Name: pancreatic islet embedding for paraffin sections
Uploaded: 2018-06-29T14:30:00
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Reconhecemos com gratidão o grupo de biologia de células Beta UMass Diabetes centro de excelência para as discussões e conselhos úteis. Ilhotas pancreáticas humanas foram fornecidas pelo NIDDK-financiado integrado ilhéu distribuição programa (IIDP) na cidade da esperança. Este trabalho foi financiado pelo NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) e pela Associação Americana de Diabetes conceder #1-15-BS-003 (LCA) em colaboração com a ordem do Amaranto.

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê de uso e UMass Medical School institucional Animal Care. Estudos de ilhota humana foram determinados pelo Conselho de revisão institucional de UMass não qualificar para revisão do IRB ou isenção porque não envolvem o uso de cobaias humanas.
1. cultura e isolamento ilhéu
<ol><li>Ilhotas de isolar e separar de contaminar o tecido exócrino e ductal, usando o método de sua escolha. Nota: Este método foi otimiza...

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1.">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li><li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cell+block+processing:+The+Cell-Gel+method.">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li><li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

Este método de encastre modificado baseados em gel-disco fornece um simples, barato e eficiente maneira de gerar um alto rendimento de ilhotas por seção. Construir o disco de gel sobre uma superfície plana de vidro facilita o espalhamento ilhotas em uma distribuição uniforme sobre uma área bem definida. Espalhar as ilhotas em um disco plano oferece a vantagem de colocar muitas ilhotas no plano da secção, otimizando o rendimento e permitindo menos ilhotas ser usado. A espessura do disco pode ser ajustada para ate...

Pancreáticas ilhotas de Langerhans, a única fonte de insulina, em circulação são um tecido crítico para os investigadores a estudar diabetes mellitus. De um determinado organismo, Ilhéus têm tamanho variável, frequência do tipo de célula e arquitetura1,2,3. A estratégia convencional para estudar na vivo estrutura e composição de células endócrinas das ilhotas pancreáticas é secionando pâncreas tecido4,5. Desde Ilhéus compõem apenas uma pequena fração do conteúdo total de celular do pâncreas, estudos moleculares são executados em ilhotas isoladas. Ex vivo ilhéu cultura experiências testando a resposta aos nutrientes, modulação de gene (transfeccao, transdução), ou tratamentos experimentais fornecem importantes insights sobre mecanismos de modulação da função, proliferação e sobrevivência de células endócrinas 5 , 6.
Ex vivo experimentos ilhéu frequentemente são analisados usando estudos moleculares de ilhotas inteira ou estudos histológicos ou moleculares das ilhotas dispersas células cultivadas em monocamada5,6. Análise molecular de ilhotas toda introduz a séria advertência entremear tipos de células, que podem produzir resultados falso-negativos ou falso-positivos quando extrapolados para qualquer tipo de célula individual. Dispersão de célula para lamínulas para microscopia de pós-cultura permite a medição de resultado de célula-tipo específico, mas interrompe a arquitetura do Ilhéu, que pode alterar a resposta à intervenção e impede a identificação dos resultados relacionados com arquitetura. Além disso, geralmente apenas um único resultado pode ser medido; por exemplo, para medir a proliferação de células beta e morte de células beta, nas mesmas condições, dois experimentos separados precisam ser executadas. Essas abordagens também são cegas à variabilidade inter ilhéu, uma área de interesse crescente no campo. Classificação células das ilhotas por citometria de fluxo para estudos moleculares de célula tipo-específicos, ou estudos de RNA de célula única são elegantes, mas caro, demorado, limitado pela abundância de tecido, erradicar a arquitetura e não é bem adequado para análises de cultura celular de rotina 5 , 7. imagem latente confocal de ilhotas immunostained toda a montagem fornece alta qualidade intacta-arquitetura dados, mas é trabalhoso, e dados obtidos de cada amostra são limitados aos resultados identificáveis em um único immunostaining8.
A capacidade de gerar seções de alta qualidade da parafina de ilhotas toda pós-cultura abordaria muitas dessas preocupações. Tecido de ilhéu de alto custo e baixa-abundância de modelos genéticos únicos ou de doadores de órgãos humanos, ou ilhotas status post vivo em ou em vitro experimental manipulação, são preciosos. Obtenção de várias seções de parafina de Ilhéus mesmos permitiria múltiplas análises específicas do tipo de célula, arquitetura intacta no mesmo experimento.
Técnicas existentes para gerar pelotas ilhéu para secionar são imperfeitas. Histologia-otimizado agarose é um gel aquoso baixo ponto de fusão que é amplamente utilizado no processamento de amostras histológicas e citológicas, incluindo amostras de tecido pequeno ou fragmentados que são difíceis de processo9. Um ilhéu, incorporando a abordagem é para suspender as ilhotas em agarose em um tubo de microcentrifugadora, centrifugar para o material de Pelotas, recuperar a ficha de agar, então processar e incorporar para secionar10,11. Extrair a amostra solidificada da parte inferior do tubo é demorado e difícil, levando a fragmentação ocasional da amostra e risco de danos pessoais. Os ilhéus concentram-se na ponta do plugue, levando a distribuição inadequada Ilhéu em seções obtidas por este método. O fundo redondo do plugue complica incorporando tais que uma região pobre em ilhéu possam ser apresentada para corte. Em geral, esse método leva ao baixo rendimento e distribuição ilhéu agrupados nas seções resultantes.
Este novo método é uma abordagem simplificada e melhorada para a preparação das seções do Ilhéu. Ilhotas são concentradas em um pequeno volume e então colocadas sobre a superfície lisa de uma lâmina de microscópio para formar um disco pequeno, com as ilhotas em um avião. O disco Histogel-ilhéu é processado posteriormente para incorporação em uma desidratação encurtada e protocolo de infiltração de xileno de parafina. A abordagem anterior, que concentra os ilhéus na parte inferior de um tubo de microcentrífuga, também é realizada como uma comparação. Essa nova técnica melhora o rendimento de ilhotas por seção, a distribuição das ilhotas em cada seção e leva menos tempo para transferir os blocos do Ilhéu para fitas. Essa técnica é útil para os biólogos ilhéu ou outros cientistas estudando pequenos pedaços de tecido que desejam maximizar produtivo usam de um baixa abundância tecido medindo vários resultados em uma única amostra em sua arquitetura de tecido nativo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Norgen Bioteck Corp</td>
			<td>P/N 10113&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin Classic Starter Kit</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin ClassicPipette PR-2</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (1000 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (200 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (20 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (10 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>949312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose blue beads- Affi-gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing cassette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M492-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Wraps</td>
			<td>Leica-Surgipath</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citadel 2000 tissue processor</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X5SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td>Finesse ME+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

