Name: pancreatic islet embedding for paraffin sections
Uploaded: 2018-06-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections at JoVE.com

אנו להכיר בהכרת תודה הקבוצה ביולוגיה תאי בטא-תעודה מזויפת של אונ' סוכרת מרכז של מצוינות עבור עצות מועילות ודיונים. האדם לנגרהנס נמסרו על ידי NIDDK במימון משולב איון הפצה התוכנית (IIDP)-עיר של תקווה. עבודה זו מומן על ידי NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (חודשים), 2UC4DK098085 (IIDP), על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת תמלא #1-15-BS-003 (LCA) בשיתוף עם הסדר של ירבוז.

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי במסצ'וסטס הספר מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה. איון האנושי מחקרים נקבעו על ידי מועצת המנהלים לסקור מוסדיים במסצ'וסטס אינן מצריכות סקירה IRB או פטור משום שהם אינם כרוכים השימוש של בני אדם.
1. איון בידוד ותרבות
<ol><li>לבודד איונים, נ?...

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1.">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li><li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cell+block+processing:+The+Cell-Gel+method.">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li><li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

ששונה ג'ל-דיסק מבוסס ההטבעה שיטה זו מספקת פשוטה, זולה, דרך יעילה ליצירת תשואה גבוהה של איים קטנים לכל סעיף. בניית הדיסק ג'ל על משטח זכוכית שטוחה מקלה על איונים מתפשטת בריפודי כתופיים מעל אזור מוגדר היטב. להפיץ את איים בדיסק שטוח מציעה את היתרון של הצבת איים רבים במישור של מקטע, אופטימיזציה של...

הלבלב לנגרהנס, המקור הבלעדי של מחזורי אינסולין, הם רקמה קריטי לחוקרים הלומדים סוכרת. מכל יצור נתונה, איים קטנים יש גודל המשתנה תדירות סוג התא, אדריכלות1,2,3. האסטרטגיה קונבנציונאלי ללמוד ויוו מבנה והרכב האנדוקרינית תא לנגרהנס הוא על ידי חלוקתה4,של רקמת הלבלב5. מאז איונים מהווים רק חלק קטן הכולל תכנים סלולריים הלבלב, במחקרים מולקולריים מבוצעות על איים מבודדים. Ex-vivo איון תרבות ניסויים בדיקות בתגובה חומרים מזינים, ג'ין אפנון (תרביות תאים, התמרה חושית), או טיפולים ניסיוניים לספק חשוב תובנות מנגנוני הכוח ויסות הישרדות cell האנדוקרינית, התפשטות, ופועלים 5 , 6.
Ex-vivo איון ניסויים לעיתים קרובות הם ניתחו שימוש במחקרים מולקולריים של איים שלם או מחקרים היסטולוגית או מולקולרית של תאי איון התפזרו גדלו ב חד שכבתי5,6. אנליזה מולקולרית של איים קטנים כל מציג אזהרה חמורה של סוגי תאים intermixing, אשר עשויה לייצר תוצאות שווא-שלילי או חיובי-false כאשר אומדן לכל סוג של תא בודד. תא פיזור על coverslips עבור פוסט-תרבות מיקרוסקופיה מאפשר מדידה תוצאה ייחודיים לסוג התא, אך משבש איון אדריכלות, אשר עשוי לשנות את התגובה להתערבות, מונע זיהוי של תוצאות הקשורות אדריכלות. בנוסף, בדרך כלל רק תוצאה אחת ניתן למדוד; לדוגמה, כדי למדוד את התפשטות תאי בטא ומוות תאי בטא תחת באותם התנאים, שני ניסויים נפרדים צריך להתבצע. גישות אלה הם גם עיוור הבין-איון השתנות, שטח של עניין גובר בתחום. מיון תאי איון מאת cytometry זרימה במחקרים מולקולריים ייחודיים לסוג התא, או מחקרים RNA בתא יחיד הינם אלגנטיים אך יקר, זמן רב, מוגבלת על ידי רקמת שפע, ולחסל-אדריכלות, לא מתאימה כדי תא שגרתית תרבות ניתוחים 5 , 7. הדמיה קונאפוקלית של איים immunostained כולה-הר מספק נתונים שלם-אדריכלות באיכות גבוהה, אבל עמל רב, והנתונים שהתקבלו כל מדגם מוגבל לתוצאות לזיהוי יחיד immunostaining8.
היכולת לייצר באיכות גבוהה פרפין מקטעים של פוסט-תרבות איונים כל כתובת זו הרבה חששות אלה. עלות גבוהה, נמוך-שפע איון רקמות דגמים גנטיים ייחודיים או תורמי איברים אנושיים, או איים מצב פוסט vivo בתוך או במבחנה ניסיוני מניפולציה, יקרות. קבלת מספר מקטעים פרפין מ איונים באותו תאפשר ניתוחים ייחודיים לסוג התא, שלם-ארכיטקטורה מרובים מאותו הניסוי.
קיימות טכניקות ליצירת כדורי איון על חלוקתה מושלמים. Agarose הממוטבים היסטולוגיה היא ג'ל מימית נקודת התכה נמוכה נרחב המשמש לעיבוד היסטולוגית ו cytological דגימות כולל דגימות רקמה קטן או מפוצלים שקשה תהליך9. אחד איון הטמעת הגישה היא להשעות את איים קטנים ב- agarose בשפופרת microcentrifuge, צנטריפוגה הצניפה החומר, לאחזר את התקע אגר, ולאחר מכן לעבד, להטביע על חלוקתה10,11. חילוץ המדגם הקרושה מהחלק התחתון של הצינור הוא זמן רב וקשה, שמוביל מפעם לפעם פיצול של המדגם, הסיכון לפציעה. איים מרוכזים בקצה של התקע, שמוביל איון לקוי הפצה בסעיפים המתקבל בשיטה זו. בתחתית התקע עגול מסבך הטבעה כזאת אזור איון-עניים שיוצבו על חלוקתה. בסך הכל, שיטה זו מובילה תשואה נמוכה והפצה איון גושית בסעיפים וכתוצאה מכך.
שיטה חדשה זו היא גישה מפושטת ומשופרות עבור הכנת איון מקטעים. איים מרוכזים אמצעי אחסון קטן, ואז להניח אותה על פני חלקה של שקופית מיקרוסקופ כדי ליצור דיסק קטן, עם איים מטוס יחיד. הדיסק Histogel-איון לאחר מכן מעובד עבור פרפין הטבעה התייבשות מקוצר, קסילן הסתננות פרוטוקול. הגישה הקודמת, אשר מרכזת את איונים בחלק התחתון של צינור microfuge, מבוצעת גם לשם השוואה. טכניקה חדשה זו משפרת את התשואה של איים קטנים לכל סעיף, ההתפלגות של איים קטנים בכל מקטע, ולוקח פחות זמן כדי להעביר בלוקים איון קלטות. טכניקה זו שימושית לביולוגים איון או מדענים אחרים הלומדים חתיכות קטנות של רקמות המעוניינים למקסם פורה לשימוש טישו נמוך-שפע על ידי מדידת תוצאות מרובות על דוגמה אחת בארכיטקטורה רקמה מקורי שלו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Norgen Bioteck Corp</td>
			<td>P/N 10113&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin Classic Starter Kit</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin ClassicPipette PR-2</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (1000 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (200 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (20 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (10 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>949312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose blue beads- Affi-gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing cassette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M492-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Wraps</td>
			<td>Leica-Surgipath</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citadel 2000 tissue processor</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X5SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td>Finesse ME+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

