Name: pancreatic islet embedding for paraffin sections
Uploaded: 2018-06-29T14:30:00
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Agradecemos al grupo de Biología de la célula Beta en el UMass Diabetes centro de excelencia para el debate y consejos útiles. Islotes pancreáticos humanos fueron proporcionados por el NIDDK financiado integrado islote distribución programa (IIDP) en ciudad de la esperanza. Este trabajo fue financiado por NIH/NIDDK: R01-DK114686 (ACV), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) y por la Asociación de Diabetes Americana #1-15-BS-003 (ACV) en colaboración con la orden del amaranto.

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por la Comisión de uso y de UMass Medical School institucional Animal Care. Estudios del islote humano fueron determinados por la Junta de revisión institucional de UMass para no calificar para la revisión IRB o exención porque no implican el uso de sujetos humanos.
1. islote aislamiento y cultura
<ol><li>Islotes de aislar y separar contaminantes tejido exocrino y ductal mediante el método de su elección. Nota: Este m...

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

Este método de empotrar modificado basado en el disco de gel proporciona un simple, barato y la forma eficiente para generar un alto rendimiento de islotes por sección. Construyendo el disco gel sobre una superficie de vidrio plano facilita islotes que se separa en una distribución uniforme sobre un área bien definida. Difusión de los islotes en un disco plano ofrece la ventaja de colocar muchos islotes en el plano de la sección, optimizando el rendimiento y permitiendo menos islotes ser utilizado. El grueso del di...

Páncreas islotes de Langerhans, la única fuente de circulación de insulina, son un tejido crítico para los investigadores de diabetes mellitus. De cualquier organismo dado, islotes tienen tamaño variable, la frecuencia de célula tipo y arquitectura1,2,3. La estrategia convencional para estudiar en vivo la estructura y composición de células endocrinas de los islotes pancreáticos es dividiendo el páncreas tejido4,5. Desde islotes constituyen sólo una pequeña fracción del contenido celular pancreática total, se realizan estudios moleculares en islotes aislados. Ex vivo islote cultura experimentos pruebas de respuesta a nutrientes, modulación del gene (transfección, transducción de señales), o tratamientos experimentales proporcionan la penetración importante en mecanismos de modulación de la función, la proliferación y supervivencia de la célula endocrina 5 , 6.
A menudo los experimentos ex vivo del islote se analizan mediante estudios moleculares de islotes enteros o estudios histológicos o moleculares de células de los islotes dispersos en monocapa5,6. Análisis molecular de islotes todo presenta la seria advertencia de mezclantes tipos de células, que pueden producir resultados falsos negativos o falsos positivos cuando se extrapolan a cualquier tipo de célula individual. Dispersión de células sobre cubreobjetos para microscopia de la cultura permite la medida de resultado específicas de tipo celular, pero altera la arquitectura del islote, que puede alterar la respuesta a la intervención y excluye la identificación de los resultados relacionados con la arquitectura. Además, generalmente solamente un resultado solo puede ser medido; por ejemplo, para medir la proliferación de la célula beta y la muerte de la célula beta en las mismas condiciones, dos experimentos separados deban realizarse. Estos enfoques también son ciegos a la variabilidad inter-islote, un área de creciente interés en el campo. Clasificación las células del islote por citometría de flujo para estudios moleculares de la célula-tipo-específico, o estudios de RNA unicelulares son elegantes pero costoso, desperdiciador de tiempo, limitada por la abundancia de tejido, erradicación de arquitectura y no muy adecuado para análisis de rutina de la célula cultura 5 , 7. proyección de imagen confocal de islotes de Monte conjunto immunostained proporciona datos intacta arquitectura de alta calidad, pero es mano de obra, y datos obtenidos de cada muestra se limita a los resultados identificables en immunostaining solo8.
La capacidad para generar secciones de parafina de alta calidad de islotes todas cultura post abordará muchas de estas preocupaciones. Tejido del islote de alto costo, baja abundancia de modelos genéticos únicos o de los donantes de órganos humanos, o islotes estado post in vivo o in vitro manipulación experimental, son preciosos. Obtención de múltiples secciones de la parafina de los islotes mismo permitiría múltiples análisis específicos de tipo celular, intacta arquitectura desde el mismo experimento.
Técnicas existentes para generar pellets de islote para seccionamiento son imperfectas. Histología-optimizado de la agarosa es un gel acuoso bajo punto de fusión que es ampliamente utilizado en el procesamiento de muestras histológicas y citológicas, incluyendo muestras de tejidos pequeños o fragmentados que son difíciles de proceso9. Un islote inclusión enfoque es suspender los islotes en agarosa en un tubo de microcentrífuga, centrífuga para el material de la pelotilla, recuperar el tapón de agar, luego procesar y embed para seccionamiento10,11. Extracción de la muestra solidificada de la parte inferior del tubo es lento y difícil, lleva a la fragmentación ocasional de la muestra y el riesgo de lesiones personales. Los islotes están concentrados en la punta de la clavija, islote inadecuada distribución en secciones obtenidas por este método. El fondo redondo del enchufe complica incorporar tales que puede presentar una región pobre en islote de seccionamiento. En general, este método conduce a bajo rendimiento y distribución islote agrupada en las secciones resultantes.
Este nuevo método es un enfoque simplificado y mejorado para la preparación de las secciones del islote. Islotes son concentrados en un pequeño volumen y luego se coloca en la superficie lisa de un portaobjetos de microscopio para formar un pequeño disco, con los islotes en un solo plano. El disco de Histogel-islote es posteriormente procesado para parafina incrustar en una deshidratación acortada y Protocolo de infiltración de xileno. El anterior planteamiento, que concentra los islotes en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga, también se lleva a cabo como una comparación. Esta nueva técnica mejora el rendimiento de islotes por sección, la distribución de los islotes en cada sección y toma menos tiempo para transferir los bloques islote casetes. Esta técnica es útil para los biólogos de islote u otros científicos estudiando pequeñas porciones de tejido que deseen maximizar productividad usan de un tejido de baja abundancia mediante la medición de los resultados múltiples en una sola muestra en su arquitectura de tejido propio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Norgen Bioteck Corp</td>
			<td>P/N 10113&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin Classic Starter Kit</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin ClassicPipette PR-2</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (1000 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (200 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (20 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (10 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>949312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose blue beads- Affi-gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing cassette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M492-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Wraps</td>
			<td>Leica-Surgipath</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citadel 2000 tissue processor</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X5SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td>Finesse ME+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

