Name: pancreatic islet embedding for paraffin sections
Uploaded: 2018-06-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections at JoVE.com

Vi erkjenner takknemlig gruppen Beta-celle biologi ved UMass Diabetes Center of Excellence for nyttige råd og diskusjoner. Menneskelige bukspyttkjertelen holmer ble levert av den NIDDK-finansierte integrert Holme distribusjon Program (IIDP) på City of Hope. Dette arbeidet ble finansiert av NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) og ved American Diabetes Association gir #1-15-BS-003 (LCA) i samarbeid med rekkefølgen av Amaranth.

Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av UMass medisinsk skolen institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Menneskelige Holme studier ble fastsatt av UMass institusjonelle gjennomgang styret å ikke kvalifiserer IRB eller fritak fordi de ikke involverer bruk av mennesker.
1. Holme isolasjon og kultur
<ol><li>Isolere holmer og separat fra forurensende exocrine og ductal vev ved hjelp av metoden du velger. Merk: Denne metoden var optimalisert ved hjelp av holmer isolert av coll...

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1.">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li><li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cell+block+processing:+The+Cell-Gel+method.">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li><li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

Denne endrede gel-disk-baserte innebygging metoden gir en enkel, billig og effektiv måte å generere en høy avkastning av holmer per seksjon. Konstruere gel platen på en flat glassoverflate forenkler spre holmer i en jevn distribusjon over et godt definert område. Spre øyene en flat plate tilbyr fordelen av å plassere mange holmer i flyet delen, optimalisere ytelse og slik at færre holmer skal brukes. Platen tykkelsen kan justeres etter etterforskere behov. Siden flere inndelinger kan oppnås, kan seriell deler av...

Bukspyttkjertelen holmer Langerhans, den eneste kilden til sirkulerende insulin, er en kritisk vev for etterforskere studere diabetes mellitus. Fra noen gitt organisme har holmer variabel størrelse, celle type frekvens og arkitektur1,2,3. Den konvensjonelle strategien å studere i vivo struktur og endokrine celle sammensetning av bukspyttkjertelen holmer er ved snitting bukspyttkjertelen vev4,5. Siden holmer utgjør bare en brøkdel av bukspyttkjertelen mobilnettet innholdet, utføres molekylære studier på isolerte småøyer. Ex vivo Holme cellekulturer eksperimenter testing respons på næringsstoffer, gi gene modulering (hva, signaltransduksjon) eller eksperimentelle behandlinger viktig innsikt i mekanismer modulerende endokrine celle overlevelse, spredning og funksjon 5 , 6.
Ex vivo Holme eksperimenter er ofte analysert ved hjelp av molekylære studier av hele holmer eller histologiske eller molekylære studier av spredt Holme celler dyrket i monolayer5,6. Molekylær analyse av hele holmer introduserer den alvorlige påminnelse blander celletyper, som kan gi falsk negativt eller falske positive resultater når extrapolated til en enkelt celle type. Celle spredning på coverslips for post kultur mikroskopi tillater celle spesifikk utfallet måling, men forstyrrer Holme arkitektur, som kan endre svar til intervensjon og utelukker identifikasjon av arkitektur-relaterte resultater. Dessuten, kan vanligvis bare en enkelt utfall måles; for eksempel for å måle beta-celle spredning og beta-celledød under samme vilkår, må to separate forsøk utføres. Disse metodene er også blind for Inter Holme variasjon, et område av økende interesse i feltet. Sortering Holme celler av flowcytometri for celle spesifikk molekylære studier eller encellede RNA studier er elegant men dyre, tidkrevende, begrenset av vev overflod, arkitektur-utrydde, og ikke godt egnet til rutinemessig celle kulturanalyser 5 , 7. AC confocal imaging av hele-mount immunostained holmer gir høy kvalitet intakt-arkitektur data, men er arbeidsintensiv, og data fra hvert utvalg er begrenset til resultater identifiserbar i en enkelt immunostai-8.
Muligheten til å generere høy kvalitet parafinsnitt av etter kultur hele holmer ville ta mange av disse bekymringene. Høye kostnader, lav-overflod Holme vev fra unik genetisk modeller eller menneskelig orgel givere eller holmer status innlegg i vivo eller i vitro eksperimentelle manipulasjon, er dyrebare. Få flere parafinsnitt fra samme øyene ville tillate flere celle spesifikk, intakt-arkitektur analyser fra samme eksperiment.
Eksisterende teknikker for å generere Holme pellets snitting er ufullkomne. Histology-optimalisert agarose er en vandig lavt Smeltepunkt gel som er mye brukt i behandling av histologiske og fargemaskin prøver inkludert lite eller for fragmentert vevsprøver som er vanskelige å prosessen9. En Holme innebygging tilnærming er å suspendere øyene i agarose i et microcentrifuge rør, virvel å pellets materialet, hente agar pluggen, deretter behandle og legge til snitting10,11. Utdrager befestet prøven fra bunnen av røret er tid forbruker og vanskelig, fører til sporadisk fragmentering av prøven og risiko for personskader. Øyene er konsentrert i spissen av pluggen, fører til utilstrekkelig Holme distribusjon i delene fra denne metoden. Rundt bunnen av kompliserer innebygging slik at en Holme-fattig region kan bli presentert snitting. Total, denne metoden fører til lav avkastning og klumpet seg Holme fordelingen i de resulterende delene.
Denne nye metoden er en forenklet og forbedret tilnærming for utarbeidelse av Holme deler. Holmer er konsentrert i små og deretter plassert på glatte overflaten av en microscope skyve å danne en liten plate, med øyene et enkelt fly. Histogel-Holme platen behandles deretter for parafin innebygging i en forkortet dehydrering og xylen infiltrasjon protokollen. Den forrige fremgangsmåten, som konsentrerer øyene bunnen av et microfuge rør, utføres også som en sammenligning. Denne nye teknikken forbedrer avkastningen av holmer per seksjon, distribusjon av holmer i hver del, og tar mindre tid å overføre Holme blokkene til kassetter. Denne teknikken er nyttig for Holme biologer eller andre forskere studere små biter av vev som ønsker å maksimere produktiv bruk av en lav-overflod vev ved å måle flere resultater på en enkelt prøve i sin innfødt vev arkitektur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Norgen Bioteck Corp</td>
			<td>P/N 10113&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin Classic Starter Kit</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin ClassicPipette PR-2</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (1000 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (200 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (20 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (10 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>949312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose blue beads- Affi-gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing cassette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M492-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Wraps</td>
			<td>Leica-Surgipath</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citadel 2000 tissue processor</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X5SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td>Finesse ME+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