ניסויים באמצעות איים מבודדים הלבלב חשובים למחקר בסוכרת, אך איונים הם יקרים השפע מוגבל. איונים מכילים אוכלוסיה לתא מעורב באדריכלות מובנית אשר משפיעה על תפקוד, איונים אנושי נרחב משתנה בקומפוזיציה סוג התא. שיטות נפוצות ללמוד איונים בתרבית כוללים מולקולרית מחקרים שבוצעו על כל איונים, מכלילה איון ובתחזוקה סוגי תאים ביחד, או מיקרוסקופ או במחקרים מולקולריים בתאי איון התפזרו, שיבוש איון אדריכלות. ללימודים ויוו איון, הלבלב פרפין-מוטבע חלוקתה היא טכניקה חזקה כדי להעריך את תוצאות ספציפיות תא בסביבת הלבלב מקורית. לימוד פוסט-תרבות איים על ידי חלוקתה פרפין, הייתי מציע מספר יתרונות: זיהוי של תוצאות מרובים על אותו איים קטנים (שעשויות להיות אפילו אותו ליתר דיוק איונים, באמצעות סעיפים טורי), מדידות ייחודיים לסוג התא, יליד לשמירה על איון תא התא, התא-תשתית אינטראקציות במהלך החשיפה ניסיוני והן לצורך ניתוח. עם זאת, קיימות טכניקות הטבעה מבודדים איונים פוסט-תרבות הן לא יעיל, זמן רב, נוטה אובדן של חומר, בדרך כלל לייצר סעיפים במספרים איון לא מספיק כדי להיות שימושי עבור לכימות תוצאות. הפתולוגיה הקלינית מעבדה התא בלוק הכנה מתקני הינם נגישים ולא מעשי עבור מעבדות מחקר בסיסי. פיתחנו שיטת ספסל-העליון משופרת, ההופך את יוצרת מקטעים עם תשואה חזקים והפצה של איים קטנים. איונים קבוע resuspended ב agarose היסטולוגית חמים ג'ל, pipetted לתוך דיסק שטוח על משטח זכוכית רגילה, כך איים מפוזרים במטוס. לאחר התייבשות רגילה, הטבעה, ניתן לחתוך (10 +) 4-5 מיקרומטר מקטעים מרובים מהגוש איון אותו. באמצעות שיטה זו, ניתן לבצע ניתוחים היסטולוגית ו immunofluorescent על עכבר, חולדה, איונים אנושי. זו גישה אפקטיבית, זולה, לחיסכון בזמן כדי להעריך מן איונים בתרבית תאים ייחודיים לסוג, שלם-אדריכלות התוצאות.

מפרטים טכניים מאויר של צעדים כדי להכין את הדיסק ג'ל מוצג באיור1. זה ג'ל דיסק בשיטה התוצאות בסעיפים פרפין המכילים מספר מספיק של איים מופץ במטוס בודד כדי לאפשר כימות משמעות של תוצאות. איור 2 מציג תמונות נמוך-הגדלה של הסעיפים שנוצר כדי להמחיש א?...

Watch this Scientific Journal Video about Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections at JoVE.com

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

הלבלב Murine איילט בידוד

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...