Experimentos con islotes pancreáticos aislados son importantes para la investigación de la diabetes, pero islotes son costosos y de limitada abundancia. Islotes contienen una población de mezclado de la célula en una arquitectura estructurada que afecta a la función, e islotes humanos son ampliamente variables en la composición del tipo de célula. Métodos actuales utilizados para el estudio de islotes cultivados incluyen estudios moleculares realizados en islotes enteros, junten tipos de células de islote dispares juntos, o microscopía o estudios moleculares en células de los islotes dispersos, alterar la arquitectura de la isla. En vivo estudios de islote, secciones parafina-encajadas del páncreas es una técnica poderosa para evaluar los resultados de células específicas en el entorno nativo de páncreas. Estudiando la post-cultura islotes dividiendo el parafina ofrece varias ventajas: detección de múltiples resultados de mismo islotes (potencialmente incluso el mismo exacto islotes, mediante secciones seriadas), las medidas específicas del tipo celular y nativos manteniendo islote célula-célula y célula-sustrato interacciones durante la exposición experimental y de análisis. Sin embargo, técnicas existentes para incrustar aislaron islotes de cultura post son ineficientes, lentos, propensos a la pérdida de material y generalmente producen secciones con números islote inadecuada para ser útil para la cuantificación de los resultados. Patología clínica celular bloque preparación laboratorios son inaccesibles y poco práctico para los laboratorios de investigación básica. Hemos desarrollado un método de banco mejorado y simplificado que genera secciones con sólido rendimiento y distribución de los islotes. Islotes fijos son suspendidas en gel de agarosa histológica caliente y pipeta en un disco plano en un portaobjetos de vidrio estándar, tal que las islas se distribuyen en un plano. Después de deshidratación estándar e incrustación, (10 +) 4-5 μm las secciones múltiples se pueden cortar de la misma cuadra del islote. Usando este método, pueden realizarse análisis histológicos e inmunofluorescencia en ratón, rata e islotes humanos. Este es un enfoque eficaz, barato, ahorro de tiempo para evaluar los resultados específicos de tipo celular, intacta arquitectura de islotes cultivados.

Figura 1muestra un esquema ilustrado de los pasos para preparar el disco de gel. Este gel disco método los resultados en las secciones de la parafina que contienen un número suficiente de islotes distribuidos en un solo plano para permitir la cuantificación significativa de los resultados. Figura 2 muestra las imágenes de baja magnificación de las secciones resultantes para ilustrar el número de islotes capturados por secci...

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Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Ex vivo islote pancreático estudios son importantes para la investigación de la diabetes. Técnicas existentes para el estudio de islotes cultivados en su arquitectura original de 3 dimensiones son lentos, ineficientes y uso poco frecuente. Este trabajo describe un método nuevo, simple y eficiente para la generación de secciones de la parafina de alta calidad de todo cultos islotes.

Islote pancreático inclusión de secciones de la parafina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Páncreas murino aislamiento Islet

Investigación

Biología

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Inmunohistoquímica: las secciones de parafina utilizando la Vectastain ABC Kit de Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Inmunohistoquímica en secciones de parafina de la epidermis del ratón Utilizando anticuerpos fluorescentes

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Asistida por ordenador a gran escala de visualización y cuantificación de los islotes pancreáticos, distribución de tamaño y arquitectura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...