préparation de pathologie clinique laboratoire cellule bloc sont inaccessibles et peu pratique pour les laboratoires de recherche fondamentale. Nous avons développé une méthode de paillasse améliorée et simplifiée qui génère des sections avec rendement robuste et distribution des îlots. Îlots fixes sont remises en suspension en gel d’agarose histologique chaud et distribués dans un disque plat sur une lame de verre standard, tels que les îlots sont distribuées dans un plan. Après déshydratation standard et d’incorporation, plusieurs (10 +) 4-5 µm sections peuvent être coupées à partir du même bloc de l’îlot. En utilisant cette méthode, les analyses histologiques et immunofluorescence sont possibles sur les souris, rat et îlots humains. Il s’agit d’une approche efficace, peu coûteuse, gain de temps pour évaluer le type-spécifiques des cellules intactes-architecture issues des îlots cultivés.

Un schéma illustré des étapes pour préparer la Couronne gel est illustré à la Figure 1. Ce résultats de méthode gel disque en sections de paraffine qui contiennent un nombre suffisant d’îlots répartis dans un seul plan pour permettre une quantification significative des résultats. La figure 2 montre des images de faible grossissement des sections qui en résulte pour illustrer le nombre d’îlots capturé par sectio...

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Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Des études ex vivo îlots pancréatiques sont importants pour la recherche sur le diabète. Les techniques existantes pour étudier des îlots cultivés dans leur architecture 3D natif sont chronophages, inefficace et rarement utilisés. Cet ouvrage décrit une méthode nouvelle, simple et efficace pour générer des sections de paraffine de haute qualité des îlots cultivés ensemble.

Îlots pancréatiques, enrobage pour les Sections de paraffine

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Isolement murin îlots pancréatiques

Recherche

Biologie

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochimie: coupes en paraffine utilisant le kit de Vectastain ABC Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

L&#39;immunohistochimie sur coupes en paraffine d&#39;épiderme de souris en utilisant des anticorps fluorescents

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d&#39;îlots humains

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Assistée par ordinateur à grande échelle de visualisation et quantification de la messe des îlots pancréatiques, distribution de taille et d&#39;architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...