Experimentos utilizando ilhotas pancreáticas isoladas são importantes para a pesquisa do diabetes, mas ilhéus são caros e de abundância limitada. Ilhéus contêm uma população mista de célula em uma arquitetura estruturada que afeta a função e ilhotas humanas são amplamente variável na composição do tipo de célula. Atuais métodos usados com frequência para estudar ilhotas cultivadas incluem estudos moleculares, executados em toda Ilhéus, amontoando ilhéu diferentes tipos de células juntos, ou microscopia ou estudos moleculares em células das ilhotas dispersas, rompendo a arquitetura do Ilhéu. Estudos em vivo ilhéu, seccionamento de pâncreas de parafina é uma técnica poderosa para avaliar resultados de células específicas no ambiente nativo do pâncreas. Estudando a pós-cultura ilhotas secionando parafina que oferecem várias vantagens: deteção de vários resultados na mesmas ilhotas (potencialmente até as exato a mesma ilhotas, usando seções seriais), medições específicas do tipo de célula e mantendo nativo Ilhéu célula-célula e célula-substrato interações durante a exposição experimental e para análise. No entanto, as técnicas existentes para a incorporação de isolaram ilhotas pós-cultura são ineficientes, demorado, propenso a perda de material e geralmente produzem seções com números ilhéu inadequada para ser útil para quantificar os resultados. Instalações da preparação do bloco de célula laboratoriais de patologia clínica são inacessíveis e impraticável para laboratórios de pesquisa básica. Nós desenvolvemos um método de bancada melhorado e simplificado que gera seções com rendimento robusto e distribuição de ilhotas. Fixo de Ilhéus é resuspended em gel de agarose histológica quente e pipetado em um disco plano em uma corrediça de vidro padrão, tal que os ilhéus são distribuídos em um avião. Após desidratação padrão e incorporando, seções múltiplas (10 +) 4-5 µm podem ser cortadas do mesmo bloco ilhéu. Usando esse método, análises histológicas e imunofluorescência podem ser executadas em rato, rato e ilhotas humanas. Esta é uma abordagem eficaz, barata, economia de tempo para avaliar resultados de célula tipo-específicas, intacto-arquitetura de ilhotas culturas.

Uma esquema ilustrada das etapas para preparar o gel de disco é mostrada na Figura 1. Este gel de disco método resulta em cortes de parafina que contêm um número suficiente de ilhotas distribuídas em um único plano para permitir significativa quantificação dos resultados. A Figura 2 mostra imagens de baixo-ampliação das seções resultantes para ilustrar o número de ilhotas capturado por seção. Em geral, > 35 Ilhéus...

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Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Isolamento Islet murino de pâncreas

Biologia

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Imuno-histoquímica: Seções de parafina Usando o Kit de Vectastain ABC Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Imuno-histoquímica em parafina da epiderme do rato utilizando anticorpos fluorescentes

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...