Eksperimenter ved hjelp av isolerte bukspyttkjertelen småøyer er viktig for diabetes forskning, men holmer er dyrt og begrensede overflod. Holmer inneholder en mikset-celle befolkningen i en strukturert arkitektur som påvirker funksjonen menneskelige holmer er mye variabel i celle type komposisjon. Gjeldende brukte metoder å studere kulturperler holmer inkluderer molekylære studier utført på hele holmer, lumping ulike Holme celletyper sammen, eller mikroskopi eller molekylære studier på spredt Holme celler, forstyrre Holme arkitektur. For i vivo Holme studier er parafin-embedded bukspyttkjertelen snitting en kraftfull teknikk for å vurdere celle-spesifikke resultater i sine opprinnelige bukspyttkjertelen omgivelser. Studere etter kultur holmer av parafin snitting vil gi flere fordeler: påvisning av flere resultater på samme holmer (potensielt også nøyaktig samme øyene, bruker serielle deler), celle-spesifikk målinger og opprettholde opprinnelig Holme celle-celle og celle-undergrunnen interaksjoner både under eksperimentelle eksponering og for analyse. Men isolerte eksisterende teknikker for innebygging holmer etter kultur er ineffektiv, tidkrevende, utsatt for tap av materiale, og generelt produsere deler med utilstrekkelig Holme tall å være nyttig for kvantifisere resultater. Klinisk patologi er laboratorium cellen blokk forberedelse utilgjengelig og upraktisk for grunnleggende forskningslaboratorier. Vi har utviklet en forbedret, forenklet benk toppen metoden som genererer seksjoner med robust avkastning og distribusjon av holmer. Fast holmer er resuspended i varme histologiske agarose gel og pipetted i en flat plate på en standard objektglass, slik at øyene er distribuert i et fly. Etter standard dehydrering og innebygging, kan 4-5 µm inndelingene (10 +) bli kuttet fra samme Holme blokk. Bruker denne metoden, kan histologiske og immunofluorescent analyser utføres på mus, rotte og menneskelige holmer. Dette er en effektiv, rimelig, tidsbesparende å vurdere celle spesifikk, intakt-arkitektur resultatene fra kulturperler holmer.

En illustrert skjematisk av trinnene for å klargjøre platen gel er vist i figur 1. Denne gel plate metoden resulterer i parafinsnitt som inneholder et tilstrekkelig antall holmer distribuert i et enkelt fly å tillate meningsfull kvantifisering av resultater. Figur 2 viser lav-forstørrelse bilder av de resulterende delene å illustrere antall holmer fanget per seksjon. Generelt > 35 holmer var synlig i hver inndeling når 250 ...

Watch this Scientific Journal Video about Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections at JoVE.com

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Ex vivo bukspyttkjertelen Holme studier er viktig for diabetes forskning. Eksisterende teknikker å studere kulturperler holmer i sin opprinnelige 3-dimensjonale arkitektur er tidkrevende, ineffektive og sjelden brukt. Dette verket beskriver en ny, enkel og effektiv metode for å generere høy kvalitet parafinsnitt av hele kulturperler holmer.

Bukspyttkjertelen Holme innebygging parafinsnitt

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

En metode for mus bukspyttkjertelens Isolering og Intracellulær cAMP Bestemmelse

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserte Real-time PCR tilnærminger for kvantitativ måling av microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...